Download Flujo de genes en yuca

América Latina: Desarrollo de capacidad multi-país en
cumplimiento del Protocolo de Cartagena en Bioseguridad
(COLOMBIA, PERU, COSTA RICA, BRASIL)
1. Informe técnico final de subproyectos
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NOMBRE DEL PROYECTO
Flujo de genes entre clones cultivados de yuca y sus parientes silvestres del genero Manihot, en Colombia
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NOMBRE DEL INVESTIGADOR PRINCIPAL
Luisa Fernanda Fory
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NOMBRE DE LA INSTITUCIÓN QUE DESARROLLA EL PROYECTO
CIAT
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JUSTIFICACIÓN
La yuca pertenece al género Manihot y posee tanto especies cultivadas como silvestres. El género contiene 98 especies silvestres
ampliamente distribuidas (Rogger y Appan, 1973). Manihot esculenta Crantz es la yuca cultivada en América, Asia y África. Se
han llegado a caracterizar mediante SSR hasta 1600 accesiones de yuca cultivada y variedades locales algunos sobre diversidad
estudios están recopilados en la revisión realizada por Ferguson et al. (2012). No obstante pocos estudios han estudiado la
diversidad de las especies silvestres (Roa et al., 2000 y Bocanegra et al., 2010). Gracias a la genotipificación por secuenciación se
ha completado el 98 % de secuencias codificantes del genoma total de yuca (Prochnik et al., 2012), el IITA esta secuenciando
genes de resistencia en diferentes especies silvestres de Manihot (Ferguson et al., 2012). Y recientemente el CIAT y el Instituto de
Genómica de Pekín, planean secuenciar más de 5000 genotipos de yuca incluyendo razas locales o criollas con el objetivo de
acelerar el mejoramiento en el cultivo yuca.
Diferentes eventos de transformación se están produciendo a nivel mundial ya sea para incrementar la calidad nutricional,
resistencia a enfermedades y el análisis de secuencias promotores para incrementar la expresión de genes. El escalamiento a gran
escala en la evaluación de plantas transformantes a permitido que centros como El CIAT y “Donald Danforth science” pueden
manejar más 3500 líneas de plantas transgénicas con 50 construcciones en poco tiempo (Taylor et al., 2012). Con el convenio de
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diversidad biológica se pone de manifiesto la creación del protocolo de Cartagena, el cual se centra principalmente en la
regulación, transferencia y manipulación de los organismos genéticamente modificados (OGM), estableciéndose de este modo
pautas para la evaluación de riesgo de los organismos genéticamente modificados. Ante una prominente liberación de yuca
transgénica es necesario establecer los delineamientos básicos para evitar o minimizar el flujo de genes. El flujo de genes es un
fenómeno natural en el cual ocurre un movimiento de la información de padres a hijos, en el caso de yuca la polinización es
ayudada por insectos y las características pueden transferirse a través del polen y la semilla. Para desarrollar un análisis de riesgo
equilibrado, justo con la demanda de sostenibilidad productiva para este cultivo de subsistencia se deben tener en cuenta varios
aspectos como: el conocimiento de las especies silvestres, el flujo de genes entre yuca cultivadas y su especies relacionadas,
distancias de separación, así como conocer son las consecuencias de una introgresión en poblaciones nativas y como influye el
movimiento de semillas en el flujo de genes. Esta información debe ser generada y/o actualizada empleando las herramientas
científicas que se tiene hoy en día ante la demanda de los reguladores y tomadores de decisión competentes, poniendo a
disposición información y herramientas claves para ayudar a implementar el Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad.
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DESCRIPCION DEL SUBPROYECTO
El objetivo general de este proyecto es el fortalecimiento de la capacidad técnica mediante la generación de conocimiento para
el desarrollo de guías o lineamientos en bioseguridad encaminados a la evaluación de riesgo de tipo ambiental. La información
obtenida en esta investigación es necesaria para estudiar la dinámica de flujo e introgresión y mide de una manera ex ante la
supervivencia de eventos potenciales de cruzamiento. Además genera una serie de metodologías que pueden ser utilizadas para otros ensayos
de dispersión de semilla en yuca, identificación de poblaciones silvestres de yuca, supervivencia de plantas voluntarias originadas de semilla
sexual.
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OBJETIVOS
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Producto 1. Conocer la distribución de especies silvestres de yuca en Colombia, y actualizar las bases de datos establecidas e
identificar y predecir las zonas coexistencia del cultivo y de sus parientes silvestres.
