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AGROQUÍMICOS Y MEDIOS ACUÁTICOS. II.
INTERACCIONES ECOLÓGICAS Y EFECTOS
INDIRECTOS DEL GLIFOSATO SOBRE LOS ANFIBIOS.
Carlos Cabido, Ion Garin-Barrio y Carmen Martínez-Saura
Departamento de Herpetología
Sociedad de Ciencias Aranzadi
Diciembre de 2012
Cítese como: Cabido, C., Garin-Barrio, I., Martínez-Saura, C. 2012. Interacciones
ecológicas y efectos indirectos del glifosato sobre los anfibios. URA-Agencia
Vasca del Agua.
RESUMEN............................................................................................................... 2
LABURPENA........................................................................................................... 3
1
Antecedentes, justificación y objetivos .................................................................... 4
2
Metodología general ................................................................................................ 7
3
4
5
2.1
Determinación de las “dosis de ensayo” (concentraciones de
glifosato esperadas en pequeños medios acuáticos).............................. 7
2.2
Captura y mantenimiento de los especimenes experimentales. ............. 8
2.3
Cronograma............................................................................................11
Examen experimental de los efectos de las “dosis de ensayo” sobre el
crecimiento y duración del estadio larvario: diferencias entre especies y
productos comerciales (Objetivo 1). ...................................................................... 12
3.1
Metodología........................................................................................... 13
3.2
Resultados............................................................................................. 14
Examen experimental de los efectos de dosis subletales sobre la detección y
el escape de depredadores naturales en larvas de sapo partero (Alytes
obstetricans) (Objetivo 2)....................................................................................... 17
4.1
Metodología........................................................................................... 18
4.2
Resultados............................................................................................. 19
Examen experimental de los efectos de dosis subletales sobre la tolerancia
térmica en poblaciones amenazadas de sapo corredor (Bufo calamita)
(Objetivo 3). ........................................................................................................... 20
5.1
Metodología........................................................................................... 22
5.2
Resultados............................................................................................. 22
6
Discusión ............................................................................................................... 23
7
Conclusiones ......................................................................................................... 26
8
Referencias bibliográficas...................................................................................... 27
9
Personas participantes e implicación en el proyecto: ............................................ 32
10 Difusión de los resultados...................................................................................... 33
10.1 Comunicaciones en congresos: ............................................................ 33
10.2 Publicaciones científicas: ...................................................................... 34
10.3 Videos divulgativos:............................................................................... 34
1
RESUMEN
Con frecuencia, los charcos, abrevaderos o pequeños humedales que son adecuados
como hábitat para muchas especies de anfibios se encuentran en terrenos agrícolas o
en su proximidad, expuestos a todo tipo de contaminantes de origen agrícola. Entre los
más comunes se encuentra el glifosato. En una primera serie de estudios, se
obtuvieron los valores de las concentraciones de glifosato que generan un 50% de
mortalidad a las 96h con el objetivo de determinar qué especies de las presentes en la
CAPV y qué estadios de desarrollo larvario eran los más vulnerables. Sin embargo, las
condiciones en el campo son mucho más complejas y para poder hacer predicciones
de los perjuicios reales que el glifosato genera a las especies de anfibios es necesario
conocer mejor la interacción del pesticida con la ecología de éstos. Estudios recientes
indican que concentraciones muy por debajo de las letales pueden tener efectos que,
aunque no son aparentes, acaban reduciendo la probabilidad de supervivencia del
individuo afectado, resultando mortales a largo plazo. Esta “mortalidad diferida o
críptica” no tiene por qué ser provocada por el pesticida per se, sino que puede ser
producto de la sinergia de éste con otros factores. En esta segunda fase, se aborda el
examen de algunos de los posibles efectos secundarios que dosis subletales pueden
tener sobre distintos aspectos de la biología de las larvas de anuros y cómo esto
puede aumentar su vulnerabilidad ante otros factores o interaccionar con ellos para
producir una mayor mortalidad. Así, se ha examinado: 1) cómo los efectos de dosis de
ensayo (concentraciones de glifosato esperadas en pequeños humedales) de dos
productos comerciales con glifosato afectan al crecimiento del renacuajo, al tamaño
del metamórfico y a la duración del estadio larvario de una de las especies
aparentemente más resistente (la rana verde ibérica) y de la más vulnerable (el sapillo
moteado) al glifosato; 2) cómo afectan a la respuesta antidepredadora de las larvas de
sapo partero, y 3) cómo afectan a la tolerancia térmica de los renacuajos de sapo
corredor. Las consecuencias de estos efectos, que no causan mortalidad directa, son,
sin embargo, muy importantes para poder valorar correctamente la vulnerabilidad de
los anfibios a este tipo de agroquímicos, de uso cada vez más extendido.
Palabras clave: anfibios, herbicidas, agroquímicos, efectos subletales, mortalidad
críptica, sinergias, depredación, estrés térmico, conservación, Pelophylax perezi,
Pelodytes punctatus, Alytes obstetricans, Bufo calamita.
2
LABURPENA
Maiz, anfibio espezie askok erabiltzen dituen putzu, aska eta hezegune txikiak
nekazaritza lurretan kokatzen dira. Hori dela eta nekazal jatorria duten kutsatzaileak
jasateko arriskuan daude. Kutsatzaile arruntenetariko bat glifosatoa da. Euskal
Autonomia Erkidegoan bizi diren anfibio espezieen artean sentikorrenen zerrenda bat
egitea izan zen lehen helburua. Baita larba estadio sentikorrenak ezagutzea ere.
Horretarako
96h-ko
tartean
%50eko
heriotza-tasak
eragiten
dituen
glifosato
kontzentrazioak lortu genituen. Hala ere, landako baldintzak askoz konplexuagoak dira.
Glifosatoak eragiten dituen anfibioen gaineko kalteen iragarpen bat egin ahal izateko
pestizida eta animalien ekologiaren arteko elkarreraginak ezagutzea ezinbestekoa da.
Ikerketa berriek kontzentrazio hilgarrien azpitikoek ere ondorioak izan ditzaketela
adierazten dute. Ondorio hauek, nahiz eta antzemangarriak ez izan, indibiduoen
biziraupen probabilitatea murrizten dute, hilgarriak izanik epe luzean. “Atzeratutako
hilkortasun” edota “hilkortasun kriptiko” hau, ez du zertan pestizidek per se eragin
behar, pestizidaren eta beste faktore batzuen arteko sinergiaren produktu bat izan
daiteke. Bigarren fase batean hilgarrien azpitiko dosiek anuroen larben biologiaren
gaineko eraginak aztertu ditugu. Kontuan hartu behar da eragin honek faktore
desberdinekiko larben zaurgarritasuna emenda dezakeela edota haiekin interakzionatu
hilkortasun-tasa handiagoak sortaraziz. Modu honetan, hurrengoa aztertu da: 1)
glifosatodun bi produktu komertzialen froga-dosiek (urmael txikietan espero daitezkeen
glifosato kontzentrazioak) zapaburuen hazkuntzan, metamorfikoen tamainan eta larba
faseen iraupenean daukaten eragina. Horretarako, espezierik itxuraz erresistenteena
(igel berdea) eta zaurgarriena (apo pintatua) aztertu ziren; 2) txantxikuaren zapaburuen
erantzun antidepredatzailean duten eragina, eta 3) apo lasterkariaren zapaburuen
jasankortasun termikoan duten eragina. Hilkortasun zuzena sortzen ez duten dosi
hauen ondorioak oso garrantzitsuak dira geroz eta erabilera hedatuagoa duten
agrokimiko hauekiko anfibioen zaurgarritasuna aztertu ahal izateko.
Hitz gakoak: anfibioak, herbizida, agrokimikoak, hilkortasun azpitiko efektuak,
hilkortasun kriptikoa, sinergiak, harrapakaritza, estres termikoa, kontserbazioa,
Pelophylax perezi, Pelodytes punctatus, Alytes obstetricans, Bufo calamita.
3
1 Antecedentes, justificación y objetivos
Una de las principales causas de deterioro de los medios acuáticos es la
contaminación química provocada por vertidos industriales o agrícolas. Los
humedales, especialmente aquellos de pequeña entidad y situados en zonas
agrícolas, acaban concentrando gran parte de estos pesticidas y herbicidas. Entre los
más comunes se encuentra el glifosato, un herbicida de uso cada vez más extendido.
El glifosato es un herbicida de amplio espectro, no selectivo, utilizado para eliminar
malezas indeseables (pastos anuales y perennes, hierbas de hoja ancha y especies
leñosas). El producto es aplicado en forma líquida sobre las hojas, inyectado
en troncos y tallos, o rociado sobre tocones como herbicida forestal. En algunos
países, especialmente en Sudamérica, es fumigado desde avionetas sobre cultivos
extensivos o plantaciones ilegales. La aplicación de glifosato mata las plantas debido a
que suprime su capacidad de generar aminoácidos aromáticos. Por su no
especificidad se ha convertido en uno de los herbicidas más empleados por
agricultores, jardineros y gestores del medio natural, siendo utilizado, por ejemplo, en
la erradicación de plantas exóticas invasoras en proyectos dependientes de distintas
instituciones. Sin embargo, diversos estudios han demostrado que este herbicida tiene
efectos perjudiciales en numerosos grupos animales (Smith y Oehme 1992; Giesy et
al. 2000; Solomon y Thompson 2003).Un uso responsable del herbicida en el que se
respeten las dosis recomendadas y las condiciones de aplicación debería ser
suficiente para minimizar los riesgos de contaminación de los ecosistemas acuáticos.
