Download laboratorio 5

LABORATORIO 4 DE MICROBIOLOGÍA PARA FARMACIA
SECCIÓN A:
Demostración de Colonias y tinción de Gram:
A.1. Agar MacConkey:
Los ingredientes necesarios para este medio son los siguientes: sales biliares (medio
inhóspito para el crecimiento de bacterias Gram positivas), colorante cristal violeta (inhóspito
para cierto tipo de bacterias Gram-positivas), indicador rojo neutro (el cual vira si los
microorganismos fermenten la lactosa produciendo ácido láctico y acidificando el medio dando
color rosado a las colonias). En las ITU la más importante identificación es la de Escherichia coli.
Esta bacteria será el mejor ejemplo en la práctica de laboratorio. Al acidificar el medio, la tradición
dicta que al abrir un poco la placa de Petri en forma de rendija, donde ha crecido Escherichia coli el
ácido producido le da un olor característico a “tortillas fermentadas o viejas”. El resto de las
Enterobacterias no producen este olor característico. Muchos laboratoristas de la vieja escuela
usaban esta “prueba olfativa” para hacer el reporte del Urocultivo (o sea, sólo en las orinas) sin
tener que pasar por toda la batería de pruebas bioquímicas de identificación. Lógicamente, el
olfato debía estar muy acostumbrado al olor del ácido en el medio, y junto con el viraje del
indicador a rosado que tiñe las colonia, prácticamente aceleraban el diagnóstico bacteriológico.
Hoy en día se hace como parte de la verificación o para enseñar en los laboratorios de
microbiología, pero ya no sustituye el resto de las pruebas bioquímicas, pues se han encontrado
cepas sin olor y otras sin color, e identifican como Escherichia coli. En algunos casos, al abrir la
incubadora, el olor a tortillas viejas se nota a centímetros de la puerta.
Usos
Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo así las bacterias Gram-negativas que pueden
fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-).
LACTOSA (+)
Al
utilizar
la
lactosa
en
el
medio,
bacterias
Lac+
como:
Escherichia
coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual baja el pH a menos de 6,8 lo que tiene
como consecuencia la aparición de colonias de color rosadas o rojas.
LACTOSA (-)
Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en
su lugar, formando amoniaco, lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias incoloras.
1
A.2. Agar Manitol-Sal:
El Agar Manitol-Sal del inglés MSA (Mannitol salt agar) es un medio de cultivo que se utiliza
normalmente en bacteriología. Permite el crecimiento de un determinado grupo de bacterias
mientras que inhibe el crecimiento de otras. Este medio es importante en el laboratorio
clínico debido a que es capaz de distinguir a los microorganismos patógenos en un corto periodo
de tiempo. Contiene una alta concentración (~7.5%-10%) de sal (NaCl), haciéndolo selectivo
para Staphylococcus (y 'Micrococcaceae) debido a que el nivel de NaCl es inhibitorio para la
mayoría de las bacterias. Además es contiene manitol y un indicador de pH; rojo de fenol.
Los estafilococos coagulasa (+) producen colonias amarillas con zonas amarillas, mientras
que estafilococos coagulasa (-) produce colonias rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno
de color en el medio. Si un organismo es capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es
creado que hace que el rojo de fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de
colonias de Staphylococcus sospechosas de ser patógenas.
Puede observar el vídeo sobre siembra y aislamiento de bacterias en la dirección de YouTube:
https://www.youtube.com/watch?v=-TnHCd4sY24
A.3. Agar Sangre:
Es uno de los medios más ricos y tiene varias funciones:

En él crecen muchos microorganismos, inclusive hongos, por lo que se le conoce como
medio de recuperación, sobre todo cuando la muestra es poca.

A partir de él se pueden hacer repiques de muestras escasas una vez que el
microorganismo ha alcanzado niveles de crecimiento aceptables.

Es sumamente importante porque a partir de él tomamos el inóculo para la Prueba de
Sensibilidad a Antibióticos.