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Producto 2. Caracterizar molecularmente de especies silvestres a través de marcadores basados en secuencias simples repetidas
(SSR), polimorfismo de simple nucleótido (SNPs) y secuencias de cloroplasto e identificación de marcadores específicos para
especies silvestres.
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Producto 3. Determinar las tasas de hibridación mediante marcadores tipo SSR y SNPs usando una línea de yuca androestéril
cultivada y un mutante libre de amilosa.
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Producto 4. Metodología de evaluación de la supervivencia de plantas voluntarias en campos comerciales.
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MÉTODOS
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Producto 1. Distribución e identificación de áreas potenciales de coexistencia. La distribución potencial de las especies silvestres de
Manihot fue realizada utilizando 1016 registros tomados de las bases de datos electrónicas del CIAT, Embrapa y GBIF. Distribuciones
potenciales fueron modeladas utilizando el programas de MAXENT (Phillips et al., 2006), el cual utiliza 19 variables bioclimáticas de
BIOCLIM (Busby, 1991), y algoritmos de máxima entropía. La información de mapas de coexistencia fueron obtenidos mediante el
solapamiento de los mapa de riqueza y los datos de siembra obtenidos de MapSaM (You et al., 2000). Los mapas de distribución y
acceso de carreteras fueron utilizadas en las expediciones a los 12 departamentos de Colombia. Los registros y fotografías del género
Manihot pueden ser consultados en la herramienta llamada Manihot-EcoMap la cual se encuentra en la web:
http://spatanweb.ciat.cgiar.org:8008/biosafety/web/ y http://spatanweb.ciat.cgiar.org/ManihotEcoMap/.
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Producto 2. Análisis molecular de especies silvestres. El ADN de 629 accesiones silvestres y cultivadas fue aislado mediante
DNeasy® Plant Mini Kit y el protocolo de Dellapo rta (1983). El análisis molecular fue realizado usando 7 SSR y 3 EST altamente
polimórficos (Mba et al., 2001; López et al., 2007; Raji et al., 2009). La visualización de los fragmentos amplificados fue realizada
mediante electroforesis de geles de poliacrilamida al 6%, y tinción con nitrato plata siguiendo los protocolos descritos Bassam et al.,
(1991). Los tamaños de los alelos se determinaron visualmente por comparación con el marcador de tamaño molecular estándar 10 pb
(Invitrogen®). Con el fin de conocer la estructura poblacional los datos fueron analizados a través de los análisis de correspondencia
múltiple ACM (SAS, 1989) y Structure (Pritchard et al., 2000). El índice de diferenciación genética entre las poblaciones FSts,
estimando su importancia en 10000 permutaciones, Nm número de inmigrantes entre poblaciones, número de alelos privados fueron
calculados usando programas como Arlequin (Schneider et al., 2000), Genepop (Raymond and Rousset, 1995) y SAS (1989).
Adicionalmente se calculó la identidad y distancia genética de Nei (1978). Usando las secuencias reportadas por Olsen y Schaal (1999)
y Chacón et al. (2008), se diseñaron marcadores moleculares útiles en diferenciación de especies silvestres. La distribución de
especies silvestres y su análisis molecular fue llevada a cabo en acuerdo entre el Instituto de investigación Biológicas Alexander von
Humboldt y el CIAT.
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Producto 3. Tasas de hibridación entre variedades de yuca cultivada. Todas las plantas fueron propagadas in vitro (Roca, 1984) y
endurecidas en invernadero durante dos meses, posteriormente fueron trasplantadas en una hectárea de campo, el donador de polen
HMC1 fue sembrado en forma de cruz y los receptores de polen en los cuatro cuadrantes formados; dos cuadrantes con una variedad
criolla androestéril (algodona MCOL 1522) utilizada por la industria por su alto contenido de almidón y dos cuadrantes con una
variedad sin amilosa (conocida como genotipo Waxy), originada mediante una mutación natural. Los mutantes Waxy no expresan la
proteína funcional codificada por el gen GBSSI (en inglés “granule bound starch synthase”), gen involucrado en síntesis de
almidón.Los marcadores tipo SSR y SNPs putativamente asociados en la mutación en el gen GBSSI fueron utilizados para validar la
tasa de flujo de genes en el clon libre de almidón. El gen GBSSI, esta involucrado en síntesis de almidón (Salehuzzaman et al., 1983).