Sin embargo, existe cierto riesgo y los humedales, hábitat reproductor de todas las
especies de anfibios, pueden ser contaminados por estos herbicidas por fumigación
directa o por escorrentía (Newton et al 1994).
Los anfibios constituyen, posiblemente, el grupo de vertebrados más
amenazado del mundo (Houlahan et al. 2000; Wake y Vredenburg 2008). Según las
últimas estimaciones de la UICN, un tercio de las especies descritas para el grupo
estarían en riesgo de extinción (Hoffmann et al. 2010). Se trata de un grupo de
animales que ha evolucionado para aprovechar los humedales de pequeña entidad e
incluso pequeños charcos temporales para el desarrollo de sus larvas. Con frecuencia,
estos charcos, abrevaderos o pequeños regatos que son adecuados como hábitat
para muchas especies se encuentran en terrenos agrícolas o en su proximidad,
expuestos a todo tipo de contaminantes de origen agrícola. Además, a pesar de la
elevada pluviosidad y la presencia de un elevado número de especies de anfibios, y
4
debido a su naturaleza parcialmente caliza de los suelos y a la abrupta orografía en la
Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV), estas charcas escasean. Por ello, y por
su estrecha dependencia de las condiciones fisicoquímicas del agua, los anfibios son
un grupo especialmente vulnerable a pesticidas como el glifosato (Beebee y
Griffiths 2005; Reylea 2005 a,b).
El efecto negativo del glifosato sobre los anfibios ha sido comprobado en
numerosos estudios llevados a cabo en Estados Unidos o Australia (Relyea 2005 b,c;
Relyea et al. 2005; Govindarajulu 2008; Relyea y Jones 2009). Sin embargo, la
vulnerabilidad de las especies presentes en la CAPV no ha sido examinada hasta el
pasado año. En una primera serie de estudios, el Departamento de Herpetología de la
Sociedad de Ciencias Aranzadi (SCA) obtuvo los valores de LC50 (concentraciones
que generan un 50% de mortalidad a las 96h) de agente activo (a.e.) para las larvas
de las principales especies de anuros presentes en la CAPV (Garin-Barrio et al. 2011;
Garin-Barrio 2012). Estos resultados, los primeros para especies de anfibios europeas,
muestran que todas las especies analizadas son vulnerables a concentraciones
inferiores a las de aplicación recomendadas por los fabricantes. El objetivo de estos
estudios, realizados en condiciones controladas de laboratorio, se restringía a
establecer las concentraciones letales de glifosato para las especies presentes en la
CAPV, para así poder determinar qué especies o estadios de desarrollo larvario son
los más vulnerables (Garin-Barrio et al. 2011; Garin-Barrio y Cabido 2012).
Sin embargo, las concentraciones con las que estos organismos se enfrentan
en el campo, exceptuando los casos de fumigación directa, dependerán de los
procesos de lavado y lixiviado. Además, las condiciones ecológicas son mucho más
complejas y para poder hacer predicciones de los efectos reales que el glifosato
genera a las especies de anfibios es necesario conocer mejor la interacción del
pesticida con la ecología de éstos. Por ejemplo, unas poblaciones pueden ser más
vulnerables que otras (Cabido et al. 2010, 2011), por lo que los valores de LC50
determinados para una especie sólo deben considerarse como orientativos. En
cualquier caso, es necesario no sólo conocer las concentraciones del producto que
producen
mortalidad
directa,
sino
también
los
efectos
que
producen
las
concentraciones presentes en los medios acuáticos naturales; aquellas con las que los
anfibios se enfrentan en condiciones naturales. Estudios recientes indican que
concentraciones inferiores a las letales pueden tener efectos que, aunque no
son aparentes, acaban reduciendo la probabilidad de supervivencia del
individuo afectado, resultando mortales a largo plazo (Relyea y Edwards 2010).
Esta “mortalidad diferida o críptica” no tiene por qué ser provocada por el pesticida
5
per se, sino que puede ser producto de la sinergia de éste con otras variables
naturales o de origen antrópico que afecten a la ecología de la especie en cuestión.
Por ejemplo, se han documentado sinergias con efectos sobre la supervivencia final de
las larvas de distintas especies entre pesticidas y el estrés generado naturalmente por
la competencia (Boone y Semlitsch 2001; Jones et al. 2011), la depredación (Boone y
Semlitsch 2001; Relyea 2005b) o el aumento de la temperatura (Boone y Bridges
1999). Del mismo modo, es previsible que el glifosato pueda generar un estrés
fisiológico que afecte a la velocidad de crecimiento de las larvas, al tamaño de
metamorfosis (Relyea 2004), a su comportamiento antidepredador o a su
vulnerabilidad ante choques térmicos, como ocurre con otros agroquímicos (Boone y
Bridges 1999).
El objetivo último de este proyecto es tener una visión más completa de los
efectos y consecuencias que el glifosato puede tener sobre las especies de anfibios de
la CAPV. En esta segunda fase, continuación del estudio iniciado en 2011, se aborda
el examen de algunos de los posibles efectos secundarios que dosis subletales
pueden tener sobre distintos aspectos de la biología de las larvas de anuros y cómo
esto puede aumentar su vulnerabilidad ante otros factores o interaccionar con ellos
para producir una mayor mortalidad. En la actualidad la información relativa a las
concentraciones residuales de glifosato en humedales de la CAPV es escasa e incluso
nula. La serie de datos obtenidos ex profeso para este proyecto han reflejado que se
dan niveles por debajo de los límites de cuantificación. En este estudio se han
escogido unas “dosis de ensayo” calculadas a partir de las concentraciones
encontradas en pequeños humedales canadienses (Govindarajulu 2008) y en función
de las concentraciones de uso recomendadas para Europa. Así, se plantea el estudio
de la interacción de estas dosis de ensayo sobre diversos aspectos importantes para
la supervivencia de estas especies: el crecimiento y duración del estadio larvario
(OBJETIVO 1); de su interacción con la presencia de depredadores (OBJETIVO 2), y
con la tolerancia térmica (OBJETIVO 3).
6
2 Metodología general
2.1 Determinación de las “dosis de ensayo” (concentraciones
de glifosato esperadas en pequeños medios acuáticos).
En un principio se planteó la determinación de las concentraciones de glifosato
esperadas en la CAPV a partir del análisis de las presentes en un número mínimo de
charcas (al menos 8) localizadas en áreas agrícolas. Así, se propuso la siguiente lista
de humedales, entre los que seleccionar aquellos en los que URA tomaría muestras
para su posterior análisis: lago de Arreo, Laguna de Olandina, humedal de Arkaute
(Salburua), humedal de Betoño (Salburua), laguna de Musco, charca de Telecocharra I
(Maeztu), charca de Telecocharra II (Maeztu), laguna de Navaridas, charca de Monreal
(Altube), cola del embalse de Ullibarri-Gamboa en Mendijur, cola del embalse de
Ullibarri-Gamboa en Garaio, La Paul (Laguardia), humedal de Maumea (Ilarraza),
charca en Ilarraza y humedal en Gaceo. En el limitado número de humedales en los
que se realizó análisis se dio como resultado valores por debajo del límite de
cuantificación. Este resultado puede interpretarse como satisfactorio en el sentido de
que no se constató contaminación por glifosato, aunque esto pudo ser debido a las
condiciones climatológicas, periodo de aplicación del herbicida, dilución y/o
degradación en el medio acuático. Pero a efectos del planteamiento inicial de este
proyecto hicieron imposible la inferencia de las concentraciones esperables en la
CAPV.
Dadas las circunstancias, se optó por la determinación de unas “dosis de
ensayo” extrapolando a partir de las obtenidas por parte de las autoridades
canadienses. Éstas han establecido sus “concentraciones ambientales esperadas”
(Expected Environmental Concentrations; Govindarajulu 2008) como aquellas que se
encontrarán en un cuerpo de agua de 15 cm de profundidad sobre el que se fumigue
directamente el herbicida a la distancia permitida. Así, 2.1 Kg/ha de glifosato (principio
activo) fumigado resulta en una concentración en aguas superficiales de 1,43 mg/l
(Edington et al. 2004, Wojtaszek et al. 2004). Conociendo estas equivalencias, a partir
de las mínimas y máximas concentraciones de producto recomendadas en España por
los respectivos fabricantes, pueden obtenerse las concentraciones de principio activo
(a.e.) esperadas para pequeños humedales, que serán a las que potencialmente se
expondrán los anfibios acuáticos (tabla 1). Estas dosis fueron las utilizadas como dosis
subletales en los experimentos planteados.
7
Tabla 1. Menor y mayor concentración de uso recomendada, sus aplicaciones y tipos de cultivos y la
concentración esperada de principio activo en aguas superficiales, obtenida según Edington et al. (2004) y
Wojtaszek et al. (2004), de los dos principales herbicidas con glifosato como principio activo.
