Download Definition of experimental and control groups E Grupo experimental

carolopez_85@yahoo.com.ar; lopez@ibr.gov.ar
Diseño experimental
Definition of experimental and
control groups
E
Grupo experimental: cepa Salmonella enterica Typhimurium 14028
silvestre, inducida con sulfato de cobre (CuSO4)
Grupo control: cepa Salmonella enterica Typhimurium 14028
silvestre, sin inducir con cobre.
Number in each group
E
Assay carried out by core or
investigator's laboratory
D
Authors’ contributions to qPCR
section
D
4 cultivos independientes de cada condición (4 réplicas biológicas
para cada grupo)
Muestra
Description
E
Pellet de células bacterianas
Volume or Mass of sample
D
25 ml de cultivo
Dissection Type
E
Processing Procedure
E
Los cultivos crecidos hasta fase estacionaria fueron diluidos 100
veces, a un volumen final de 25 ml. Se dejaron crecer hasta una OD
final de 0,6 y se agregó sulfato de cobre a una concentración final de
1mM, únicamente al grupo experimental. El shock con cobre es de
10 minutos; pasado este tiempo se enfría rápidamente el cultivo y se
alícuota 5 ml del mismo.
If frozen, how quickly?
E
Los 5 ml fraccionados de cada cultivo ensayado se colocan
rápidamente en hielo, se centrifuga en frío (3220 x g, 20 minutos,
4°C). El pellet se lisa con 500 uL de Trizol y se almacena.
Sample storage conditions
E
Los pellets obtenidos en el punto anterior se guardan a -80°C hasta
su procesamiento.
Extracción de ARN
Procedure and/or instrumentation
E
El ARN total se extrajo con TRIzol Reagent (Invitrogen) siguiendo
las especificaciones del fabricante. La homogeneización de 5ml de
las muestras se llevó a cabo con 500 ul de TRIzol Reagent. El ARN
purificado se disolvió en 40 ul de agua libre de ARNasas y se
almacenó a -70°C.
Las cantidades utilizadas del resto de los reactivos requeridos
(cloroformo, isopropanol y etanol 75%) se recalcularon para los
500 ul de Trizol utilizados.
Name of kit and details of any
modifications
E
Sources of additional reagents
used
D
Details of DNase treatment
E
Tratamiento con DNasa luego de la extracción de ARN. 1 ug of cada
ARN fue tratado con 1ul de DNasa RQ1 (Promega) en un volumen
final de 20 ul. La digestión del ADN se llevó a cabo durante 30
minutos, incubando a 37 °C. Luego de este tiempo, se agregó 1ul
de RQ1 DNasa Stop Solution (Promega), incubando a 65°C durante
10 minutos para la inactivación.
Contaminaion assessment of input
RNA
E
Se chequeó la ausencia de contaminación con ADN genómico
incluyendo un control negativo en la reacción de transcripción
reversa, que únicamente no cuenta con el agregado de la enzima
transcriptasa reversa.
Nucleic acid quantification
E
Medición de absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro.
Instrument and method of nucleic
acid quantification
E
Espectrofotómetro UV
Purity (A260/A280)
D
La pureza se determinó con la relación Absorbancia (260/280).
Todas las muestras alcanzaron valores esperados, superiores a 1,8.
Yield
D
El rendimiento se calculó como la cantidad de ARN obtenida por ml
de cultivo, las muestras alcanzaron valores comprendidos entre 4 y
5,2 ug/ml.
Integridad del ARN (método e
instrumento)
E
La integridad del ARN obtenido se chequeó por electroforesis en
gel de agarosa al 2%, visualizando las bandas 16 S y 23 S de ARN
ribosomal. Se utilizó el colorante Bromuro de Etidio.
TRIzol Reagent de Invitrogen.
La cantidad de ARN extraído en las condiciones del experimento,
células crecidas hasta una Absorbancia600nm de 0,6, es muy
pequeña y al momento de evaluar la integridad del ARN no
siempre se observan bien las bandas características de 16 S y 23 S.
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' E
transcripts
Inhibition testing
E
Curva estándar
Transcripción reversa
Complete reaction conditions
E
Transcripción reversa de ARN mensajero: 11 ul de ARN de la
mezcla anterior, tratada con DNasa, fueron incubados con 1 ul de
la Mix de dNTPs (10 mM cada uno) y random primers 240 ng. La
mezcla se calentó a 65 °C durante 5 minutos, luego se enfrío con
hielo por al menos 1 minuto. Posteriormente se adicionó 4 ul de
buffer first strand 5 X, 2 ul de DTT 0,1 M, 1 ul de RNasa OUT 40
U/ul (Invitrogen) y se incubó a 25°C por 10 minutos, seguidos de 2
minutos a 42 °C. Finalmente se adicionaron 0,5 ul SuperScript II
(Invitrogen), incubando a 42°C durante 50 minutos y luego a 70°C
por 15 minutos. Termociclador: Life Technologies (Invitogen).