Nos da la guía necesaria para clasificar a los estreptococos en las tres categorías ya vistas
anteriormente y que son: β-hemolíticos, α-hemolíticos o no hemolíticos, y a partir de esa
clasificación, realizar otras pruebas bioquímicas hasta llegar a especie.
En la siguiente práctica, vamos a utilizar los tres medios anteriores, junto con el medio especial
llamado Müller-Hinton, que nos permite determinar, en caso de fallo terapéutico inicial empírico,
o en caso de resistencia múltiple, cuál es o son las segundas opciones que nos quedan para tratar
al paciente. El siguiente es el procedimiento:
1. En tubo de ensayo coloque solución salina y con asa bacteriológica con punta circular
esterilizada y tras 3 minutos de dejarla enfriar, tome un grumo de una o dos colonias de la
2
bacteria que va a ensayar, de tal forma que se vea ligeramente turbio colocando una hoja
escrita o rayada de un cuaderno; a esta solución con cierta turbiedad turbiedad ligera se le
conoce como Estándar de MacFarlandad 0.5, Si le queda muy turbio o muy acuoso casi
transparente vuelva a montar. No es idóneo poner más bacterias o poner más salina al
mismo tubo. Por eso, deseche y vuelva a hacerlo en nuevo tubo.
2. Con un aplicador estéril recién sacado del recipiente sellado, sumérjalo en el Estándar de
MacFarland, suba y baje por la solución y gírelo constantemente 1 o 2 minutos para que se
impregne de la solución bacteriana, y luego saque sin escurrir en las paredes del tubo de
ensayo. Aplique en toda la placa la solución preparada anteriormente. Luego gire la placa
en la misma dirección y hágalo dos veces más, cada vez empapando la superficie del
medio. Deje reposar uno o dos minutos.
3. Use 5 antibióticos colocando los sensidiscos respectivos, 4 alrededor de la circunferencia
de la placa espaciados para notar el halo de inhibición y el quinto en el centro, de tal
forma que la disposición sea lo más simétrica posible en la placa circular. Después de 24
horas, saque la placa de Müller-Hinton, debidamente rotulada para evitar confusiones, y
lea los diámetros de las zonas de inhibición. Recuerde que si el diámetro es mayor se
anota SENSIBLE, de lo contrario es RESISTENTE para el antibiótico en cuestión. No olvide
llevar las hojas que corresponden al método de Kirby-Bauer, ya que es el que va a definir si
el antibiótico ensayado es sensible, resistente o intermedio. El halo (que es la zona de la
placa alrededor del sensidisco en que no creció la bacteria incógnita) lo debe medir con
una regla milimetrada común y corriente. Vaya anotando: Nombre del antibiótico, y si dio
sensible, resistente o intermedio.
Como ejemplo de rayado en Müller-Hinton puede ver el vídeo en You Tube:
https://www.youtube.com/watch?v=Ja1Q6Y1W6Ec
SECCIÓN B:
B. TINCIIÓN DE GRAM:
Aunque el cultivo orienta acerca del tipo de bacteria con que nos enfrentamos, la tinción
de Gram nos da ojos frescos para introducir complementariamente el equipo automatizado o la
galería de pruebas bioquímicas, según el laboratorio del centro de salud en el que desempeñemos
nuestra labor.
Utilice un portaobjetos con 5 gotas de solución salina y abra una placa del cultivo de
cualquier colonia bacteriana llevada al laboratorio a las mesas de trabajo. Puede ver la diferencia
entre Cocos Gram-positivos (usando Manitol Sal) y Bacilos Gram-negativos (usando un
3
MacConkey). Con el asa bacteriológica estéril, toque sutilmente y rápido una colonia del cultivo.