Producto
Tipo de
cultivo
Uso
•
Herbáceas
•
Tragli®
Arbóreos
Herbáceas
y leñosas
Roundup®
Herbáceas,
leñosas,
márgenes
de cultivos
o acequias,
linderos y
pastizales
2.2 Captura
y
Concentración
recomendada
(litros de
producto/ha)
Concentración
recomendada
(Kg a.e./ha)
C. esperada
en aguas
superficiales
(mg a.e./l)
1,5
0,41
0,28
12
3,24
2,20
Malas hierbas
anuales.
En pre-siembra
del cultivo.
•
Malas hierbas
vivaces.
•
Aplicaciones
dirigidas.
•
Malas hierbas
anuales.
2,4
0,81
0,55
•
Malas hierbas
vivaces.
8
2,70
1,84
mantenimiento
de
los
especimenes
experimentales.
Durante la época de reproducción de cada especie (febrero a junio) se recorrió
el perímetro de distintos humedales en la CAPV con el fin de obtener las puestas de
las cuales obtener, a su vez, los renacuajos necesarios para los experimentos (figuras
1 y 2). En el caso del Bufo calamita, se capturaron ejemplares emparejados (en
“amplexo”) que fueron trasladados al laboratorio para obtener allí las correspondientes
puestas (en torno a diez por población; figura 1) siguiendo el protocolo de anteriores
estudios (Cabido et al. 2010, 2011). En el caso de Alytes obstetricans se capturaron
cuatro machos portando puestas en avanzado estado de desarrollo y se mantuvieron
en terrarios adecuados hasta que fueron depositadas en el agua y eclosionaron. Para
el resto de las especies, se recogieron puestas recientes en lugares donde la
abundancia de la especie era grande y existía un riesgo elevado de desecación de las
puestas y/o renacuajos (figura 3).
8
Figura 1. Localización de los enclaves de los que se obtuvieron muestras de las cuatro especies usadas
en los experimentos.
Figura 2. Charcas en las que se recogieron las puestas de Pelophylax perezi o Bufo calamita de baja
diversidad genética (Txingudi; izquierda) y de Pelodytes punctatus o B. calamita de alta diversidad
genética (Herramelluri; derecha).
Cada puesta se dispuso en un contenedor plástico de 20 litros con agua
declorada hasta que los renacuajos resultantes alcanzaron el estadio Gosner 25 de
desarrollo (Gosner 1960; figura 3), momento en el que pasaron a mantenerse
individualmente en contenedores plásticos de 750 ml de volumen, con 650 ml de agua
declorada (controles) o con la disolución de glifosato pertinente para cada grupo
experimental (figura 4). El agua se renovó semanalmente y los renacuajos fueron
alimentados diariamente ad libitum con pienso para conejos triturado.
9
Figura 3.Estadios de Gosner, desde huevo (esta-dio 1) hasta el estadio 25, momento en el que
comenzaron las pruebas experimentales.
Los renacuajos no usados en ningún experimento, así como aquellos
individuos (renacuajos o metamórficos) no expuestos a ningún herbicida, como es el
caso de los grupos control o aquellos sólo tratados con kairomonas de depredador,
fueron liberados en los lugares de recolección de las puestas o de captura de los
amplexos correspondientes sin que sufrieran ningún daño. Los animales expuestos a
herbicidas fueron sacrificados al término de los experimentos para evitar la liberación
de individuos debilitados en el medio.
Figura 4. Puesta de Bufo calamita (izquierda) y renacuajos en contenedores individuales para el examen
de los efectos de distintos tratamientos.
10
2.3 Cronograma.
FEB
MAR
ABR
MAY
Captura de amplexos y
recolección de puestas
Experimentos
crecimiento y
metamorfosis
Experimentos
depredación
Experimentos tolerancia
térmica
Análisis de datos y
redacción de la memoria
e informe
11
JUN
JUL
AGO
SEP
OCT
NOV
DIC
3 Examen experimental de los efectos de las “dosis de
ensayo” sobre el crecimiento y duración del estadio
larvario: diferencias entre especies y productos comerciales
(Objetivo 1).
Diversos estudios han mostrado que los pesticidas, en general, pueden afectar
negativamente al crecimiento y desarrollo larvario de los anfibios, aunque el
mecanismo que genera estos efectos aún se desconoce (Relyea y Mills 2001). Sin
embargo, muy pocos estudios han examinado el efecto que el glifosato tiene sobre
estos aspectos de la historia vital de los anfibios. En un estudio experimental en el
laboratorio, Edington y colaboradores (2004) mostraron como, tras 96 horas de
exposición a concentraciones de entre 1.4 y 3.3 mg a.e./l, el crecimiento de los
embriones de tres especies de anuros se veía perjudicado, aunque no el de una
cuarta. En otro estudio de laboratorio, concentraciones de 1.8 mg a.e./l reducían el
número de días hasta la metamorfosis en renacuajos de rana leopardo (Lithobates
pippens) y concentraciones de entre 0.6 y 1.8 mg a.e./l generaban tallas de
metamórficos menores (Howe et al. 2004). El tiempo hasta la metamorfosis es
importante ya que en condiciones de campo son precisamente los pequeños
humedales los que tienen más probabilidad de ser directamente fumigados con
herbicidas y son también los que presentan una temporalidad más marcada, con un
tiempo para el desarrollo de las larvas de por sí limitado. Por otra parte, una talla de
metamorfosis pequeña ha sido asociada con una menor tasa de supervivencia postmetamórfica en numerosos estudios (p. ej. Morey y Reznick 2001; Altwegg 2003), lo
cual es de vital importancia en la evolución de las dinámicas poblacionales (Biek et al.
2002; Vonesh y De la Cruz 2002).
Por lo tanto, la tasa de crecimiento, el tiempo hasta la metamorfosis o la talla
de los metamórficos son importantes y adecuadas variables a la hora de valorar los
posibles efectos subletales que las concentraciones de glifosato presentes en los
pequeños humedales pueden tener sobre los anfibios. Sin embargo, la mayor parte de
los trabajos que examinan estos fenómenos usan concentraciones de glifosato
constantes y superiores a las que los anfibios encuentran en el campo. Así, nos
planteamos examinar estos aspectos en términos más realistas, usando las
concentraciones esperadas en el campo vasco en función de las dosis recomendadas
por dos de las principales marcas de herbicidas basados en el glifosato (Tragli® y
12
Roundup®) y dejando que las disoluciones experimentales se degraden a lo largo del
experimento de forma similar a como ocurre en condiciones naturales.
3.1 Metodología
Como dosis de ensayo se usaron la concentración mínima y la máxima de cada
producto esperadas para aguas superficiales (tabla 1). Los efectos de estas dosis se
examinaron a lo largo del desarrollo larvario a partir del estadío Gosner 25 (los
estadios anteriores son menos sensibles al glifosato; Garin-Barrio et al. 2011; Howe et
al. 2004), por lo que se consideraron los valores de LC50 obtenidos para ese estadío
(Garin-Barrio et al. 2011; Garin-Barrio 2012; tabla 2), y se escogieron dos especies
diana: la especie más vulnerable de las analizadas, el sapillo moteado (Pelodytes
punctatus) y la rana verde ibérica (Pelophylax perezi), la segunda especie en cuanto a
resistencia al glifosato y que, además, recientes estudios señalan como una especie
especialmente resistente a la contaminación (García-Muñoz et al. 2010). El sapo
partero (Alytes obstetricans), a pesar de ser la especie más resistente de las
analizadas, no se incluyó en el experimento debido a su larga permanencia en el agua
(más de un año, en algunas ocasiones), que impediría examinar el efecto del glifosato
sobre la duración de la fase acuática en un plazo de tiempo razonable.
Una vez obtenidas la mayor y menor de las concentraciones esperadas para
ambos productos, se preparó el volumen necesario de las cuatro disoluciones
experimentales para realizar un cambio de agua semanal a todos los renacuajos
experimentales, hasta la octava semana. Así, las disoluciones se prepararon al
principio del experimento y se mantuvieron en depósitos de los que se tomaba agua
para hacer los cambios semanalmente hasta que, a partir de los 40 días, pasaron a
hacerse con agua declorada (a partir de este momento, el glifosato ya no tiene ningún
efecto sobre los renacuajos; Martínez-Saura, Garin-Barrio y Cabido, datos sin
publicar). Por lo tanto, la concentración de a.e. no se mantuvo constante, sino que se
permitió la degradación de cada disolución a lo largo del experimento, de forma similar
a como ocurre en el campo. Siguiendo el mismo protocolo se mantuvo un depósito con
agua declorada para los cambios del grupo control.
A los 15, 30 y 60 días de exposición de los renacuajos se les tomaron
fotografías laterales (figura 5) para la posterior medida mediante el software ImageJ
(Davis et al. 2008). Finalmente, se tomó la talla de metamorfosis con un calibre y se
anotó la duración de la fase acuática de cada individuo.
13
Tabla 2. Valores de LC50 (mg a.e./l) a las 96 horas para las especies y estadios Gosner analizados en
Garin-Barrio et al. (2011) y Garin-Barrio (2012). Cada réplica está realizada con renacuajos procedentes
de una puesta distinta. En negrita se han destacado las especies más y menos vulnerables, así como sus
valores de LC50. (*) Los renacuajos de A. obstetricans eclosionan en estadío 24, por lo que no pueden
obtenerse valores para el estadío 19.
