Download 01. Presentación general del Ejercicio de - (GEP

ghep-isfg
EJERCICIO 2014
GRUPO DE HABLA ESPAÑOLA Y PORTUGUESA
GRUPO ESPANHOL E PORTUGUÊS DA ISFG
“ESTUDIO DE
POLIMORFISMOS DE ADN
EN MANCHAS DE SANGRE Y
OTRAS MUESTRAS
BIOLÓGICAS”
KORO FERNÁNDEZ OLIVA
COORDINADORA DEL EJERCICIO
INSTITUTO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA Y CIENCIAS
FORENSES
SERVICIO DE GARANTÍA DE CALIDAD DEL DEPARTAMENTO DE
MADRID
Estructura y contenido del
NIVEL BÁSICO
Ejercicio
Composición del ejercicio
NIVEL BÁSICO
•Módulo de parentesco
•Módulo forense
ESTUDIO PRÁCTICO
M1,M2,M3
ESTUDIO PRÁCTICO
M4, M5
ESTUDIO TEÓRICO
ESTUDIO TEÓRICO
Cálculo IRB
Cálculo LR
NIVEL BÁSICO: Módulo de
parentesco práctico
Análisis genético
M2
M1
Saliva
M3
Sangre
Saliva
NIVEL BÁSICO: Módulo de
parentesco teórico
Calcular el índice de relación biológica
de los supuestos abuelos respecto del
hijo, conociendo a la madre biológica.
Indicar los valores de LR
parciales para cada
?
marcador y el valor de LR
total.
Programas informáticos empleados o
cálculo manual
NIVEL BÁSICO: Módulo
forense práctico I
Análisis genético
M4
¿MEZCLA DE
FLUÍDOS?
¿NATURALEZA
DE LOS
FLUÍDOS?
¿M1,M2,M3
CONTRIBUYENTES
DE M4?
NIVEL BÁSICO: Módulo
forense práctico II
Análisis genético
M5
Vello sin
contaminación
NIVEL BÁSICO: Módulo
forense teórico
Homicidio: Indubitada sospechoso y de la victima
cotejo con restos de sangre
=perfil del sospechoso
Cálculo de las
frecuencias genotípicas
y la frecuencia
esperada del perfil
Cálculo de la razón de
máxima verosimilitud (LR)
Programa informático o fórmulas empleadas
Expresión de resultados correctos/incorrectos
Composición del ejercicio
NIVEL AVANZADO
•Módulo de parentesco
Desafío teórico de parentesco
Cálculo LR
•Módulo forense
Estudio práctico
M6, M7, M8
Desafío teórico
Cálculo LR
NIVEL AVANZADO: Desafío de
parentesco
• Cálculo de los valores de LR parciales para 9
marcadores (Likelihood ratio) para cada una de las
hijas.
- Indicar las hipótesis utilizadas
- Indicar la población utilizada (España/Quito)
• Programa informático o fórmulas empleadas
NIVEL AVANZADO: Módulo
forense práctico
M6
M8
Análisis genético
Naturaleza de los fluidos
Nº contribuyentes
¿M1,M2,M3 Contribuyentes?
¿Contribución no humana en M7?
M7
NIVEL AVANZADO: Desafío forense
Agresión
Sexual y muerte
Vínculo biológico
Número de contribuyentes
Alelos del EFG considerados para cálculo LR
¿S1 y S2 compatibles con el perfil del EFG?