Los frutos del clon androestéril fueron contabilizados como producto de la polinización cruzada debido a la ausencia de polen en este
clon. La estación meteorológica del CIAT registro datos de temperatura, humedad relativa y velocidad del viento durante el periodo de
floración. La floración fue registrada una vez al mes durante seis meses del cultivo y el número de flores masculinas y femeninas fue
contabilizado durante la máxima floración del donador y el receptor . Como controles fueron utilizados; plantas enmasculado e
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híbridos artificiales. El análisis de los datos fue realizado utilizando el paquete estadístico SAS (1989) y el software RstudioTM.
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Diseño de marcadores. En este estudio se diseñaron diferentes marcadores sobre la deleción en el exón 6 del GBSSI previamente
reportadas por el grupo de genética de yuca (CIAT, 2006) usando el programa SNAPER (Drenkar et al., 2000). Al comparar la
secuencia mutada en el exón 6 con la secuencia obtenida del GeneBank X74160 (Salehuzzaman et al., 1983). La deleción en este
sitio de una citosina origina la formación de un codón de parada en la proteína mutada (Waxy), lo que podría ocasionar que no se
produzca una proteína normal de 608 aa (X74160) si no una proteína truncada 298 aa. También fueron diseñados otros primeres sobre
otras regiones que presentaban cambio de nucleótidos (GC por AT), los cuales presentaban cambios de argininas por histidina
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Producto 4. La supervivencia de plantas voluntarias fue registrada en lotes comerciales que presentaron al menos dos ciclos de
siembra del cultivo en las zonas del Valle del Cauca, Cauca y Costa Atlántica. Lotes y plantas fueron previamente georeferenciadas
mediante: GPS, GeoExplorer 3 (Trimble) acorde Pujol et al. (2005). La evaluación de la supervivencia de plantas fue realizada antes y
después de la limpieza de los lotes. Diferentes variables morfológicas como altura de planta, diámetro del tallo y peso de la raíz fueron
medidas durante la floración y cosecha de plantas voluntarias (EMBRAPA, 1998).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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Producto 1. Conocimiento de las especies silvestres. Se realizaron cuatro expediciones a 12 departamentos y fueron observadas tres de
las cuatro especies silvestres reportadas para Colombia. Manihot brachyloba Jacq es un arbusto tipo liana de 7 metros de altura, tallo
liso con abundante látex, hojas generalmente de tres lóbulos, flores blancas en el exterior y rojizas en el interior, fruto globoso no
alado. Las poblaciones silvestres están distribuida principalmente en el centro, oriente y occidente del país y se encuentran sobre la
vegetación secundaria. Las poblaciones fueron encontradas entre 10 a 800 msnm a orillas de los ríos en lugares sombríos, en suelos
con alto contenido de materia orgánica. Manihot carthagenensis Jacq. Müll Arg es un arbusto de hasta 12 m de alto tallo, ceroso, hojas
con lóbulos pandurados, flores de color blanco amarillento, fruto globoso. Las poblaciones están distribuidas principalmente en la
costa Atlántica Colombiana se encuentran expuestas al sol en bosques xerofíticos entre los 8 y 523 msnm. Manihot tristis Müll. Von
Arg es un árbol hasta 6 metros de altura con pocas hojas en sus ramas tallo ceroso. Hojas con lóbulos delgados de diferentes formas
(enteros lóbulo o pandurado), debido a que las visitas fueron realizadas en el periodo de verano ninguno de las plantas observadas
presentaron flores y frutos. Las poblaciones son endémicas y se encuentran en el oriente Colombiano y fueron encontradas entre los
68 y 193 msnm, expuestas a alta radiación solar en afloramientos rocosos del Vichada. Es necesario validar taxonómicamente los
caracteres morfológicos de esta especie, dado que presenta alta variación en la morfología de sus hojas y existen tres subespecies de
M. tristis distinguidas por la unión del peciolo a la base de la hoja. Las tres especies encontradas de Manihot presentan una amplia
adaptación ya que algunas especies pueden tolerar sequia y/o altas precipitaciones, estas especies habitan en suelo ácido con altas
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concentraciones a Aluminio (AI), bajas concentraciones de Zinc (Zn), Fosforo, Calcio (Ca), Cobre (Cu) y Potasio (K) elementos
esenciales para el crecientito del cultivo de yuca.