Especie
Bufo bufo
Bufo calamita
Alytes obstetricans
Pelodytes punctatus
Pelophylax perezi
Rana dalmatina
Rana temporaria
Estadio Gosner
19
25
19
25
19
25
19
25
19
25
19
25
19
25
Media ( + error estándar) mg a.e./l
17,58 (17,08-18,07)
15,27 (14,73-15,81)
13,90 (13,32-14,47)
12,02 (11,40-12,64)
*
19,27 (17,74-20,80)
12,39 (11,73-13,06)
8,94 (8,23-9,66)
20,07 (19,49-20,64)
15,30 (14,68-15,92)
17,55 (16,94-18,15)
14,55 (13,90-15,19)
12,66 (11,96-13,37)
14,15 (13,40-14,91)
Nº de réplicas
16
16
12
12
-12
9
9
12
12
11
11
8
8
Figura 5. Renacuajo de sapillo moteado (Pelodytes punctatus) fotografiado para su posterior medida.
3.2 Resultados.
Al analizar el crecimiento de los grupos de renacuajos de rana verde
expuestos a las distintas concentraciones se observaron diferencias significativas
entre ellos y con respecto al grupo control [ANOVA de medidas repetidas, interacción
entre tiempo (1/2 mes; 1 mes; 2 meses) y tratamiento (control; Tragli 0.28 mg a.e./l;
Tragli 2.21 mg a.e./l; Roundup 0.55 mg a.e./l, y Roundup 1.84 mg a.e./l), F6,146=10.3;
p<0.0001; figura 6]. Sin embargo, sólo se observan diferencias a los dos meses, de
14
forma que los renacuajos del grupo control han crecido en torno a 2 mm más que el
grupo expuesto a 1.84 mg a.e./l de Roundup®, 1.8 mm más que el expuesto a 0.55 mg
a.e./l de Roundup® y 0.8 mm más que el expuesto a 2.21 mg a.e./l de Tragli® (Test de
Tukey, p<0.001 en todos los casos); con respecto al grupo expuesto a 0.28 mg a.e./l
de Tragli®, no se observan diferencias transcurridos dos meses, como tampoco se
observan anteriormente entre ningún grupo (Test de Tuckey, p>0.08 en todos los
casos). En cuanto a la talla de los metamórficos y la duración de la fase larvaria, no se
encontraron diferencias significativas.
En el caso de lo renacuajos de sapillo moteado, el 80 % de los expuestos a la
concentración obtenida a partir de la dosis más alta de las recomendadas para el uso
de Roundup® (1.84 a.e. mg/l) murieron antes de las dos semanas, por lo que ese
grupo no fue incluido en los análisis de crecimiento.
1,0
0,9
Crecimiento (mm)
0,8
0,7
Control
Tragli (0.28 mg/L)
Tragli (2.21 mg/L)
Roundup (0.55 mg/L)
Roundup (1.84 mg/L)
F
8,146 =10.3;
p<0.0001
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1/2 mes
1 mes (raíz)
2 meses (raíz)
Figura 6. Medias y errores estándar del crecimiento de los distintos grupos experimentales de renacuajos
de Pelophylax perezi sometidos a las dosis subletales de Tragli® y Roundup® esperadas en aguas
superficiales.
En cuanto a los grupos expuestos al resto de concentraciones, el análisis de los
datos muestra que existen diferencias significativas entre ellos y con respecto al grupo
control (ANOVA de medidas repetidas, interacción entre tiempo y tratamiento,
F6,84=8.7; p<0.001; figura 7). Así, aunque no se observan diferencias transcurridas dos
semanas, sí que se observan en las siguientes medidas.
15
3,0
2,5
Control
Tragli (0.28 mg/L)
Tragli (2.21 mg/L)
Roundup (0,55mg/L)
Crecimiento (mm)
F6, 84 = 8.7, p < 0.001
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1/2 mes
1 mes
2 meses
Figura 7. Medias y errores estándar del crecimiento de los distintos grupos experimentales de renacuajos
de Pelodytes punctatus sometidos a las dosis subletales de Tragli® y Roundup® esperadas en aguas
superficiales.
Al cabo de un mes, los renacuajos expuestos a Roundup® crecieron
significativamente menos que los del grupo control (en torno a 0.4 mm menos; Test de
Tukey, p=0.02). A los dos meses, todos los renacuajos excepto los expuestos a la
dosis más baja de Tragli® (0.28 mg a.e./l) crecieron significativamente menos que los
del grupo control (p < 0.01, todos los casos). Es decir, los renacuajos expuestos a la
concentración más baja de Tragli® crecieron en torno a 0.26 mm menos; los expuestos
a la más elevada, 0.5 mm menos, y finalmente, los expuestos a Roundup, crecieron
0.85 mm menos.
Al analizar la talla con la que se metamorfosearon, se observaron diferencias
significativas en función del grupo (F3,32 =3.5; p=0.02; figura 8): los del grupo control
habían crecido casi un milímetro más que los tratados con Roundup® (Tukey test,
p=0.02). No se observaron diferencias entre el resto (p>0.08 en todos los casos).
Finalmente, también se observan diferencias entre grupos en la duración del
periodo larvario hasta la metamorfosis (F3,32 =18.3; p<0.001; figura 8): los renacuajos
de sapillo moteado mantenidos en la concentración más alta de Tragli® tardaron en
completar la metamorfosis alrededor de 10 días más; los mantenidos en la más baja
de Roundup® 20 días más que el grupo control (Test de Tukey, p<0.01 y p<0.001,
respectivamente). No se observaron diferencias significativas entre el resto de los
grupos y el control (p>0.08 en todos los casos).
16
Figura 8. Talla de los metamórficos (en naranja) y tiempo hasta completar la metamorfosis (en verde) de
los renacuajos de sapillo moteado sometidos a los distintos tratamientos (Tragli 1: 0.28 mg a.e./l; Tragli 2:
2.21 mg a.e./l; Roundup: 0.55 mg a.e./l).
4 Examen experimental de los efectos de dosis subletales
sobre la detección y el escape de depredadores naturales
en larvas de sapo partero (Alytes obstetricans) (Objetivo 2).
Los depredadores son una importante fuerza de selección en sistemas naturales
que genera la evolución de defensas antidepredadoras, tanto morfológicas como
comportamentales, por parte de las especies presa. Las larvas de anfibios son muy
vulnerables a la depredación, pero numerosos estudios muestran que aquellas
especies que han coexistido con una especie depredadora durante largo tiempo son
capaces de reconocer y responder a estímulos de ésta de forma innata, ajustando su
respuesta antidepredadora en función del riesgo (p. ej. Kats et al. 1988; Sih y Kats
1994; Lardner 2000; Relyea 2001). Un componente importante del comportamiento
antidepredador es, por lo tanto, la capacidad de detectar y reconocer depredadores
(Lima y Dill, 1990) y, en especies acuáticas, esto a menudo depende del
reconocimiento de sustancias químicas informativas (Kats y Dill, 1998). Éstas pueden
provenir de los propios depredadores (kairomonas) o de la presas (sustancias de
estrés o alarma; Chivers y Smith 1998; Kats y Dill 1998; Gonzalo et al. 2010) y sirven
como un indicador confiable e inminente de riesgo. La detección de señales
informativas que indiquen un aumento del riesgo de ser depredado puede dar lugar a
modificaciones en el ciclo vital, la morfología o el comportamiento (Lima y Dill 1990;
Kats y Dill 1998; Lima 1998; Thomas et al. 2006). Una vez el riesgo de depredación es
17
determinado por la presa, la consecuente respuesta (comportamiento de alarma o
antidepredador) es específica y adaptada a la estrategia del depredador (Relyea 2001;
2004), pudiendo incluir la reducción de actividad, comportamientos de huida,
alteraciones en el uso de diferentes microhábitats, búsqueda de refugios, evitación de
determinadas áreas o agrupación en colonias (Kats et al. 1988; Skelly y Werner 1990;
Kiesecker et al.1996; Kiesecker y Blaustein 1997; Relyea 2004; Apfelbach et al. 2005;
Richter-Boix et al. 2007; Lamprecht et al. 2008). Sin embargo, estas respuestas
también suponen costes (menor tasa de alimentación o desarrollo, tiempos de
metamorfosis más largos, etc.) que reducen la probabilidad de supervivencia a largo
plazo. Dosis subletales de glifosato -al afectar tanto a la percepción de señales de los
depredadores, como a la condición corporal, metabolismo o crecimiento- podrían
alterar estos delicados “compromisos” provocando maladaptación y, a la postre,
mortalidad críptica. En este contexto, nos planteamos el examen de los efectos que
dosis subletales tienen sobre la capacidad para detectar señales de depredadores de
los renacuajos de sapo partero y cómo la exposición simultánea a glifosato (que
genera un estrés “artificial”) y a esas señales (que generan un estrés “natural”) afecta
a su crecimiento.