Amount of RNA and reaction
volume
E
Volumen de reacción: 20 ul
Priming oligonuclotide and
concentration
E
Random primers
Reverse
transcriptase
concentration
and E
Temperature and time
E
Manufacturer of reagents and
catalog number
D
Cq with and without RT
D
Storage conditions of cDNA
D
SuperScript II (Invitrogen) 5 U/ul
Ver punto Complete reaction conditions
-20 °C
Información qPCR
Gene symbol
E
Gen de interés: scsA (suppression of copper sensitivity protein A);
Gen
de
referencia:
dehydrogenase)
gapA
(glyceraldehyde-3-phosphate
Accession number
E
Gen de interés: Gene ID: 11756829; gen de referencia: Gene ID:
11755204
Location of amplicon
D
Gen de interés: Locus tag: STM14_1266; gen de ref.: STM14_1565
Amplicon length
E
Gen de interés: 250 bp y gen de ref.: 245 bp
In silico specificity
E
NCBI Primer-BLAST
Homologs amplified
D
Sequence alignment
D
Secondary structure analysis of
amplicon
D
Location of each primer by exon or E
intron
Targeted splice variants
E
Oligonucleótidos qPCR
Primer sequences
E
scsA
Fwd:
ATGGCGAAACAACAACG,
GTAGACAAAGCGCAAGG.
scsA
Rv-250:
gapA (GAPDH) Fwd: ACTGACTGGTATGGCGTTCC, gapA Rv-245:
TCACGAAGTTGTCGTTCAGC.
RTPrimerDB identification number
D
Probe sequences
D
Location and identity of any
modifications
E
Sin modificaciones
Manufacturer of oligonucleotides
D
Invitrogen
Purification method
D
Desalado
Protocolo qPCR
Complete reaction conditions
E
Reaction volume and amount of
cDNA/DNA
E
Polymerase identity and
concentration
E
Exact chemical composition of the
buffer
D
Termociclador Real Time: MasterCycler (Eppendorf) usando SYBR Green
I (Invitrogen) en un volumen final de 20 ul.
Mix de reacción: 2 ul 10X PCR Buffer, 1 ul MgCl2 (50mM), 0,16 ul dNTPs
(100mM), 0,8 ul primer fwd y reverse (5 uM c/u), 0,15 ul Taq.
(Invitrogen) y 0,4 ul SYBR 10X. Se lleva a un volumen final de 15 ul con
agua. Se agregan 5 ul de cDNA diluido 1/40. Las reacciones de PCR se
iniciaron con 5 minutos a 95°C, seguido de 40 ciclos a 95°C por 15
segundos, 55°C por 30 segundos y 72°C por 40 segundos.
Todas las reacciones se hicieron por duplicado.
Volumen de reacción: 20 ul; concentración de cDNA: 5 ul de una dilución
1/40
Taq (Invitrogen)
Additives
E
SYBR® Green I Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen)
Manufacturer of plates/tubes and
catalog number
D
PCR Strip Tubes (PCR-0208-C) and PCR Strip Caps (PCR-2CP-RT-C),
Axygen
Complete thermocycling
parameters
E
95°C 15 min, 40 x (95°C 15 seg, 55°C anillado 30 seg, 72ºC 40 seg)
Reaction setup (manual/robotic)
D
Manual
Manufacturer of qPCR instrument
E
Eppendorf
Validación qPCR
Evidence of optimization (from
gradients)
D
Gradiente de temperatura de anillado de los primers (50-60 °C).
Specificity (gel, sequence, melt,
digest)
E
Gel de agarosa, Curva de disociación.
For SYBR Green I, Cq of the NTC
E
Una diferencia mayor a 8 Cq entre el negativo y las muestras.
Cq del NTC > 34 Cq
Calibration curves with slope and y
intercept
E
Curva estándar. gapA (gen de referencia): y = -3.6999x + 33.184; scsA
(gen de interés): -3.2621x + 35.334
PCR efficiency calculated from
slope
E
gapA (gen de referencia): 93,2%.
CIs for PCR efficiency or SE
D
r2 of calibration curve
E
>0,985.
Linear dynamic range
E
Determinado por la curva estándar, desde diluciones de cDNA de 1/10 a
1/800.
Cq variation at LOD
E
CIs throughout range
D
Evidence for LOD
E
If multiplex, efficiency and LOD of
each assay
E
scsA (gen de interés): 103,7%.
No applicable.
Análisis de datos
qPCR analysis program (source,
version)
E
RealPlex 2.0 (Eppendorf).
Method of Cq determination
E
El umbral es determinado por la segunda derivada.
Outlier identification and
disposition
E
No se descartaron Cq
Results for NTCs
E
Cq > 34
Justification of number and choice
of reference genes
E
Óptimo: al menos 2. Utilicé uno, gapA.
Description of normalization
method
E
Se normaliza utilizando el gen de referencia gapA. Se aplica el Método
comparativo CT (∆∆ct), teniendo en cuenta el cálculo de eficiencia de
amplificación.
Number and concordance of
biological replicates
D
Number and stage (reverse
transcription or qPCR) of technical
replicates
E
Repeatability (intraassay variation)
E
Reproducibility (interassay
variation, CV)
D
Power analysis
D
Statistical methods for results
significance
E
Student´s t Test o Mann-Whitney-U, de acuerdo al tipo de distribución
de los datos (normal o no).
Software (source, version)
E
Infostat
Cq or raw data submission with
RDML
D
Duplicados en RT y qPCR