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Se identificaron dos zonas de coexistencia o simpatría de las especies M. carthagenensis y M. brachyloba en los departamentos de
Atlántico y Antioquia respectivamente, donde individuos silvestres encontraban cerca de plantas cultivados de yuca, las cuales son
utilizadas para consumo local para pequeños agricultores que moran cerca a las carreteras. Estas observaciones no implican la
existencia de cruzamiento entre cultivo y silvestres ya que no son muy relacionadas con la yuca, además pueden existir barreras de
ploidia y se desconocen estudios sobre su fenología en condiciones naturales (Allen et al., 2001). Se generaron diferentes modelos con
las coordenadas geográficas de las especies silvestres, Utilizando el estadístico AUC (área under the curve) estimados a partir de ROC
(Receiver operating characteristics) para la predicción de los modelos. Mediante estos análisis se obtuvieron mejores ajustes en los
modelos de distribución potencial para las M. carthagenensis y M. brachyloba y M. tristis (0.99). Siguiendo estos modelos de
distribución potencial de las especies se logró la identificación de nuevas zonas donde habitan las especies silvestres. Adicionalmente
se creó una herramienta llamada Manihot-EcoMap que contiene 1470 registros de especies de Manihot silvestres y cultivadas
obtenidas de base de datos como CIAT, Embrapa y GBIF herbarios y expediciones botánicas. Así como los mapas de distribución y
la distribución potencial de las especies silvestres colectadas recopilación de 406 fotos de herbario. EcoMap pueden ser utilizadas por
los tomadores de decisiones para definir criterios de regulación, ante la eventual siembra de yuca genéticamente modificada en zonas
cercanas a hábitats de especies silvestres, con el fin de prevenir el potencial flujo génico.
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Producto 2. Caracterización de la diversidad genética de especies silvestres. Un total de 281 alelos fueron observados para los 10 loci
amplificados en las 681 accesiones de los cuales 176 alelos (62.6%) corresponden a especies silvestres. Los marcadores tipo
microsatélites ssry164 y ssry161 presentaron el mayor porcentaje de heterocigotos (38.35 y 35.89 %). La población de M. brachyloba
registró el mayor numero de alelos promedio por locus (12) y la heterocigocidad esperada He =0.6022 heterocigocidad observada Ho
= 0.2471, mientras las población de M. carthagenensis registró 7.8 alelos y He = 0.4501 y Ho = 0.2115. El menor número de alelos
(4.7) fue identificado en M. tristis, especie que presento valores de He= 0.3532 y Ho = 0.2797. Estos valores sustentan el cruzamiento
alógamo de las plantas de yuca y la gran variabilidad dada por la reproducción por semilla (Nassar, 2008). Alta heterocigocidad
esperadas y observadas (0.538 a 0.7353) han sido reportadas en trabajos realizados por Rojas et al. (2011) y Fregene et al. (2003),
quienes sustentan estos valores debido al sistema de reproducción alogamo, y a las prácticas culturales de quema y siembra utilizadas
por los agricultores amerindios, quienes favorecían la incorporación de plantas voluntarias. La población silvestre que presentó mayor
número de alelos fue M. carthagenensis con 20 alelos privados o en baja frecuencia (0.05-0.89) mientras que las poblaciones M.
brachyloba y M. tristis presentaron 10 y 7 alelos privados respectivamente y sus frecuencias oscilaron (0.01- 0.63). Estos resultados
confirman la existencia de tres acervos distintos y los alelos específicos pueden ser utilizados para estudios de clasificación de
germoplasma y estudios de introgresión ya que estos caracteres no están influenciados por las diferentes condiciones ambientales
donde habitan las especies colectadas. Las poblaciones de M. carthagenensis colectadas en Antioquia (A), Magdalena (M) y Guajira
(G) fueron significativamente diferentes entre sí (Population pairwise Fst G-A= 0.2764; Fst M-G= 0.3610; Fst M-G = 0.1616;
6
p>0.001) y presentaron un alto número de inmigrantes (Nm A-G = 1.3088; Nm M-A = 0.8847; Nm M-G =2.5932 con un Nm total =
1.002). Las siete poblaciones de M. brachyloba fueron diferentes entre si (Villavicencio, Antioquia, Caldas, Choco, Cundinamarca,
Casanare y Vichada. El Fst osciló entre 0.13468 (Villavicencio y Cundinamarca) y 0,67011 (Caldas y Vichada). El número de
inmigrantes corregido para estas poblaciones fue menor que el registrado con M. carthagenensis (Nm = 0.4938) y osciló entre 3.2140
(poblaciones Villavicencio y Cundinamarca) y 0.2461 (Caldas y Vichada). Lo cual indica que es posible intercambiar información
dentro de las mismas especies entre las poblaciones más cercanas de M. carthagenensis y M. brachyloba. De otro lado los criollos
fueron altamente diversos ya que presentaron el mayor número de alelos promedio (16), alelos privados (26), el mayor número
inmigrantes (1,6565) He = 0.6901 y Ho = 05112. La alta variación puede ser debida al cruzamientos entre ellos, la variabilidad
genética incorporada a través plantas voluntarias o al cruzamiento con especies silvestres.`Las poblaciones silvestres y criollas
cultivadas fueron altamente diversas genéticamente, la varianza molecular AMOVA sugirió una variación de 61.38 % dentro de las
poblaciones silvestres/criollos y del 38.62 % entre las poblaciones. Esto significa que todas las poblaciones son diferentes dentro de
ellas a nivel genético aunque algunos individuos pueden tener genotipos similares a otras poblaciones.