Teóricamente, al tocarla es de vital importancia, para no sobrecargar de bacterias la salina
haciendo que la tinción no se tiña de forma homogénea, que no arrastre el asa llevándose un
grumo visible de bacterias. Simplemente baje el asa, toque la colonia, y saque el asa. Debe verse
apenas que tocó la colonia, no que arrastró el asa por el cultivo llevándose una “pelotita”.
Esta tinción diferencial permite dividir o separar las bacterias en dos grandes grupos: las
Gram-negativas y las Gram-positivas.
B.1. PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frotis delgado, tanslúcido y homogéneo de la muestra a estudiar, usando 3 gotas de
salina con muy poca muestra. Deje secar al aire. Pase el portaobjetos 2 segundos por llama.
2. Cúbralo con Cristal Violeta 1 minuto y luego lave con agua del tubo y escurra. Su función es ser
la verdadera tinción.
3. Cúbralo con lugol por 2 minutos y luego lave y escurra. El lugol es el mordente, y a mayor
grosor de péptidoglicano en la pared de las bacterias, mayor fuerza de retención del cristal violeta.
4. Decolore co alcohol-acetona de forma inclinada hasta que no aparezca color en el lavado.
Escurre y espere a que seque la lámina.
5. Aplique safranina en el extendido por 10 segundos y lave inmediatamente. Deje secar la lámina.
Véala en inmersión usando aceite respetivo. Haga un diagrama de todo lo que observa.
Para que pueda repasar el procedimiento puesto en práctico puede ver el vídeo en You Tube:
https://www.youtube.com/watch?v=FceD8FFhuew
CRONOGRAMA DE LA SEMANA
Esta práctica requiere formar grupos de estudiantes que puedan repartirse el trabajo, ya
que se necesitan personas que puedan, cada 24 horas, regresar al laboratorio hasta completar el
cultivo y la Prueba de Sensibilidad a los antibióticos. El siguiente es el cronograma que debe
seguirse, para que desde ya conformen grupos con estudiantes que tengan disponible al menos
una hora en la mañana o en la tarde, tres días seguidos, no importa que sean diferentes personas,
pero que realmente sean comprometidas con la siguiente distribución del tiempo, ya que por
ejemplo en la última parte (Prueba de Sensibilidad a Antibióticos) desde el momento en que se
monta, al momento en que se lee la Prueba deben pasar exactamente 24 horas en teoría. Eso lo
debe coordinar el grupo, con la o las personas responsables de esta lectura.
DÍA 1:
1. Conformen los grupos de trabajo. Pueden ser dos por mesa o la mesa completa,
recordando que todo el trabajo, desde el inicio hasta el final, recibe una nota equivalente
a la incógnita de la semana. Todos los integrantes recibirán la misma nota.
4
2. Cada grupo debe solicitar: una placa de Petri con Agar Sangre, otra de Agar MacConkey y
otra de Agar Manitol Sal.
3. En una hoja de papel, anótense todos los miembros del grupo y entréguenla al profesor o
encargado.
4. Una vez recibido el visto bueno, recibirá una placa de Petri incógnita ya cultivada.
5. Repique la incógnita dada por el profesor al grupo, a cada una de las tres placas, usando
un asa con punta en círculo debidamente esterilizada a la llama. En clase se explicará la
forma de hacer el repique con la técnica llamada Dilución por rayado en tres direcciones.
6. Rotule cada placa con marcador indeleble con las iniciales de los apellidos, fecha de
cultivo, y colóquelas en la incubadora. Puede usar tape adhesivo para apilar las tres placas
juntas de su grupo para prevenir que se esparzan o confundan con las de otros grupos.
7. De las placas que el profesor o encargado lleva de incógnito, realice las tinciones de Gram,
una de Agar MacConkey y otra de Agar Manitol Sal y dibuje o fotografíe lo visto al
microscopio.
DÍA 2:
1. Regrese al laboratorio (la persona del grupo escogida para este día) a las 24 horas o a las
48 horas y corrobore que la bacteria ya creció en el Agar Sangre.