4.1 Metodología.
Para determinar los efectos del glifosato en la detección de depredadores, se
expuso individualmente a larvas de sapo partero naïve durante 20 días a una dosis
subletal de Tragli® (6.4 mg a.e/l, 1/3 del valor de LC50 para esta especie; ver tabla 2;
grupo experimental: N= 64) o bien se mantuvieron en idénticas condiciones en agua
limpia (grupo control: N= 64). A los 20 días se realizaron las pruebas experimentales,
en las cuales se grabó en video el comportamiento de los renacuajos durante 10
minutos, previa (actividad basal) y posteriormente (respuesta antidepredadora) a la
adición de 10 ml de agua limpia (estímulo ‘control’) o de la misma cantidad de agua
procedente de un contenedor con 650 ml de agua en el que una larva de libélula (Anax
imperator) había permanecido durante una semana (estímulo ‘kairomonas’). Una
reducción de la actividad nadadora de los renacuajos implicaría una detección de la
presencia del depredador (ver Kiesecker et al. 1996; Gonzalo et al. 2010).
Para el estudio de los efectos de la sinergia entre el glifosato y el estrés
derivado de la presencia de depredadores, se examinó el crecimiento y el desarrollo
de un grupo de renacuajos mantenidos durante 40 días en agua limpia (N= 32), en
agua con kairomonas de libélula (N= 28), con una concentración subletal de glifosato
(N= 31) o con ambos, glifosato y kairomonas (N= 30). Se realizaron dos fotografías
18
siguiendo la metodología ya descrita, a los 20 y a los 40 días de exposición.
Posteriormente se midió longitud total, longitud de la cabeza y longitud de la cola de
los renacuajos, usándose la diferencia entre la segunda y la primera medida para
determinar el crecimiento total o de cada estructura corporal (cabeza y cola).
4.2 Resultados.
Los renacuajos de sapo partero sometidos a dosis subletales de Tragli®, se
comportaron (medido como tiempo moviéndose) de forma diferente con respecto al
grupo control (ANOVA de medidas repetidas; F1,124=53.46; p<0.0001) y en función del
estímulo (agua vs. kairomonas; F1,124=9.22; p<0.01). Así, en primer lugar, se observa
que los renacuajos del grupo experimental presentan, en general, menor tasa de
actividad antes de ser expuestos a las kairomonas (F1,124=10.15; p=0.001; Test de
Tuckey, p<0.03 en todos los casos) y, además, ante la exposición al estímulo del
depredador reducen más la actividad que los del grupo control (interacción entre la
medida repetida del “tiempo moviéndose” x estímulo x tratamiento: F1,124=4.37; p<0.03;
figura 9).
14
Tiempo moviéndose (raíz cuadrada)
F1, 124=4.37; p=0.03
12
10
8
6
4
2
0
Estímulo: kairomonas
Control: agua
Pre-estímulo
Post-estímulo
Grupo control
Pre-estímulo
Post-estímulo
Glifosato
Figura 9. Porcentaje de tiempo (media + 95%) que las larvas de sapo partero de ambos grupos pasan
moviéndose antes y después de añadir olor de depredador (kairomonas) o agua (control).
Finalmente, se observaron diferencias en cuanto a crecimiento entre los
renacuajos expuestos a glifosato y los que no (MANOVA de medidas repetidas,
interacción entre crecimiento y tratamiento: Wilks λ=0.86; F3,115=6.16; p<0.001; figura
10), independientemente de su exposición o no a estímulos de depredador. Así,
19
aunque no se observan diferencias significativas en el crecimiento total, a los
renacuajos expuestos a glifosato, les creció menos la cola y más la cabeza que a los
control (Tukey tests, p<0.01 en ambos casos).
Figura 10. Crecimiento total y de la cola o cabeza por separado de los renacuajos de sapo partero
sometidos a una dosis subletal de glifosato frente al grupo control.
5 Examen experimental de los efectos de dosis subletales
sobre la tolerancia térmica en poblaciones amenazadas de
sapo corredor (Bufo calamita) (Objetivo 3).
Otro de los factores -en este caso de origen antrópico- que podría interaccionar
con el efecto directo que el glifosato tiene sobre los anfibios, es el cambio climático. El
clima modela la fisiología, ecología y evolución de los seres vivos, siendo una
importante fuerza selectiva que afecta a su supervivencia, crecimiento, rendimiento y
dispersión (Hochacka y Somero 2002; Angiletta 2009). El aumento de 0,6 ºC de
temperatura a nivel planetario, durante el pasado siglo, ha provocado cambios
significativos en los patrones de distribución de las especies, en la estructura y
funcionamiento de los ecosistemas y en la temporalidad de los procesos biológicos
(Root et al. 2003; Parmesan 2006). Se ha sugerido que algunos factores que afectan
negativamente a las poblaciones de anfibios a nivel mundial, como las enfermedades
emergentes, cambios en la humedad del suelo (Pounds et al. 2006) o el acortamiento
del hidroperiodo de las charcas (McMenamin et al. 2008), estarían asociados o
reforzados por el calentamiento global. Del mismo modo, el aumento de la temperatura
de las charcas o la reducción de su hidroperiodo, podrían interaccionar con el efecto
que los pesticidas tienen sobre las distintas especies de anfibios, aumentando su
vulnerabilidad. De hecho, las diferencias encontradas entre estadios larvarios dentro
de una misma especie (mayor vulnerabilidad de los estadios más desarrollados)
podrían deberse a un aumento del metabolismo asociado al desarrollo (Howe et al.
20
2004). Un aumento de la temperatura de la charca o una necesidad de
metamorfosearse antes, debido a la menor duración de ésta (Rowe y Dunson 1995;
Reques y Tejedo 1997), podrían tener un efecto similar, aumentando el metabolismo y,
por lo tanto, la absorción de las sustancias químicas (Mayer y Ellersieck 1994; Mann y
Bidwell 2001). Por ejemplo, la toxicidad del insecticida carbaryl sobre los renacuajos
de rana verde aumenta rápidamente al aumentar la temperatura, de tal manera que los
valores de LC50 a 27ºC son sólo la mitad que a 17ºC (Boone y Bridges 1999). La
temperatura podría pues tener efecto similar en el caso del glifosato. Además, esto es
especialmente relevante en especies que usan medios acuáticos de escasa entidad
donde la temperatura sufre fuertes fluctuaciones, como en el caso del sapo corredor.
Durante los años precedentes, el Departamento de Herpetología de la SCA ha
estado documentando la mayor vulnerabilidad de las dos poblaciones vascas de sapo
corredor al glifosato, en comparación con poblaciones no aisladas de la especie
(Cabido et al. 2010, 2011). El sapo corredor tiene una distribución prácticamente
continua en la península ibérica, excepto en la costa cantábrica, donde sólo existen
dos poblaciones (Azkorri y Txingudi) completamente aisladas (figura 11). Estudios
previos (Iraola et al. 2007) han demostrado que la diversidad genética de ambas
poblaciones es menor que la del resto de la península. La baja diversidad genética se
considera tradicionalmente un factor de riesgo para la viabilidad de las poblaciones.
Existen estudios que demuestran su incidencia sobre la fecundidad, supervivencia y la
adaptación a las variaciones ecológicas naturales en distintas especies (p. ej. Rowe et
al. 1999). En este contexto, y aprovechando las investigaciones precedentes en torno
a las diferencias poblacionales en vulnerabilidad ante diversas amenazas de origen
antrópico, se plantea examinar la interacción entre exposición a dosis subletales de
glifosato y estrés térmico. Ambos factores suponen nuevas y rápidas alteraciones de
origen antrópico a las que las poblaciones y especies deben adaptarse rápidamente.
Previsiblemente, la capacidad adaptativa a estas nuevas condiciones dependerá, en
gran medida, de la diversidad genética de cada población. Las consecuencias de esa
baja diversidad genética son especialmente relevantes, en el caso de las poblaciones
o especies amenazadas, para el diseño de planes de gestión y su correcta
conservación.
21
Figura 11. Distribución del sapo corredor en la península ibérica (en negro) y en el País Vasco (en azul).
Los círculos señalan las poblaciones estudiadas (rojos: baja diversidad genética; verdes: alta diversidad
genética).
5.1 Metodología.
Larvas obtenidas en el laboratorio a partir de puestas procedentes de dos
poblaciones (una con alta y otra con baja diversidad genética) y los correspondientes
cruces entre ambas para excluir posibles efectos ambientales (ver Cabido et al. 2011)
fueron expuestas individualmente a una dosis subletal de Tragli® (4 mg a.e./l, 1/3 del
valor del LC50 de la especie, ver tabla 2) o a agua limpia (grupo control) durante un
periodo aproximado de un mes. Finalmente se realizaron pruebas de tolerancia
térmica para obtener los valores de CTmax siguiendo el protocolo de Duarte y
colaboradores (2012).
5.2 Resultados.
El análisis de la tolerancia térmica de los renacuajos de sapo corredor muestra
que existe una relación entre la temperatura crítica máxima (CTmax: aquella a la que los
renacuajos pierden la movilidad) y el genotipo (mayor o menor diversidad genética,
renacuajos resultantes de dos progenitores de la misma población o cruzados:
ANOVA, F3,95=4.54; p<0.01; figura 12). Además, según el análisis de nuestros datos, la
CTmax también dependería del tratamiento (control o glifosato) al que se sometieron los
renacuajos, de forma que los que han sido expuestos a dosis subletales presentan
menores CTmax (F3,95=18.63; p<0.001; figura 12). Sin embargo, la interacción entre
ambos factores no es significativa (p=0.77), por lo que la diversidad genética no
parece generar una sinergia con los efectos del glifosato en cuanto a vulnerabilidad
térmica.
