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CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE EMBRIONES BOVINOS
Fecha: 23-09-2012
Nombre y Apellido: Alfonso Serrano Estrada
1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de
embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una clasificación de
los embriones según:
a. Mórula (Estado 4)
b. Grado 1
c. Las blastómeras han formando una masa compacta y el embrión ocupa cerca del 60% del espacio perivitelino.
Es un embrión esférico, simétrico, con más del 85% de la masa celular intacta. Aunque posee una rotura en la
zona pelúcida sigue siendo de calidad Grado 1, pero no sería apto para exportación.
a. Blastocito Expandido (Estado 7)
b. Grado 2
c. La zona pelúcida se encuentra adelgazada, aproximadamente a 1/3 del tamaño original. Se observa presencia
de blastómeras sueltas o algunas células degeneradas. Posee entre el 50% y el 84% de la masa celular intacta.
a. Blastocito Temprano (Estado 5)
b. Grado 2
c. Es visible una cavidad con fluido (blastocele). El embrión ocupa cerca del 80% del espacio perivitelino. Se
diferencia notablemente el trofoblasto y el macizo celular interno. Aproximadamente el 80% de la masa celular se
encuentra intacta (presenta una porción de células degeneradas).
a. Blastocito Expandido (Estado 7)
b. Grado 1
c. Se observa claramente una diferencia entre el trofoblasto externo y el macizo celular interno (color más oscuro).
La zona pelúcida se encuentra adelgazada, aproximadamente 1/3 del grosor original. Aunque posee algunas
imperfecciones como presencia de pequeñas vesículas, estas no superan el 10% y por lo tanto se considera un
embrión muy bueno.
a. Mórula. (Estado 4)
b. Grado 2
c. Las blastómeras se han juntado formando una masa compacta y el embrión ocupa cerca del 70 % del espacio
perivitelino. Presenta un poco mas del 50% de la masa celular intacta. Es un embrión que presenta algunos
problemas más definidos, ya que se observan claramente algunas vesículas y células degeneradas.
a. Mórula (Estado 4)
b. Grado 2
c. Al igual que el ejemplo anterior, las blastómeras se han juntado formando una masa compacta y el embrión
ocupa cerca del 70 % del espacio perivitelino. Presenta cerca del 60% de la masa celular intacta. Es un embrión
que presenta algunos problemas más definidos, ya que se presenta blastómeras sueltas, vesiculaciones o algunas
células degeneradas.
a. Mórula (Estado 4)
b. Grado 3
c. Se observan problemas severos. Numerosas blastómeras sueltas, células degeneradas y de distinto tamaño.
Es un embrión de mala calidad ya que no posee más del 50% de células intactas.
a. Infertilizado (Estado 1)
b. Grado 4
c. Posee una apariencia granular (puntillado), rodeado por una membrana vitelina completamente lisa.
2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con etilenglicol
y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad, curva de
congelado, método de descongelado y practicidad (costos, entrenamiento, etc.).
Para realizar la comparación entre los dos métodos, me pareció adecuado presentarlo en un cuadro comparativo,
el cual muestra exactamente las diferencias existentes entre los métodos como las comprendí luego de terminar el
curso.
Congelado Tradicional
Vitrificación
Medios de Congelado
Glicerol, Etilenglicol
Mezclas de crioprotectores
como glicerol y etilenglicol,
glicerol y propanediol o
etilenglicol y propanediol en
combinación con sacarosa,
tetralosa o galactosa.
Toxicidad
En este caso se presentarían
problemas de toxicidad si no
se respetan los tiempos de
exposición a los
crioprotectores. Hay un
menor riesgo de toxicidad en
comparación con el método
de vitrificación debido a que
la concentración del
crioprotector es menor y por
lo tanto se tolera un poco mas
de exposición.
Se presentarían lesiones toxicas
como resultado del uso de altas
concentraciones de
crioprotectores.
Para disminuir el riesgo de
toxicidad se usan
crioprotectores de bajo peso
molecular (asociación de uno o
más crioprotectores), de baja
toxicidad, uso de volúmenes
mínimos, reducción de la
concentración y tiempos de
exposición mínimos.
Curva de Congelado
Curva de enfriamiento
controlada y gradual
Curva de enfriamiento más
rápida que con el congelado
tradicional, asociada con
concentraciones mayores de
crioprotectores.
Exposición de embriones a Tº
ambiente en crioprotector
hasta alcanzar equilibrio.
Exposición de embriones a Tº
ambiente durante 1 – 3 min en
solución de equilibrio. (10%
DMSO + 10% EG en PBSm)
Inducción de la formación de
cristales de hielo entre -5º C y
-7º C.
Pasar embriones a solución de
vitrificación cuyo volumen no
debe ser mayor a 5 Ul.
Descenso lento y controlado
de temperatura (0,3 - 1,0º
C/min hasta - 30º C o – 35º
C.
Depositar en tercera gota para
evitar aumento de volumen sin
sobrepasar 25 seg, entre las
dos gotas. (20% DMSO + 20%
EG en PBSm).
Colocar en OPS.
Congelado en Nitrógeno (N2)
a - 196º C.
Sumergir OPS en Nitrógeno
(N2) a - 196º C.
Método de Descongelado
Descongelamiento controlado
a alrededor 250º C/min. Baño
maría a 25º C.
Descongelamiento gradual a
través de exposición de OPS en
gotas de 0,25M de sacarosa.
Practicidad
Más práctico tanto en
laboratorio como en campo si
se tienen todos los elementos
necesarios y si se controlan
adecuadamente los tiempos
de exposición, congelado y
descongelado.
Incluye procedimientos que si
en los cuales no se tiene
conocimiento, practicidad o
experiencia, el método puede
llegar a ser mucho más
complejo que el congelado
tradicional.
Costos
Claramente resulta más
costoso si se tiene en cuenta
la inversión inicial de la
congeladora de embriones
que posee un alto precio.
Entrenamiento
Teniendo claro el
procedimiento y siguiendo el
protocolo de forma correcta,
creería que no se necesita
mayor entrenamiento para
realizar la técnica. Una vez
que se pone en práctica el
procedimiento se puede
aprender rápidamente y
repetirlo fácilmente.
Comparativamente, podría tener
un costo menor ya que en este
caso no se necesita ningún
elemento que controle el cambio
gradual de la temperatura, si no
que por el contrario, se congela
directamente a - 196º C.
Esta técnica, quizás requiere un
poco más de entrenamiento, ya
que se incluyen procedimientos
en los cuales hay que tener algo
de agilidad y precisión. En mi
caso personal, me pareció que
puede resultar bastante
complicado obtener buenos
resultados si no se tiene la
práctica necesaria para realizar
la técnica.
Conclusiones
En mi caso personal, he tenido algo de experiencia laboral en congelado de embriones de la forma tradicional. Por
lo tanto creo que se facilita mas trabajar con el congelado con etilenglicol que la con la vitrificación. Creo que la
vitrificación es una muy buena herramienta para disminuir los riesgos tanto de toxicidad como de daños al embrión
y permanecer fisiológicamente funcional, evitando la cristalización, pero como dije anteriormente, es
completamente necesario realizar bastante práctica para poder poner en práctica dicho método, y al mismo tiempo
es necesario comprender muy bien las funciones de cada elemento que interviene en este proceso para obtener
buenos resultados.