2. Puede haber crecimiento también en MacConkey solamente, en Manitol Sal solamente o
en ambas.
3. Anote en forma de reporte, el nombre de los medios en los que hubo crecimiento, el color
de las colonias y si hubo o no viraje de los indicadores de cada medio.
4. De acuerdo con la teoría, discuta con otros miembros del grupo:
 ¿Hubo algún patrón hemolítico en el Agar Sangre?
 ¿Es la bacteria Lactosa Positiva o Lactosa Negativa, en caso de crecer en
MacConkey?
 Si es Lac +, ¿cuál es la bacteria más probable que ha crecido? Se puede ayudar
olfativamente con el olor a tortillas viejas. (No requerido pero es muy notorio).
 Si creció en Manitol Sal, ¿viró el indicador? ¿Es la colonia rosada o amarilla? ¿Cuál
es la posible bacteria que ha crecido?
 ¿Es una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa?
5. Anote las respuestas consensuadas del grupo en una hoja aparte y adjúntela al reporte
final.
6. De no haber crecimiento en ningún agar, o sólo en agar Sangre y en ninguno de los otros
dos, pudo haber hecho el repique del día 1 con el asa aún caliente ocasionando un choque
de calor a las bacterias provocando la muerte bacteriana instantánea, o bien porque
alguien manipuló la perilla de la temperatura de la incubadora y no se encuentra a 37-37.5
ºC.
7. En estos casos, vuelva a pedir las tres placas y vuelva a rayar usando asa esterilizada a la
llama, pero esta vez espere 3 minutos para que enfríe adecuadamente (no la sople, ni la
mueva, manténgala fija en una posición), o pídale a Kenneth que chequee la temperatura
de la incubadora. La incógnita usada en el día 1 quedará en incubación en caso de tenga
que volver a rayar.
8. Reincube los nuevos rayados y regrese al día siguiente, o sea, dé tiempo otras 24 horas
más para que crezca la bacteria y repita las actividades del día 2.
9. Solicite al encargado del laboratorio de ese día:
5






Tubos de ensayo
Asa bacteriológica con punta en círculo
Lámpara de alcohol
Aplicador de algodón estéril en recipiente sellado.
Salina estéril y jeringa para sacarla
Una placa de Müller-Hinton (Revise y pídale al encargado que
efectivamente sea la placa correcta, pues ha ocurrido que hacen esta
parte en medios de cultivo de hongos, que tiene el mismo color, aspecto, y
están revueltos con las de Müller-Hinton, y al final no les crece la bacteria.
Corrobore bien este punto)
10. Realice el montaje de la Prueba de Sensibilidad a Antibióticos, tal como se describe en la
sección A3 de este documento y tal como se explicó en clase. Escoja 5 de los antibióticos
que Kenneth mantiene en refrigeración y que se mencionan en las fotocopias del método
de Kirby-Bauer.
11. Vuelva a colocar en incubación la placa de Müller-Hinton con los antibióticos a ensayar,
placa rotulada con marcador, fecha de preparación, y ponga a incubar por 24 horas.
Recuerde anotar el nombre de cada antibiótico usado. La etiqueta dice el nombre: por
ejemplo la etiqueta del cilindro dice GENTAMICINA, pero el sensidisco trae las letras CN.
Por eso anote: Nombre real y abreviatura, y pase esta información al compañero que va a
hacer la interpretación el Día #3, para que no tarde buscando entre todos los tubos de
sensidiscos cuál era CN y los demás que el compañero del día 2 colocó en Müller-Hinton.
DÍA 3:
1. Saque la placa de Müller-Hinton que el compañero de su grupo preparó ayer a las exactas
24 horas y verifique que creció la bacteria.
2. De no haber crecimiento, repita el día 2, incube otras 24 horas y regrese al día siguiente.
3. No haber crecimiento no es la mismo que no haya habido halos de inhibición, es decir que
todos los antibióticos ensayados son RESISTENTES. La placa se ve limpia, como si no se
hubiera rayado, caso en el cual es necesario volver a montar la Prueba de Sensibilidad.