22
Figura 12. Temperaturas críticas máximas (CTmax) de los distintos grupos de renacuajos de sapo corredor
(AA= diversidad genética alta; AB= macho diversidad alta x hembra de baja diversidad; BA= macho
diversidad baja x hembra de alta diversidad; BB= baja diversidad) tanto los expuestos a glifosato
(PESTICIDE= 1), como los controles (PESTICIDE= 0).
6 Discusión
Nuestros resultados sugieren fuertemente que las dosis de ensayo empleadas
(asimiladas a concentraciones de glifosato esperadas en pequeños humedales) tienen
efectos sobre distintos aspectos, como crecimiento, tamaño de metamorfosis, duración
del estadío larvario, detección de depredadores o tolerancia térmica, que afectan a la
probabilidad de supervivencia de las larvas de anfibios.
En
primer
lugar,
nuestros
resultados
muestran
que
tanto
ambas
concentraciones de Roundup® (la más elevada y la menor) que se esperan en el
campo según las recomendaciones del fabricante, como la más alta de las esperadas
para Tragli® son suficientes para generar, después de dos meses de exposición, un
crecimiento menor de lo normal en una especie de anuro relativamente resistente a la
contaminación (la rana verde ibérica; García-Muñoz et al. 2010). En el caso de una
especie más sensible a los efectos del herbicida, como es el sapillo moteado (GarinBarrio 2012), después de dos meses de exposición, todas las concentraciones menos
la más baja de Tragli® generan un crecimiento disminuido de hasta cerca de un
milímetro; y al cabo de sólo un mes de exposición, la concentración más baja de de
Roundup® ya ralentiza el crecimiento de los renacuajos. Finalmente, al analizar la talla
con la que se metamorfosearon estos renacuajos, siguen siendo menores y tardan en
23
completar la metamorfosis alrededor de 20 días más que los del grupo control. Los
mantenidos en la concentración más alta de Tragli® también tardan 10 días más. Hay
que destacar que estas diferencias de crecimiento hay que considerarlas teniendo en
cuenta que los renacuajos tenían comida ad libitum y ausencia de depredadores. En
condiciones naturales, con competencia por el alimento y mayor inestabilidad
ambiental o presencia de depredadores, estas diferencias serían previsiblemente
mayores. Por último, la concentración más elevada de las esperadas según lo
recomendado por Monsanto para fumigar con Roundup® generó directamente la
muerte del 80% de los renacuajos al cabo de dos semanas, a pesar de ser solamente
el 20% de la LC50 calculada para la especie. Sólo esto ya demuestra que la
vulnerabilidad directa es mucho mayor de la que puede deducirse de los valores de
LC50 tomados a las 96 h (Garin-Barrio 2012).
Determinar si el porcentaje menor de crecimiento provocado por las distintas
concentraciones de glifosato en ambas especies puede tener consecuencias más o
menos inmediatas o cuantificar éstas es imposible sin estudios ad hoc; sin embargo, la
importancia del crecimiento y del tamaño de los metamórficos en la probabilidad de
supervivencia ha sido demostrada por numerosos estudios en diversas especies (p. ej.
Morey y Reznick 2001; Altwegg 2003). Por otra parte, el mayor periodo de tiempo
necesario para conseguir metamorfosearse que se observa puede ser una mera
consecuencia de una mayor dificultad para alcanzar un tamaño mínimo necesario, por
ejemplo, por una menor ingesta de alimento. Sin embargo, muchas especies de
anfibios son capaces de conseguir un crecimiento compensatorio (a costa de movilizar
recursos de otras necesidades) para mantener, precisamente, una talla de
metamorfosis estable (p. ej. Álvarez y Metcalfe 2007; Capellán y Nicieza 2007). En ese
sentido, lo resultados del experimento hecho con larvas de sapo partero indica que los
renacuajos expuestos a glifosato presentan menores tasas de actividad en general y
una respuesta antidepredadora exagerada, que implica todavía menos tiempo
disponible para el forrajeo y, por lo tanto, menor crecimiento. Pero si bien en el caso de
ésta especie nuestros resultados no muestran diferencias en cuanto a crecimiento total
con respecto al grupo control, sí que observamos un menor crecimiento proporcional
de la cola, una estructura musculosa y “cara” de generar y mantener pero relacionada
con la capacidad (natatoria) de escape (Van Buskirk y McCollum 2000). En el caso de
esta última especie, una mayor plasticidad morfológica podría permitir, ante una
situación de escasez de recursos (consecuencia de posibles efectos metabólicos del
herbicida, puesto que todos los renacuajos eran alimentados ad libitum) reasignar
éstos, prescindiendo de estructuras como la cola para mantener una talla de
24
metamorfosis normal (Álvarez y Metcalfe 2007). Esto podría explicar la ausencia de
diferencias en la talla total entre el grupo control y el experimental. Igualmente, la
colateral pérdida en cuanto a capacidad de escape podría, a su vez, estar siendo
compensada comportamentalmente (Cabido et al. 2009), explicándose así la
exagerada respuesta antidepredadora. El nivel de actividad natatoria de las larvas se
relaciona con la probabilidad de ser capturada por depredadores (Skelly 1994) y su
reducción disminuye tanto la tasa de encuentro como la detección por parte del
depredador (Stoks et al. 2003, 2005). Sin embargo, al suponer la disminución de la
actividad de los renacuajos un coste, aunque en principio una mayor respuesta a las
sustancias de alarma puede incrementar las posibilidades de supervivencia de las
presas, la selección natural favorecerá a los individuos que ajusten su respuesta
según la magnitud de la amenaza (Lima y Dill 1990). En este contexto, la
extremadamente reciente aparición, en términos evolutivos, de los pesticidas en el
medio natural puede dificultar la adaptación de las especies y generar trampas
ecológicas al interferir en estos compromisos (trade-offs) y delicados equilibrios entre
distintas fuerzas selectivas, como pueden ser la depredación y la competencia por el
alimento. En cualquier caso, la exposición al glifosato no parece impedir la detección
de las señales de depredadores en esta especie, aunque cabría la posibilidad de que
hubiese afectado a los órganos perceptivos o a las sustancias a detectar. Sin embargo,
no hay que descartar que pueda afectar en este sentido a otras especies, puesto que
las larvas de sapo partero mostraron ser las más resistentes según los valores de LC50
observados.
Por último, el análisis de la tolerancia térmica de los renacuajos de sapo
corredor muestra que la exposición a glifosato también puede hacer a los anfibios más
vulnerables a otros factores de estrés, como es el caso de un aumento repentino de la
temperatura, como consecuencia de la disminución del volumen de agua de una
charca o del paulatino cambio climático. Aunque se han realizado estudios similares
con otros pesticidas (Boone y Bridges 1999), estos suelen examinar el efecto de la
temperatura sobre la vulnerabilidad ante el químico, al contrario de lo examinado en
este trabajo. Sin embargo, aproximaciones experimentales en sentido opuesto al
realizado podrían ofrecer interesantes oportunidades de examinar la interacción de la
temperatura, el glifosato y otros aspectos importantes, como la alimentación o el
crecimiento.
25
7 Conclusiones
1. Concentraciones de los dos principales productos comerciales (Roundup® y
Tragli®) que pueden considerarse como las esperadas en pequeños medios
acuáticos en función de las dosis recomendadas por los fabricantes, tienen efectos
perjudiciales sobre varios aspectos importantes de la ecología de las larvas de
anfibios, pudiendo llegar a ser indirectamente letales.
2. Concentraciones notablemente inferiores a las dosis letales (LC50) conocidas para
algunas especies, pueden acabar resultando directamente letales con el tiempo.
3. Bajas concentraciones de glifosato pueden generar efectos sutiles pero
importantes para la supervivencia de las especies de anfibios, como alterar la
respuesta antidepredadora, disminuir el crecimiento o alargar el tiempo necesario
para completar la metamorfosis. Estos efectos pueden afectar por igual a distintas
especies, independientemente de sus valores de LC50.
4. En general, las concentraciones del herbicida Roundup® tienen mayores efectos
sobre el crecimiento y la duración del periodo larvario que las del herbicida Tragli®,
confirmando los resultados de pruebas para determinar valores de LC50 con ambos
productos (Garin-Barrio y Cabido 2012).
5. Las concentraciones esperadas en medios acuáticos superficiales a partir de las
concentraciones recomendadas por el fabricante de Roundup® tienen efectos
perjudiciales sobre las especies examinadas (y posiblemente sobre todas las
especies de anfibios presentes en la CAPV) tanto en sus valores máximos (1.84
mg a.e./l) como en los mínimos (0.55 mg a.e./l); mientras que, en el caso de
Tragli®, sólo parecen tener efectos detectables en las especies estudiadas las
concentraciones máximas (2.21 mg a.e./l).
6. Los efectos subletales de dosis de ensayo de glifosato empleadas (asimiladas a
concentraciones de glifosato esperadas en pequeños humedales) pueden ser
especialmente graves en especies asociadas a medios temporales y de escasa
entidad, ya que puede generar que prolonguen su periodo de permanencia en el
agua, pudiendo resultar en que no puedan completar la metamorfosis antes de que
la charca se seque; y aumentando su vulnerabilidad ante temperaturas elevadas.