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Estructura genética de las especies colectadas. Los análisis “Structure” y correspondencia múltiple confirmaron (ACM) el estatus
taxonómico de las tres especies silvestres colectadas. En el ACM el 93.6 % de la variación (RsQ) explicó la formación de tres grupos
principalmente (M. brachyloba subdividida en dos grupos de acuerdo a su distribución en el occidente y oriente Colombiano, M.
carthagenensis, Manihot cf. tristis) Figura 1 A). En “Structure” (k=6, 10.000) seis grupos principalmente fueron formados: M.
brachyloba, subdividía en dos grupos de acuerdo a su distribución geográfica en el Grupo 1) se asociaron muestras colectadas en
Antioquia (47), Choco (24), Meta (31), Cundinamarca (19) y Caldas (24); Grupo 2) corresponden a M. brachyloba de Casanare (10),
Vichada (16); Grupo 3) M. carthagenensis colectados en Antioquia (42), Magdalena (33) y la Guajira (20). Grupo 4). Criollos
colectados el año 2008 en Casanare (41), Vaupés (55), Amazonia (18). Grupo 5. Criollos colectados obtenidos principalmente de la
Unidad de recursos genéticos del CIAT (URG) colectados en los años 70 y 80. Grupo 6. M. tristis (48) colectada en el vichada (datos
no mostrados). Similares resultados fueron obtenidos por Roa et al., (2000) al caracterizar 66 accesiones silvestres utilizando
marcadores moleculares tipo SSR y AFLPs. Relación de M. esculenta con otras especies del género Manihot. Al incluir otros géneros
cercanos a la yuca cultivada dentro del análisis se puede evidenciar los grupos silvestres brachyloba (BRA), M. carthagenensis
(CTH) y Manihot cf. tristis (TRIS-Col) conservan su identidad taxonómica pero la especie cultivada M. esculenta se asocia
genéticamente con las dos subespecies que presentaron poca diferenciación morfológica con la yuca cultivada (M. esculenta subsp
flabellifolia y M. esculenta subsp. peruviana, grupo FLA-ESC-PER, Figura 1B). Estas presentaron los más altos indicies de
identidad genética con el cultivo I = 0.726 y 0.724 respectivamente. El mayor éxito en la producción de híbridos (35%) se produce
cuando se utilizan M. subs flabellifolia y la yuca cultivada. De esta manera se sustenta que el origen de la yuca cultivada proviene
especialmente de la subespecie M. esculenta subsp flabellifolia (Roa et al., 2000; Olsen and Schaal, 1999). Las muestras de M. tristis,
fue separada en dos grupos en el primero se agruparon individuos M. cf. tristis colectados en Vichada Colombia (Tris Col, Figura 1) y
las accesiones originarias del Brasil URG (grupo Tris B), las cuales se asociaron con M. esculenta y M. esculenta sub peruviana
(Fregene et al.,1994). De otro lado M. brachyloba y M. carthagenensis fueron las especies más distantes del cultivo y presentaron
menores índices de identidad de Nei (1978) (I = 0.282 y 0.167 respectivamente.
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Grupo 1
Dim3
M. Brachyloba (BRA)
4.04
Grupo 3
M. carthagenensis (CTH)
2.40
0.76
-1.24
-0.89
1.60
Grupo 2
Grupo 4
0.64
M. tristis (TRIS COL)
Dim1
1.41
0.08
Dim2
-0.32
-1.28 2.73
1 BRA
2 BRA
3 CTH
4 TRIS
COL
5. ESC
7. TRI B
6. ESC-FLA-PER
Figura 1. A) Análisis de correspondencia múltiple de las accesiones silvestres colectadas. B) Análisis al incluir otras
especies silvestres mediante el programa Structure. Cada Color representa un grupo diferente.
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Producto 3. Tasas de hibridación entre variedades de yuca cultivada.