4. Use las fotocopias de Kirby-Bauer y una regla normal, y anote:
 Anote Nombre Real del antibiótico.
 Milímetros que mide el halo inhibitorio.
 A la par, anote SENSIBLE, RESISTENTE, INTERMEDIO, según las
dimensiones estandarizadas por Kirby-Bauer.
DÍA 4:
1. Elabore un reporte que contenga los resultados finales como:
 Las respuestas a las preguntas contestadas el día 2.
 El nombre de la posible bacteria identificada.
 Al menos 5 cuadros clínicos relacionados con la bacteria.
 Antibióticos probados, milímetros del halo de inhibición, y si cada uno de ellos
resultó SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE. Presente reporte el siguiente lunes
que vuelva a tener laboratorio el grupo al cual pertenece.
 Vuelvan a leer lo referente al Método Uri System Plus efectuado el 8 de febrero y
en la discusión refiérase a la comparación de ambas técnicas.
6
AUTOEVALUACIÓN DE LA UNIDAD
Selección única:
1. En el Agar MacConkey no crecen los Gram-positivos porque en este medio se
adicionan componentes que lo hacen inhóspito para dicho grupo de bacterias, tal
como:
A) lactosa
B) sales biliares
C) alta concentración de sal
D) amoníaco
2. El indicador de pH en el Agar MacConkey recibe el nombre de:
A) rojo de fenol
B) rojo neutro
C) azul de bromotimol
D) cristal violeta
3. Un ejemplo de bacteria lactosa-positiva es:
A) Proteus mirabilis
B) Salmonella typhi
C) Escherichia coli
D) Klebsiella pneumoniae
4. Una bacteria cultivada en Agar MacConkey que no utiliza lactosa como fuente de
energía, tiene a su disposición otro nutriente para metabolizarlo denominado:
A) manitol
B) urea
C) triptona
D) peptona
5. Un ejemplo de bacteria lactosa-negativa es:
A) Shigella dysenteriae
B) Klebsiella oxytoka
C) Escherichia coli
D) Enterococcus faecalis
7
6. En el caso de las bacterias lactosa-negativas sembradas en Agar MacConkey,
ocurre que:
A) al bajar el pH en el medio torna el color de las colonias a rosadas.
B) todo aumento del pH por encima de 6.8 torna el medio a amarillo.
C) se descartan como patógenos en cualquier sitio anatómico.
D) aumentan los compuestos amoniacales formando colonias incoloras.
7. El Agar Manitol Sal es un medio selectivo para el aislamiento de bacterias del
género:
A) Staphyloccocus
B) Enterobacter
C) Streptoccocus
D) Vibrio
8. El medio de Manitol Sal es de color ligeramente rosado. Las bacterias que pueden
colorearse con tono amarillo y zonas amarillentas en la zona de crecimiento son
conocidas como:
A) β-hemolíticas
B) Lactosa-positivas
C) Coagulasa-positivas
D) Coagulasa-negativas
9. De acuerdo con la teoría, las especies patógenas aisladas en Agar Manitol Sal:
A) pueden ser Gram-negativas
B) fermentan las peptonas y la lactosa por igual
C) siempre crecen en Agar Sangre
D) característicamente son las que más presentan resistencia a los antibióticos
10. Antes del montaje de un aislamiento bacteriano en el Agar Müller-Hinton, se debe
preparar lo que se conoce como:
A) Repique de la bacteria
B) Estándar de MacFarland 0.5
C) Prueba de la catalasa
D) Prueba de la oxidasa
8
RESPUESTAS: 1. B – 2. A – 3. C – 4. D – 5. A – 6. D – 7. A – 8. C – 9. C – 10. B
Calificación: números de aciertos x 10 = __________ x 10 = ___________ %
9