Otras hipótesis para el cálculo de la LR
Programa informático y/o fórmulas empleadas
PREPARACIÓN DE
MUESTRAS
PREPARACIÓN DE MUESTRAS I
TOMA DE MUESTRAS DONANTE: 11/01-13 /01/2014
Conservación en frío o congelada hasta su utilización
PREPARACIÓN DE ÍTEMS: 16/01-30/01/2014
Condiciones
Ropa protectora:gorro, bata, guantes, mascarilla
Limpieza de superficies
Material desechable y estéril
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
II: homogenización
HOMOGENIZACIÓN MUESTRA DEL DONANTE
HOMOGENIZACIÓN ANTES DE LA DISPENSACIÓN
(Frecuencia, dependiente de la naturaleza del fluído )
DISPENSACIÓN
HOMOGENEA
PERSONAL CUALIFICADO
SUPERVISIÓN
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
III:dispensación
M1: 100 µl
saliva varón
Hisopo
M2: 100 µl Saliva mujer
M3: 100 µl Sangre
mujer
Papel Whatman
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
III:dispensación
M4: 50 µl Mezcla saliva/sangre 2:1 (v/v)
Varón/Mujer
Servilleta
M5: 3
Vellos varón
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
IV:dispensación
M6: 4 µl Sangre
de varón
Hilo dental
M7: 24 µl Mezcla
sangre/saliva 4:1
(v/v)
Vaca Brava/Varón
Hisopo de nylon
M8: 50 µl Mezcla
saliva/semen 4:1
(v/v)
Mujer/Varón
tela
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
V:secado y envasado
1 muestra por día: secado hasta el día siguiente
Adecuación, Etiquetado y
Envasado
ENVIO DE MUESTRAS
-DOCUMENTACION
-MODO DE ENVÍO
DOCUMENTACIÓN
Nº laboratorio y nº precinto
-CARTA
Fecha límite: 12/05/2014
Resumen instrucciones: formulario
online, envío de formulario
cumplimentado y firmado registros
-INSTRUCCIONES
- FORMULARIO/S +ANEXO
MODO DE ENVÍO
RESTO DE LOS
PAISES
ARGENTINA
BRASIL
COSTA RICA
MÉXICO
PROBLEMAS ADUANAS, “EXTRAVÍO”,ERROR
ENVÍO
CONSULTAS
Envíos
-Recepción en embajadas
-Análisis a realizar
-Problemas para entrar
-Grabación de datos
Formulario
Resultados
Nuevo
Formulario
-Problemas con archivo Excell
-Frecuencia Quito /España
-error en la frecuencia de 1 marcador Quito
-confusión cálculo IRB
-Fecha límite
-Modo envío registros
-Dirección envío
-Recepción correcta
-problemas con M1
Datos generales de la
participación de los
laboratorios
NÚMERO Y TIPO DE PARTICIPANTES I
NÚMERO DE PARTICIPANTES
público
2013
privado
TIPO DE PARTICIPANTES II
N=119 NC=15
50
OTROS
ORG. JUSTICIA
26
ORG. UNIVERSIDAD
22
JUST + UNIV
2
13
UNIV + HOSP
JUST + HOSP
1
1
4
ORG. SEGURIDAD
ORG. HOSPITAL
ACREDITACIÓN Y LABORATORIOS
Acreditación
60
51
ISO/IEC 17025:2005
45
ISO:15189:2007
50
34
Acreditados
40
No acreditados
número de
30
laboratorios
En vías
20
10
No contesta
4
CAP (EEUU), PALC (Brasil)
PROGRAMAS DE
ACREDITACIÓN
GUBERNAMENTALES
0
Certificación
ISO 9001:2008
Controles de calidad
ACTIVIDAD Y CASUÍSTICA DEL LABORATORIO
P+F
P+F+Otros
P
44
18
41
P+Otros Forense
14
F +Otros
Otros
NC
2
2
2
3
Identificación (restos óseos,menores,desaparecidos),adopciones irregulares, diagnóstico clínico y
genético, farmacogenética, g. de poblaciones, g. animal, genética molecular humana, banco ADN,
análisis citogenético, tipaje, antropología, agroalimentación, origen geográfico
Nº laboratorios
Nº máximo de casos = 38.000
Nºmínimo de casos=2
Nº máximo de casos = 26.000
Nºmínimo de casos= 2
< 100
100-500
500-1000
>1000
DISTRIBUCIÓN DE LA PARTICIPACIÓN
EN MÓDULOS Y NIVELES
140
134
120
100
79
80
82
57
Módulo Parentesco
Módulo Forense
60
40
20
0
Nivel básico
Nivel avanzado
METODOLOGÍA
PRELIMINARES
EXTRACCIÓN PURIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN
AMPLIFICACIÓN*
DETECCIÓN
*(ADN mit)
PURIFICACIÓN
SECUENCIACIÓN
PURIFICACIÓN