Variables climáticas, floración y biología reproductiva. Los clones fueron sembrados en Julio de 2010 y los datos meteorológicos
fueron tomados hasta Septiembre 2011. Las plantas cultivadas presentaron características de floración, vigor y viabilidad de polen
adecuadas para permitir un solapamiento en la apertura floral. Los meses de Agosto y Marzo del año 2011 fueron los meses que
presentaron mayor temperatura y radiación solar. Las plantas empezaron a florecer durante el mes de Septiembre y la floración fue
interrumpida durante los meses de Noviembre y Diciembre donde se presentó un incremento en la precipitación de 331. 5 mm y 145
mm respectivamente comparado con el promedio registrados de los 31 años anteriores (107.5 mm y 70.4 mm). En abril también
también se presentaron altas precipitaciones (201.8 mm). No obstante a pesar del fuerte invierno se produjo solapamiento (26%) entre
las flores femeninas del recetor y las masculinas del donador. La viabilidad del polen fue alta para los clones HMC1 (85,2%) y Waxy
(96.3%), mientras que el clon androestéril no registró polen viable, permitiendo la formación de fruto por polen externo. La presencia
de polen en el donador fue favorecida por la relación de 7:1 entre flores masculinas y femeninas. El solapamiento temporal en la
floración y apertura floral ocurrió entre 11:00 a 15:00 horas y el principal visitante floral fue la abeja común Apis mellifera.
Similares observaciones fueron realizadas por Silva et al. (2001) y por el grupo de Brasil dirigido por Carlos Ledo.
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Humedad
Radiación
Precipitación
Radiación
Figura 2B
Figura 2A
Distancia (m)
Distancia (m)
Figura 2C
Figura 2D
Figura 2. A) diseño de campo utilizado en rojo se muestra HMC1 y en verde los receptores androestéril y clon libre de amilosa. B).
Análisis de componentes principales de las variables ambientales. En rojos se muestran los meses con mayor radiación solar, humedad y
precipitación. C) Número de plantas con frutos en el clon androestéril y D). Número de plantas con híbridos detectados por SSRy164.
Figura 2B.
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Tasas de cruzamiento. En el clon androestéril se contabilizaron 20662 frutos y solo el 2.8% de la semilla germinó debido a la alta
esterilidad del clon. Durante la evaluación de flujo se observaron frutos hasta los 40 metros de distancia desde el donador HMC1 hacia
el receptor androesteril y tasas de cruzamiento 14% al 2 % se registraron a 1 y 41 metros de distancia. Estos resultados fueron
modelados utilizando curvas de nivel programa SAS, en donde se observa el número de frutos disminuyó a medida que se incrementó
la distancia (Figuras 2A). El ADN de 580 plantas androesteriles fue amplificado con el marcador tipo SSRY164, los resultados
obtenidos confirmaron la naturaleza híbrida en el 35.2% de las plantas F1, las cuales se registraron a lo largo de 40 metros. Los
individuos que no presentaron plantas adyacentes en los espacios libres (10, 20 y 30 m) fueron las plantas más desarrolladas con el
mayor número de frutos e híbridos por planta ya que no presentaron competencia con otras plantas (Figura 2B). En el clon libre de
amilosa, 1486 frutos fueron colectados, y presentaron una mayor viabilidad de semillas (58%). Un total de 1750 plantas fueron
sembradas y están siendo evaluadas mediante SNPs y SSR, hasta el momento se han registraron tasas que oscilan entre el 6.21 y 7.66
% respectivamente (483 plantas evaluadas). De los 40 híbridos 25 fueron identificados mediante SSR y SNPs; 10 sólo por SSR y 4 por
SNPs, es decir el 75% de los híbridos fueron identificados por los SNPs y el 87,5% por los SSR. La diferencia en el número de
heterocigotos identificados puede ser atribuida por la naturaleza bialelica de SNPs, mientras los microsatélites son de naturaleza
multialelicos. Como era de esperarse los controles emasculados presentaron mayores tasas de cruzamiento 14 % y se comportaron
como una línea androestéril. En progreso se encuentra la evaluación de 1150 plantas. La expresión del fenotipo Waxy será confirmada
mediante la tinción de yodo. Estos resultados indican que debe incrementar la distancia desde la fuente de polen para garantizar
aislamiento reproductivo ya que la distancia reportada por Kawano et al. (1980) y Álvarez y Daza (1985) no son suficientes para evitar
el flujo de polen. Álvarez y Daza (1985) rastreando el polen con polvos fluorescentes reportaron tasas entre el 6 a 22 % en distancias
menores a los 18 metros. Mientras que altas tasas, superiores al 60% de cruzamiento han sido identificadas siguiendo la coloración y la
forma de las hojas (Kawano et al., 1980; Silva et al., 2003). Debido a esta sobrestimación es importante validar las distancias de
siembra con marcadores moleculares. El uso de estos marcadores SNPs pueden ser utilizados en programas de mejoramiento ya que
permite identificar el 75-85% de los híbridos formados en una F1. Otros cambios en el gen GBS I pueden analizarse siguiendo la
metodología descrita en este estudio.