Poblaciones amenazadas como las del sapo corredor, especie ligada a este tipo de
medios, pueden ser especialmente vulnerables.
7. Son necesarios más estudios para examinar, y a ser posible cuantificar, las
implicaciones reales de los efectos que el glifosato tienen sobre la ecología de las
especies para determinar el nivel de riesgo real en condiciones naturales.
Asimismo, se hace necesario plasmar estos y otros estudios en una serie de
26
recomendaciones de uso o restricciones teniendo en cuenta las interacciones
ecológicas y comportamentales del herbicida con las distintas especies o
poblaciones.
8 Referencias bibliográficas
•
Altwegg R. 2003. Multistage density dependence in an amphibian. Oecologia
136: 46-50.
•
Álvarez D, Metcalfe NB. 2007. The tradeoff between catch-up growth and
escape speed: variation between habitats in the cost of compensation. Oikos
116: 1144-1151.
•
Angilletta, M. J., Jr. 2009. Thermal adaptation: a theoretical and empirical
synthesis. Oxford University Press, Oxford.
•
Apfelbach R, Blanchar, C., Blanchard RJ, Hayes RA, McGregor IS. 2005. The
effects of predator odors in mammalian prey species: a review of field and
laboratory studies. Neuroscience Biobehav. Rev. 29: 1123-1144.
•
Beebee TJC, Griffiths RA. 2005. The amphibian decline crisis: A watershed for
conservation biology? Biological Conservation, 125: 271-285.
•
Biek R, Funk WC, Maxwell BA, Mills LS. 2002. What is missing in amphibian
decline research? Insights from ecological sensivity analysis. Conservation
Biology 16: 728-734.
•
Boone MD, Bridges CM. 1999. The effect of temperature on the potency of
carbaryl for survival of tadpoles of the Green Frog (Rana clamitans).
Environmental Toxicology and Chemistry 18: 1482-1484.
•
Boone MD, Semlitsch RD. 2001. Interactions of an insecticide with larval
density and predation in experimental amphibian communities. Conservation
Biology 15: 228-238.
•
Cabido C, Galán P, López P, Martín J. 2009. Conspicuousness-dependent
antipredatory behavior may counteract coloration differences in Iberian rock
lizards. Behavioral Ecology 20: 362-370.
•
Cabido C, Garin-Barrio I, García-Azurmendi X, Rubio X, Gosá A. 2010.
Population differences in vulnerability to glyphosate of natterjack toads. 2nd
international symposium on conservation of amphibian: Bufo calamita.
Donostia-San Sebastián.
•
Cabido C, Garin-Barrio I, Rubio X, Gosá A. 2011. Vulnerabilidad ante pesticidas
y diversidad genética: un experimento de cruzamiento con dos poblaciones de
27
sapo corredor. Tercer congreso de la Sociedad Española de Biología Evolutiva.
Madrid.
•
Cabido C, Garin-Barrio I, Martínez C, Rubio X, Gosá A. 2012a. Control de
plantas invasoras con glifosato: ¿peor el remedio que la enfermedad? Efectos
colaterales sobre los anfibios. Congreso Ecología de Aguas Dulces en
Espacios Naturales Protegidos. Plaiaundi, Irún.
•
Capellán E, Nicieza AG. 2007. Non-equivalence of growth arrest induced by
predation risk or food limitation: context-dependent compensatory growth in
anuran tadpoles. Journal of Animal Ecology 76: 1026-1035.
•
Chivers DP, Smith RJF. 1998. Chemical alarm signalling in aquatic
predator/prey interactions: a review and prospectus. Ecoscience 5: 338-352.
•
Davis AK, Connell LL, Grosse A, Maerz JC. 2008. A fast, non-invasive method
of measuring growth in tadpoles using image analysis. Herpetological Review,
39: 56-58.
•
Duarte H, Tejedo M, Katzenberger M, Marangoni F, Baldo D, Beltrán JF, Martí
DA, Richter-Boix A, Gonzalez-Voyer A. 2012. Can amphibians take the heat?
Vulnerability to climate warming in subtropical and temperate larval amphibian
communities. Global Change Biology 18:412-421.
•
Edington AN, Sheridan PM, Stephenson GR, Thompson DG, Boermans HJ.
2004. Comparative effets of pH and Vision® herbicide on two life stages of four
anuran amphibian species. Environmental Toxicology And Chemistry 23: 815822.
•
García-Muñoz E, Guerrero F, Parra G. 2010. Intraspecific and interspecific
tolerance to copper sulphate in five iberian amphibian species at two
developmental stages. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 59: 312-321.
•
Garin-Barrio I, Cabido C, Rubio X, Gosá A. 2011. Agroquímicos y medios
acuáticos: efecto del glifosato sobre los anfibios vascos. URA-Agencia del
agua, inédito.
•
Garin-Barrio I. 2012. Efecto del glisofato sobre los anfibios riojanos: análisis
experimental y recomendaciones de uso. Informe técnico. Instituto de Estudios
Riojanos (inédito).
•
Garin-Barrio I, Cabido C. 2012. Análisis experimental de los daños producidos
por el herbicida glifosato en anfibios ibéricos. XII Congreso Luso-Español de
Herpetología/XVI Congreso Español de Herpetología. Murcia.
28
•
Giesy JP, Dobson S, Solomon KR. 2000. Ecotoxicological risk assessment for
Roundup® herbicide. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology,
167:35–120.
•
Gonzalo A, López P, Martín J. 2010. Risk level of chemical cues determines
retention of recognition of new predators in Iberian green frog tadpoles.
Behavioral Ecology and Sociobiology 64: 1117-1123.
•
Gosner KL. 1960. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with
notes on identification. Herpetologica 16: 183-190.
•
Govindarajulu PP. 2008. Literature review of impacts of glyphosate herbicide on
amphibians: What risks can the silvicultural use of this herbicide pose for
amphibians in B.C.? British Columbia Ministry of Environment, Victoria, British
Columbia, Wildlife Report No. R-28.
•
Hochachka, P.W., Somero, G.N., 2002. Biochemical Adaptation. Oxford
University Press, Oxford.
•
Hoffmann M, Hilton-Taylor C, Angulo A et al. 2010. The impact of conservation
on the status of the world’s vertebrates. Science, 330, 1503–1509.
•
Houlahan JE, Findlay CS, Schmidt BR, Meyer AH, Kuzmin SL. 2000.
Quantitative evidence for global amphibian population declines. Nature 404:
752-755.
•
Howe CM, Berrill M, Pauli BD, Helbing CC, Werry K, Veldhoen N. 2004. Toxicity
of glyphosate-based pesticides to four North American frog species.
Environmental Toxicology and Chemistry, 23: 1928-1938.
•
Iraola A, García-París M, Gómez-Moliner B. 2007. Informe para el Gobierno
Vasco.
•
Jones DK, Hammond JR, Relyea RA. 2011. Competitive stress can make the
herbicide Roundup® more deadly to larval amphibians. Environmental
Toxicology and Chemistry 2: 446-454.
•
Kats LB, Petranka JW, Sih A. 1988. Anti-predator defenses and the persistence
of amphibian larvae with fishes. Ecology. 69:1865-1870.
•
Kats LB, Dill LM. 1998. The scent of death: chemosensory assessment of
predation by prey animals. Ecoscience 5: 361-394.
•
Kiesecker JM, Blaustein AR. 1997. Population differences in responses of
redlegged frogs (Rana aurora) to introduced bullfrogs. Ecology 78: 1752-1760.
•
Kiesecker JM, Chivers DP, Blaustein AR. 1996. The use of chemical cues in
predator recognition by western toad tadpoles. Animal Behaviour. 52: 12371245.
29
•
Lamprecht I, Schomolz E, Schricker B. 2008. Pheromones in the life of insects.
European Biophysic Journal. 37: 1253-1260.
•
Lardner B. 2000. Morphological and life history responses to predators in larvae
of seven anurans. Oikos 88: 169-180.
•
Lima SL. 1998. Stress and decision making under the risk of predation: recent
developments from behavioral, reproductive, and ecological perspectives.
Stress and Behavior: 215–290.
•
Lima SL, Dill LM. 1990. Behavioral decisions made under the risk of predation:
a review and prospectus. Canadian Journal of Zoology 68: 619-640.
•
Mann RM, Bidwell JR. 2001. The toxicity of glyphosate and several glyphosate
formulations to four species of southwestern Australian frogs. Arch. Environ.
Contam. and Toxicol. 36: 193-199.
•
Mayer FL, Ellersieck MR.1994. Manual of acute toxicity: Interpretation and data
base for 410 chemicals and 66 species of freshwater animals. US Fish and
Wildl. Serv., Whashington, DC. Res. Publ. 160.
•
McMenamin SK, Hadly EA, Wright CK. 2008. Climatic change and wetland
desiccation cause amphibian decline in Yellowstone National Park. Proceedings
of the National Academy of Sciences of United States of America, 105, 16988–
16993.
•
Morey S, Reznick D. 2001. Effects of larval density on post-metamorphic
Spadefoot Toads (Spea hammondii). Ecology 82: 510-522.
