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Diseño experimental
Definición de los grupos control y experimental
Número en cada grupo
Experimentales: plantas de Arabidopsis
thaliana tratadas con radiación UV-B.
Para los controles correspondientes al
tratamiento en ausencia de UV-B, se utilizaron
filtros plásticos para apantallar la radiación UVB proveniente de las mismas lámparas. Los
filtros utilizados fueron de poliéster (plástico de
poliéster claro de 100 μm), el cual absorbe la
radiación UV-B sin disminuir significativamente
las radiaciones UV-A o visible.
6
Muestra
Descripción
Procesamiento
Congelamiento
Condiciones de almacenamiento
Hojas
Recolección de las hojas y mortereo utilizando
nitrógeno líquido
Inmediato en nitrógeno líquido
Almacenamiento a -80° C
Extracción de ARN
Procedimiento
Tratamiento con DNasa
Verificación de la presencia de contaminantes
Cuantificación
Integridad del ARN
Retrotranscripción
Mortereo del tejido en nitrógeno líquido,
extracción con el método Trizol (Invitrogen).
50mg de hoja/ml de Trizol.
El tratamiento del ARN obtenido con ADNasa I
se llevó a cabo en un volumen final de 10 μl,
siguiendo las instrucciones del fabricante
(Promega). Se incubaron 2 μg de ARN total con
2 U de la enzima RQ1 ADNasa I durante 1 hora
a 37° C, en un buffer de reacción 1x
(suministrado por el fabricante de la enzima).
La enzima se inactivó con el agregado de 1 μl
de solución Stop provista por el fabricante a
65ºC 10 minutos.
Medición de absorbancia a 230nm y 280 nm
La concentración y la pureza del ARN de cada
muestra se determinaron mediante el sistema
Quanti-IT RNA assay kit (Invitrogen).
Chequeo en un gel de agarosa al 1 %
Condiciones de reacción
Cantidad de ARN y volumen de reacción
Oligonucleótido utilizado y concentración
Transcriptasa reversa y concentración
Tiempo y temperatura
La reacción de síntesis de la primera hebra de
ADNc se desarrolló en un volumen final de 20
μl. Se incubó un volumen equivalente a 2 μg de
ARN total tratado con ADNsa I (11 μl) con 1 μg
de oligo (dT) (2 μg/μl) en un volumen final de
12 μl y se colocó a 70°C durante 5 min.
Transcurrido ese tiempo, la mezcla se enfrió
rápidamente en hielo y se centrifugó
brevemente. Luego se añadieron los siguientes
componentes al tubo de reacción: buffer 1x
(suministrado por el fabricante de la enzima);
dNTPs a una concentración final de 0,1 mM, y
agua libre de ARNasas hasta completar un
volumen de 19 μl. Se incubó a 42°C durante 5
min y finalmente se adicionaron 200 U de la
transcriptasa reversa Superscript II (Invitrogen).
La reacción se llevó a cabo incubando la mezcla
a 42°C durante 2 horas y luego se inactivó la
transcriptasa reversa incubando los tubos
durante 15 min a 70°C. Posteriormente, las
muestras se almacenaron en freezer a -20 °C
hasta su utilización.
2 ug de ARN, volumen final de 20 ul
Oligo dT, concentración final 0,05 ug/ml
Superscript II (Invitrogen)
La mezcla final se incubó a 42°C durante 2 hs
Información del target de la qPCR
Gen
Número de acceso
Longitud del amplicón
Control de la especificidad in silico
Gen
Número de acceso
Longitud del amplicón
Control de la especificidad in silico
UVR2
AT1G12370.2
220
n-BLAST 2.2.8
CPK3
At4g23650
250
n-BLAST 2.2.8
Oligonucleótidos de la qPCR
Gen
Secuencia de los primers
UVR2
Uvr2 F-2
Uvr2 R-2
LP-CPK3C
CPK3
GACCCGAGTGGATATGTTGG
GAGCTGTTCTTCAGCTTTCC
CTTCTTGCTTTCACCCTTGG
Tm
(°C)
58
58
60
60
RP-CPK3D
TGGGAGTTGTCAGCGGTTGT
Protocolo de la qPCR
Condiciones de reacción
Volumen de reacción y cantidad de cDNA
Polimerasa utilizada y concentración
Aditivos
Parámetros del termociclado
Instrumento utilizado
Las reacciones se llevaron a cabo en un
volumen de 20 μl, y cada muestra se analizó
por triplicado. Para la amplificación se
utilizaron 1ul de una dilución 1/10 de ADNc, 3
mM MgCl2, 1x buffer libre de Mg
(proporcionado por el fabricante), 200 μM
dNTPs, 0,8 U Platinum Taq DNA Polymerase
(Invitrogen), 0.5x SyBr green (Molecular
Probes), 0,25 μM oligonucleótido reverso y
0,25 μM oligonucleótido directo.
Volumen final de 20ul, utilizando 1 ul de una
dilución 1/10 de los cDNA
Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen), 0,8
U
Sybr Green (Molecular Probes)
Desnaturalización previa: 95ºC durante 2 min;
Amplificación: 40 ciclos de las siguientes
etapas, 95ºC durante 10 s, 58ºC durante 30s,
72ºC durante 30 s, 80ºC durante 1 s donde se
realiza la lectura; Elongación final: 72ºC
durante 5 min; Curva de disociación: desde
65ºC hasta 95ºC (la lectura se realizó cada
0,5ºC).
Stratagene
Validación de la qPCR
Especificidad
Cq del control negativo
Eficiencia de la PCR (UVR2)
Chequeo in silico mediante la herrmamienta
NCBI-primerBlast, realización de la curva de
disociación.
>35 para todos los genes
2,091
r2 de la curva
Eficiencia de la PCR (CPK3)
0.985
1,937
r2 de la curva
Rango dinámico lineal
0.998
En promedio, ¼ a 1/400
Análisis de los datos
Programa de Análisis
Método de determinación de los Cq
Microsoft Excel
Software de Stratagene
Resultados de los NTCs
Justificación del número y elección de los genes
de referencia
Ningún NTC presentó amplificación
1 gen de referencia porque en la bibliografía
utilizaban este gen pero no se realizó ninguna
validación estricta
2exp-(ddCT)
3
Prueba t
Microsoft Excel
Método de normalización
Número de réplicas técnicas
Método estadístico para el análisis
Software