Producto 4. La supervivencia de plantas voluntarias
Una adopción y supervivencia menor del 1 % de plantas voluntarias fue registrada al evaluar 45088 plantas en 22.4 ha de cultivo
comercial de yuca, resultado que indica que el agricultor comercial no selecciona las plantas voluntarias para la próxima cosecha. El
seguimiento de 549 plantas voluntarias en cultivos de yuca en lotes comerciales del Cauca, Valle del Cauca, Costa Atlántico evidenció
un bajo nivel de contaminación por semilla voluntaria ya que el 92.3% de estas plantas fueron eliminadas por selección natural o
durante procesos de limpieza y solo el 0.36 % de plantas fue seleccionado por el agricultor después de la cosecha. Similares resultados
fueron obtenidos por Pujol et al. (2005) en lotes en descansos en los cuales se había dejado de sembrar yuca. La mayoría de plantas
voluntarias encontradas, fueron plantas segregantes con bajo vigor y altura con variabilidad en el contenido de ácido cianhídrico y
materia orgánica, en comparación con las plantas provenientes de clones seleccionados, características que les da bajas probabilidad de
competir con el cultivo
10

CONCLUSIONES


Producto 1 y 2. Mediante el uso de GIS se establecieron modelos de distribución potencial y real de las especies silvestres
que permitieron identificar zonas probables de coexistencia y maximizar recursos en la identificación de especies silvestres.
En ningún momento se debe generalizar la aplicación de estos modelos basados en probabilidades y se debe tener la
cruzabilidad de la especie con el cultivo, la biología reproductiva, factores climáticos y antropológicos. Se deben continuar
con las expediciones especialmente en el Choco, zona altamente endémica que alberga gran diversidad. Se deben calcular
los índices de perdida de biodiversidad, caracterización del nicho ecológico y establecer indicadores o cambios de
diversidad. Los marcadores tipos SSR permitieron discriminar los cuatro grupos taxonómicos utilizados en el análisis de
diversidad, sin embargo es necesario incluir en el análisis mas poblaciones de M. tristis y encontrar poblaciones de otras
especies del genero Manihot. También es necesario determinar como la diversidad esta espacialmente distribuida a través
de las poblaciones dentro de cada especie usando programas como DEMEtics, DAPC, Barrier, también se debe
correlacionar las distancias genéticas con las geográficas mediante el test de Mantel
Producto 3 y 4. Para generar procedimientos adecuados de evaluación de riesgo ambiental, es necesario tener en cuenta: la
característica a evaluar, la capacidad reproductiva y los parámetros de floración y biología reproductiva. También es
importante considerar que el flujo no se produce de una manera homogénea dentro del campo, diferencias en las
características en el suelo pueden influir en el desarrollo de la planta. Se recomienda realizar este ensayo en diferentes
condiciones ambientales con otros clones cultivados, donde los clones estén distribuidos aleatoriamente dentro del campo.
En el caso de yuca es necesario tener un conocimiento del cultivo previo. Es difícil realizar ensayos con una planta
altamente heterocigota, que tiene baja tasa de reproducción por semilla sexual y que principalmente se reproduce por
estacas para mantener la integridad genética. Las evaluaciones de flujo se deben abordar de manera holística donde se
involucre el establecimiento de distancias de siembra y estudio de los silvestres y se estudien el comportamiento de las
semillas sexual, además también se debe conocer el impacto que pude tener la introducción de un gen(s) poblaciones
locales. Desde es punto de vista se podría seguir estudiando los híbridos obtenidos en este estudio en las siguientes
generaciones. Es necesario cuantificar el flujo de genes aunque el sistema de propagación sea por estacas y diferenciarlo de
los eventos de presencia accidental dados por la mezcla de estacas. Se deben utilizar diferentes marcadores moleculares
para confirmar la presencia de flujo de genes. Es necesario comenzar a implementar en campo algunos modelos para la
evaluación de flujo de genes y plantas voluntarias como GeneSys and MAPOD®. En la yuca existen 1190 SNP, que
podrían potencialmente utilizados para la evaluación de flujo de gene. Una tasa de adopción menor al 1% fue encontradas al
evaluar 22.4 ha de cultivo comercial. Este resultado indica que el agricultor no selecciona las plantas para la próxima
cosecha. La metodología de evaluación de plantas voluntarias fue transferida al Brasil y se esta realizando en la región
noreste centro y sur de Brasil.