METODOLOGÍA TÉCNICAS
PRELIMINARES NIVEL BASICO I
58/72 laboratorios realizan alguna prueba preliminar
N=56
METODOLOGÍA TÉCNICAS
PRELIMINARES NIVEL BASICO II
N=55
METODOLOGÍA TÉCNICAS
PRELIMINARES NIVEL BASICO III
N=41
METODOLOGÍA:
EXTRACCIÓN NIVEL BÁSICO
Nº laboratorios
25
Ítems REFERENCIA
M1, M2, M3
20
15
10
5
0
Or
g
án
ic
a
Ch
ele
x
Q
Ot
IA
ro
am
s
p
FT
A
3 “salting out”
M
ax
we
ll
Pr
ep
Fi
le
DN
r
A
IQ
EZ
1
1 NaOH+calor
2 robot Magnapure
4 protocolos directos
3 otras columnas de sílice
2 métodos propios
METODOLOGÍA: EXTRACCIÓN NIVEL
BÁSICO
Ítems FORENSES
45%
40%
35%
30%
Orgánica
25%
QIAamp
20%
EZ1
Otros
DNA IQ
Maxwell
Chelex
QIAamp
M5
Orgánica
M4
PrepFiler
15%
Chelex
10%
PrepFiler
5%
0%
Maxwell
DNA IQ
Otros
EZ1
Otros: Wizard, Magnapure,Masterpure, Invisorb spin columns,DNAeasyblood, DNA IQ
METODOLOGÍA: PURIFICACIÓN
NIVEL BÁSICO
4% 2% 1%
REFERENCIA
22%
6%
M1, M2, M3
11%
Incluída en la extracción
No se realiza
Amicon
Precipitación
Microcon
54%
QIAamp
FTA
FORENSES
3%
M4
6%
7%
12%
4%
13%
M5
15%
12%
20%
46%
26%
35%
METODOLOGÍA: CUANTIFICACIÓN
NIVEL BÁSICO
Quantifiler trio
*
Otros
Plexor HY
Fluorimetría
M5
Espectrofotometría
M4
M1-M3
Quantifiler Human
Quantifiler duo
No se cuantifica
0
5
10
15
20
25
% laboratorios
30
35
40
45
Otros: Agarosa, PCR
Real time, Nanodrop
Quantiplex,
*Almeida et al (2011), Efficient DNA extraction from hair shafts. FSI. Genetic
Supplement series, 3, e319-e320
METODOLOGÍA: NIVEL AVANZADO
EXTRACCIÓN
-El principal método de extracción es la extracción
orgánica seguida de prepfiler
-60% de los laboratorios realizaron lisis diferencial
PURIFICACIÓN
-El principal método de purificación mediante
ultrafiltración :Amicon y Microcon
CUANTIFICACIÓN
-El 80% de los laboratorios cuantifica específicamente
ADN humano. Disminuye el número de labs que
cuantifican ADN total.
-Sólo el 8% no cuantifica
54 MARCADORES
Nº laboratorios
Kits
marcadores
STRs
STR
FF
ID
L
NA
SE
21
plu
s
PP
1
NG
MS 6
Id
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en
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Glo
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21
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M
PP
17
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X
PP
17
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I
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ga
18
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21
HS
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16
ES
I
PP
16
ES
X
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r
METODOLOGÍA:AMPLIFICACIÓN
A-STR NIVEL BÁSICO
25
20
15
10
5
0
EUROPA
CENTRO Y SUDAMÉRICA
-6 laboratorios con primers propios para marcadores STR
-8 laboratorios con primers propios complementando a los
kits
METODOLOGÍA: AMPLIFICACIÓN
Cromosomas sexuales
25 MARCADORES
Kits marcadores X-STR e Y-STR
CrY
35
30
25
20
15
10
5
12
R
X
-S
T
A
rg
us
X
ig
at
or
In
ve
st
In
ve
st
ig
at
or
A
rg
us
Y1
2
PP
Y
PP
Y2
3
ile
r
0
Yf
Cr X
Nº laboratorios
26 MARCADORES
EUROPA
CENTRO Y SUDAMÉRICA
-5 Laboratorios utilizaron sólo primers propios y 1 como
complemento a los kit de CrY
-4 Laboratorios utilizaron sólo primers propios y 4 como
complemento a los kit de CrX
AMPLIFICACIÓN NIVEL AVANZADO
-El kit más empleado es Identifiler plus
-Aumento de los nuevos sistemas que incluyen 21
marcadores
-Sólo un laboratorio que utiliza primers propios
como complemento de los kits. (STRs
autosómicos y Y-STR)
-Máximo número de kits de marcadores STR
autosómicos empleados =6
-El kit más empleado para YSTR fue Yfiler.