•
Newton M, Horner LM, Cowell JE, White DE, Cole EC. 1994. Dissipation of
glyphosate
•
and aminomethylphosphonic acid in North American forests. J. Agric. and Food
Chem.
•
42:1795–1802.Parmesan C. 2006. Ecological and evolutionary responses to
recent climate change. Annual Review of Ecology and Systematics, 37, 637–
669.
•
Pounds LA, Bustamante MR, Coloma LA et al. 2006. Widespread amphibian
extinctions from epidemic disease driven by global warming. Nature, 439, 161–
167.
•
Relyea RA. 2001. Morphological and behavioral plasticity of larval anurans in
response to different predators. Ecology 82: 523-540.
•
Relyea RA. 2004. Fine-tuned phenotypes: tadpole plasticity under 16
combinations of predator and competitors. Ecology 85: 172-179.
30
•
Relyea RA. 2005a. The impact of insecticides and herbicides on the biodiversity
and productivity of aquatic communities. Ecological Applications, 15:618–627.
•
Relyea RA. 2005b. The lethal impacts of Roundup and predatory stress on six
species of North American tadpoles. Archives of Environmental Contamination
and Toxicology, 48:351–357.
•
Relyea RA. 2005c. The lethal impact of Roundup® on aquatic and terrestrial
amphibians. Ecological Applications, 15:1118–1124.
•
Relyea RA, Mills N. 2001. Predator-induced stress makes the pesticide carbaryl
more deadly to Gray Treefrog tadpoles (Hyla versicolor). PNAS 98: 2491-2496.
•
Relyea RA, Jones DK. 2009. The toxicity of Roundup Original MAX® to 13
species of larval amphibians. Environmental Toxicology and Chemistry,
28:2004-2008.
•
Relyea RA, Edwards K. 2010. What doesn’t kill you makes you sluggish: How
sublethal pesticides alter predator-prey interactions. Copeia, 2010:558-567.
•
Relyea RA, Schoeppner NM, Hoverman JT. 2005. Pesticides and amphibians:
The importance of community context. Ecological Applications, 15: 1125–1134.
•
Reques R, Tejedo M. 1997. Reaction norms for metamorphic traits in natterjack
toads to larval density and pond duration. J. Evol. Biol. 10:829-851.
•
Richter-Boix A, Llorente GA, Montori A., 2007. A comparative study of predatorinduced phenotype in tadpoles across a pond permanency gradient.
Hydrobiologia 583: 43-56.
•
Root TL, Price JT, Hall KR, Schneider SH, Rosenzweig C, Pounds JL. 2003.
Fingerprints of global warming on wild animals and plants. Nature, 421, 37–42.
•
Rowe CL, Dunson WA. 1995. Impacts of hydroperiod on growth and survival of
larval amphibians in temporary ponds of Central Pennsylvania, USA. Oecologia
102: 397-403.
•
Rowe G, Beebee TJC, Burke T. 1999. Microsatellite heterozygosity, fitness and
demography in natterjack toads Bufo calamita. Animal Conservation 2: 85-92.
•
Sih A, Kats LB. 1994. Age, experience, and the response of streamside
salamander hatchlings to chemical cues from predatory sunfish. Ethology 96:
253-259.
•
Skelly DK. 1994. Activity level and the susceptibility of anuran larvae to
predation. Animal Behavior 47: 465-468.
•
Smith EA, Oehme FW. 1992. The biological-activity of glyphosate to plants and
animals: a review. Veterinary and human toxicology, 34: 531-543.
31
•
Solomon KR, Thompson DG. 2003. Ecological risk assessment for aquatic
organisms from over-water uses of glyphosate. J Toxicol Environ Health, Part B
6:289–324.
•
Stoks R, McPeek MA, Mitchell JL. 2003. Evolution of prey behavior in response
to changes in predation regime: damselflies in fish and dragonfly lakes.
Evolution 57: 574-585.
•
Stoks R, De Block M, Van de Meutter F, Johansson,¡ F. 2005. Predation cost of
rapid growth: behavioural coupling and physiological decoupling. Journal of
Animal Ecology 74: 708-715.
•
Thomas RM, Urban JH, Peterson DA. 2006. Acute exposure to predator odor
elicits a robust increase in corticosterone and a decrease in activity without
altering proliferation in the adult rat hippocampus. Exp. Neurol. 201: 308-315.
•
Van Buskirk J, McCollum SA. 2000. Influence of tail shape on tadpole
swimming performance. The Journal of Experimental Biology 203: 2149-2158.
•
Vonesh JR, De la Cruz O. 2002. Complex life cycles and density dependence:
Assesing the contribution of egg mortality to amphibian declines. Oecologia
133: 325-333.
•
Wake DB, Vredenburg VT. 2008. Are we in the midst of the sixth mass
extinction? A view from the world of amphibians. Proceedings of the National
Academy of Sciences of United States of America, 105, 11466–11473.
•
Werner EE. 1986. Amphibian metamorphosis: growth rate, predation risk, and
the optimal size at transformation. The American Naturalist 128: 319-341.
•
Wojtaszek BF, Staznik B, Chartrand DT, Stephenson GR, Thompson DG. 2004.
Effects of Vision® herbicide on mortality, avoidance response, and growth of
amphibian larvae in two forest wetlands. Environmental Toxicology and
Chemistry 23: 832-842.
9 Personas participantes e implicación en el proyecto:
•
Dr. Carlos Cabido (Sociedad de Ciencias Aranzadi; Investigador principal):
dirección y diseño del proyecto; realización de experimentos; análisis de datos,
elaboración e interpretación de los resultados; redacción de la memoria.
•
D. Ion Garin Barrio (Sociedad de Ciencias Aranzadi; Investigador): recolección
de puestas y captura de especimenes; realización de experimentos; análisis de
datos y elaboración de los resultados; redacción de la memoria.
•
Dña. Carmen Martínez Saura (Asociación de Naturalistas del Sudeste; Alumna
de Máster): realización de experimentos; análisis de datos y elaboración de los
32
resultados. El objetivo 2 [Examen experimental de los efectos de dosis
subletales sobre la detección y el escape de depredadores naturales en larvas
de sapo partero (Alytes obstetricans)] forma parte de su proyecto de fin de
máster, dentro del “Máster en Gestión de Fauna” de la Universidad de Murcia.
•
D. Alberto Gosá Oteiza (Sociedad de Ciencias Aranzadi; asesor): diseño
experimental y recolección de muestras.
•
Dr. Miguel Tejedo (Estación Biológica de Doñana, CSIC; asesor externo):
diseño experimental, análisis e interpretación de los resultados del objetivo 3
[Examen experimental de los efectos de dosis subletales sobre la tolerancia
térmica en poblaciones amenazadas de sapo corredor (Bufo calamita)].
10 Difusión de los resultados.
10.1 Comunicaciones en congresos:
•
Cabido, C., Rubio, X. & Gosá, A. Una historia de diversificación en la
conservación de anfibios. XII Congreso Luso-Español / XVI Congreso Español
de Herpetología. Murcia, octubre de 2012. (Conferencia invitada).
•
Cabido, C., Garin-Barrio, I., Martínez, C., Rubio, X. & Gosá, A. Control de
plantas invasoras con glifosato: ¿Peor el remedio que la enfermedad? Efectos
colaterales sobre los anfibios. Congreso de Ecología de aguas dulces en
espacios naturales protegidos. Parque Ecológico de Plaiaundi. Irún, enero de
2012. (Panel).
•
Martínez-Saura C, Cabido C. 2012. Efectos subletales del glifosato: interacción
con el comportamiento antidepredador de larvas de sapo partero. XII Congreso
Luso-Español de Herpetología/XVI Congreso Español de Herpetología. Murcia,
octubre 2012. (Panel)
•
Garin-Barrio I, Cabido C. 2012. Análisis experimental de los daños producidos
por el herbicida glifosato en anfibios ibéricos. XII Congreso Luso-Español de
Herpetología/XVI Congreso Español de Herpetología. Murcia, octubre 2012.
(Panel).
•
Cabido C, Garin-Barrio I. 2013. Diversidad genética y vulnerabilidad
poblacional: el caso del sapo corredor y el glifosato. IV Congreso Nacional de
Biodiversidad y I Congreso Ibérico de Biodiversidad. Bilbao, febrero de 2013.
(Panel).
•
Garin-Barrio I, Martínez-Saura C, Cabido C. 2013. Vulnerabilidad de los anuros
vascos al glifosato: diversidad y cripsis en los efectos. IV Congreso Nacional de
33
Biodiversidad y I Congreso Ibérico de Biodiversidad. Bilbao, febrero de 2013.
(Panel).
10.2 Publicaciones científicas:
•
Beebee, T., Cabido, C., Eggert, C., Gómez-Mestre, I., Iraola, A., Garin-Barrio, I.,
Griffiths, R.A., Miaud, C., Oromi, N., Sanuy, D., Sinsch, U., & Tejedo, M. 2012.
40 Years of Natterjack Toad Conservation in Europe. Froglog, 101:40-44.
10.3 Videos divulgativos:
•
Cabido, C. 2012. Los efectos del glifosato en los anfibios.
•
Garin-Barrio, I. 2012. Glifosatoaren eragina anfibioetan.
34