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BIBLIOGRAFÍA
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2. Cuadro resumen de cumplimiento de objetivos comprometidos en el subproyecto y productos obtenidos
Área Temática: Flujo de genes
Investigador Principal: Luisa Fory
Institución: CIAT
Título Subproyecto: Flujo de genes entre clones cultivados de yuca y sus parientes silvestres y otras especies silvestres de Manihot en colombia
Fecha de inicio
Programada
Efectiva
Fecha de finalización
Programada
Efectiva
Indicadores de resultados por actividad (Productos obtenidos)
Comprometidos
Obtenidos a la fecha
Objetivo 1. Identificación predicción y verificación de zonas potenciales de coexistencia entre el cultivo de yuca y las especies silvestres usando GIS
Actividad 1
Distribución
potencial
Actividad 2
Identificación de
zonas de
Mayo/2009
.Mayo/2009
Mayo/2009
Mayo/2009
Julio 2010
Agosto 2010
Visitas herbarios
Cuatro salidas de Campo
Agosto 2010
Septiembre
2011
Dos zonas de coexistencia
identificadas
Herbarios visitados
Mapas de distribución
Salida de campo realizadas
Zonas de coexistencia
identificadas
Validación del modelo en
14
coexistencia
cuatro salidas de campo
realizadas
Base de datos
interactiva
Agregar líneas si
se requiere
Objetivo 2 Caracterización molecular de especies silvestres mediante SSR
Agosto
Actividad 1.
/2009
Septiembre
Septiembre
Evaluación de
/2009
/2009
marcadores
Actividad 2
Estudio de
diversidad
Análisis
moleculares
Bases de datos 1470 registros
en web
Julio de 2012
Octubre/2009
Enero/2009
Diciembre
/2010
Diciembre
/2011
Evaluación de 100 SSR yEST
7 SSR nucleares seleccionados
3 EST
Cuatros especies caracterizadas
681 accesiones caracterizadas
2012
Dos marcadores putativos para
identificar especies silvestres
Identificación de
Tres marcadores putativos para
marcadores
2009
2009
2010
2012
Identificación de marcadores
rastreas líneas con bajo
específicos
contenido de almidón
91 alelos privados o en baja
frecuencia
Objetivo 3 Determinar la tasa de hibridación entre variedades de yuca cultivada bajo condiciones controladas usando una línea androestéril y
mutantes de amilasa.
Actividad 1
Abril del
Abril del
Propagación del
Abril de 2009
Julio 2010
5700 plantas multiplicadas
Plantas multiplicadas
2009
2010
material
Actividad 2
Abril del
Julio de
Multiplicación y
2011
2011
Ensayo establecido
Invierno daño el ensayo
2009
2010
cruces
Actividad 3
15
Siembra en campo
del ensayo
2011
2011
2011
2011
Ensayo establecido y marcadores
identificados
Ensayo establecido
Cosecha de fruto
Rescate de embriones
Evaluación de 1000 plantas con
marcadores SSR y SNPs
Extracción de ADN 1300
plantas (en proceso de
evaluación)
Evaluación de
flujo. Siembra en
invernadero y
2012
2012
2300 plantas sembradas
evaluación en
laboratorio.
Objetivo 4. Evaluación de plantas voluntarias
Octubre
Diciembre
Actividad 1
Metodología establecida
/2008
/2011
Objetivo 4
Capacitación
Carlos Ledo y
varios
Marzo 2011
investigadores del
CIAT
Capacitación
Metodología de evaluación de
grupo de Costa
Marzo 2012
híbridos resistentes a IMI
Rica
establecida
(1) Tesis de
pregrado
(2) Dos
2010
2012
Tesis en progreso de escritura
estudiantes de
pasantía
Capacitación y
Taller, cursos internacionales
2009
2012
divulgación
realizados, páginas web
Observaciones
(factores que
afectaron la
implementación,
El prolongado invierno y problemas de orden público afectaron el desarrollo de los ensayos en campo
sugerencias para
futuro, lecciones
aprendidas)
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