Aumento del uso de kits de mayor poder de
discriminación PPY23.
Plataformas ABI
3%
23%
25%
310
2%
3100
3130/3130xl
3500/3500xl
3730
47%
METODOLOGÍA:
DETECCIÓN
MEGABACE
1
GEL NITRATO PLATA 1
ALF 1
FMBIOII
1
METODOLOGÍA MITOCONDRIAL I
REGIONES AMPLIFICADAS
HV1+HV2
100%
HV3
D-Loop 28%
38%
Purificación productos PCR
Otros: Illustra Microspin, PCR
purification kit (Norgen),
Precipitación alcohólica
modificada
60
51%
ExoSAP
50
Otros
40
30
20
Microcon
17%
Qiaquick
13%
Minelute
11%
4%
10
0
QUÍMICA DE SECUENCIACIÓN
BigDye v1.1
30%
BigDye v3.1
70%
Microspin
2%
2%
Wizard
METODOLOGÍA MITOCONDRIAL II
Purificación reacciones de extensión
4%
9%
Digestión SAP+precipitación
DyeEx
17%
CENTRI-SEP
30%
Precipitación alcohólica
40%
Otros
0
10
20
30
40
50
Otros: BigDyeXTerminator, placas Sephadex, ZR DNA Sequencing clean up kit,precipitación
+EDTA, precipitación según FREGEL et al (2010),digestión SAP+Centri-Sep
Software de edición
11%
6%
SeqScape
Otros
Sequencher
19%
64%
Bioedit
Otros: DNA Star, Mutation Surveyor v4.09, Sequencing Analysis, Geneious, lectura directa
ASIGNACIÓN VALORES
CONSENSO. EVALUACIÓN
Valor asignado: obtenido por consenso o puede ser un valor de referencia
Valor consenso Resultado concordante emitido por al menos el 70% de los
participantes, siempre que haya una participación mínima de 5 laboratorios
Valor de referencia: valor conocido
C: Coincide con el valor de referencia consenso
D: Errores en el tipaje, pérdidas o ganancias alélicas, cambio de muestra, etc.
N: Discrepancias debidas al uso de una nomenclatura o un formato diferentes a
los especificados en las instrucciones.
T: Errores de transcripción en la cumplimentación del formulario.
Para la evaluación de los datos teóricos se consideran correctos aquellos
resultados que coincidan plenamente con el valor de referencia o discrepen de él
únicamente en el último decimal de los exigidos. Se consideran valores
aceptables (A) los resultados que estén dentro del intervalo: valor de referencia ±
5%.
COMENTARIOS
FORMULARIO
-REVISIÓN ANTES DE APERTURA
-MEJOR FORMATO
-AUTOMATIZACIÓN INTRODUCCIÓN DATOS
-DIFICULTAD LENGUAJE
EJERCICIO
-ENUNCIADO DE LOS TEÓRICOS
-NOMENCLATURA A UTILIZAR
-HIPÓTESIS TEÓRICO BÁSICO +/-REVISIÓN EVALUACIÓN MEZCLAS
-ENVÍO RESULTADOS CORREO ELECTRÓNICO
SUGERENCIAS
-INCLUIR MUESTRAS ÓSEAS
-INCLUIR CÁLCULOS MEZCLAS EN
TEÓRICO BÁSICO
-INCLUIR PATERNIDAD CON
MARCADORES SEXUALES EN TEÓRICO
BÁSICO
-SEGUIR INCLUYENDO VALORACIÓN
PROBABILISTICA DE LA PRUEBA
-DESAFÍO: 2 HERMANOS Y LA MADRE
COMENTARIOS, SUGERENCIAS
Y APELACIONES
intcf.eiadn@mju.es
Servicio Garantía de Calidad
Servicio Biología