Download CONVENCIONALES UTILIZADAS COTO REFUG¡O EN CULTIVOS

DETERMINACION DE LA CONTAI$¡NACION TRANSGENICA EN PLANTAS
CONVENCIONALES UTILIZADAS COTO REFUG¡O EN CULTIVOS DE
ALGODÓN BOLGAR@ II.
Trabajo de grado prcsentada como requisito parcial para culminar la
carrera de Ingenieria agronómica
Por
Lady Johanna Moreno Romero
Código: 306100¡14
Tutor: Rodolfo A. tejía Gruz
lNG. AGRONOMO
-
fú.Sc. Biotecnología
Cotutor: William Duarte
lNG. AGRONOIúO
-
M.Sc. Entomologia
Univereidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A
Ingenieria Agronómica
Noviembre - 20ll
UDCA
t. t.r.aral!.
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(
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El autor concede a la Univepidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales
permiso para reproducir este babaio para fines educaüvos.
U'D'C'A
Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientaleo
lngenieria Agronómica
Noviembrc de - 2011
DETERMINACION DE LA CONTAMINACION TRANSGENICA EN PI.ANTAS
CONVENCIONALES UTILIZADAS COMO REFUG¡O EN CULTIVOS DE
ALGODÓN BOLGAR@ II.
Por
Lady Johanna iloreno Romero
Aprobada:
Director de Trabaio de grado
Subdirector
Jurado
Jurado
proceso;
Dedico este trabajo a todas las personas que me acompañaron en este largo
primero que todo a Dios, por permitirme la sabiduría y fortaleza que necesite día a dí4 a
misabuelitosquedesdeelcielohansidolosangelitosquehancuidadodemi,amis
y sus
padres Myriam Romero Torres y Femando Vargas por su apoyo incondicional
y comprensión del
concejos que hicieron de este proceso un tiempo d€ aprendizaje
necesite y por sus
futuro, a mi hermano Diego Andrés por estar siempre hay cr¡ando lo
apoyado en momentos
concejos de hermano mayor, y demiís personas que me han
importantes de mi vida.
Lady Johanna Moreno Romero
AGRADECIT¡ENTOS
Quiero expresar mis más sentidos agradecimientos a todas las personas que
me han acompañado en este gran proceso, desde mis profesores de primaria
hasta los de la secundaria, aquellos que con sus experiencias y enseñanzas
lograron hacer de mí una persona mejor y sobre todo lograron prepararme
para una vida profesional exitosa.
A mis padres porque sé que sin la ayuda de ellos y su constante apoyo hubiese
sido más complicado este proceso, agradezco todo su apoyo en los momentos
donde sentí desfallecer, siempre estuvieron a mi lado, dándome los mejores
consejos y haciendo que aprendiera de la forma más agradable de mis errores,
gracias por recordarme que siempre estarán hay los amo demasiado'
A mi Familia, mis tíos (as), que siempre estuvieron pendientes de mi y de mi
evolución como Profesional.
ya
Al profesor Rodolfo Mejía, quien estuvo siempre en este proceso con mgo
que
todos sus c¡nocimientos, a |os demás docentes de |a universidad UDCA'
me aportaron muchos conocimientos a lo largo de la carrera'
Amiscompañerasdel|aboratoriodeBiotecno|ogíaVegetalporsucompañíay
apoyo.
que hicieron de este
A mis amigas de siempre y compañeros de la universidad
sencillo
proceso la experiencia más divertida de aprender y de ver el futuro más
y llevadero.
amor y
A la personita que llego a mi vida a iluminar mi cam¡no con mucho
más duros de mi vida
felicidad, gracias por tu continuo apoyo en los momentos
y de mi crecimiento Personal-
algún apoyo y
A todas las personas que de uno forma u otra me aportaron
conoc¡miento.
Lady Johanna Morcno Romero
Resumen
t.
lntroducción
il.
Objetivos
1il.
Revisión de literatura
6
3.1. Algodón GM en Colombia
3.2. Regulación colombiana Resolución N" 001681
(28 Mayo 2008).
3.2.'t. Resultados en otras zonas.
8
3.3. Situación actual del algodonero GM en Colombia.
3.4. Algodón con tecnología de Bollgard ll con solución
10
Faena Flex @
3.4.1. Organismo donador genes Cry
10
3.4.2.E|gen Cry1Ac
11
3.4.3. El gen Cry2Ab
11
3.4.4. Organismo donador del gen cp4 epsps
3.4.5. Cantidad de proteína total de cada gen
't1
12
3.4.5.1. Hojas jóvenes Y semilla
13
3.4.5.2. Planta entera
13
3.4.5.3. Néctar Y Polen
13
3.4.5.4. Cry2Ab' GUS
13
3.4.6. Persistencia de la proteína Cry1Ac y Cry2Ab
Ambiente.
14
3.5. Potencial de polinización ctuzada
t6
en
el medio
3.5.1. Floración y polinización del algodón'
3.5.2. Casos de importancia de polinización
17
18
cruzada en el mundo
3.5.2.1- Semillas de algodón
contaminadas Por
Pof
inización cruzada Grecia-
18
2000.
9.5.2-2. Siembra ilegal de algodón
transgénico India- 2001
19
19
3.6. Bioseguridad
19
3.6.1. Legislación intemacional.
3.6.1.1. Unión EuroPea.
20
3.6.1.2. Estados Unidos
21
3.6.2. Legislación nacional.
22
3.7. Flujo horizontal y vertical de genes.
23
3.7.1 . lmpacto ecológico de la hibridación cultivo
/
Maleza
25
Riesgo.
3.7.3. Protocolo de Cartagena
3.7.3.1. Objetivo
3.7.3.2. Articulo 11.
3.7.4. Normas de Etiquetado.
26
3.7.2. Análisis de
28
29
29
32
3.8. Metodología para la determinación de la toxina
33
Cry'lAc.
35
3.8.1. PCR
36
3.8.1. 1. Electroforesis
3.8.2. ELISA
36
3.8.3. LIOFILIZACION
37
38
3.9. REFUGIO
3.9.1. Fenómeno de la resistencia.
3.9.2. PLAGA DEL ALGODÓN DE IMPORTANCTA
ECONOMICA (Heliothis vircscens)'
39
40
41
lV. Materiales y Métodos
4.1. Localización.
41
4.2. Material vegetal.
44
4.3. Recolección de material vegetal para la determinación
de la contaminación en lotes refugio
4
4.4. Análisis de las muestras laboratorio
47
4.4.1. Determinación de la contaminación génica
oor
ELISA
48
muestras
prueba
4.4.1.1. Preparación de las
4.4.1.2. Metodología de la
4.4.1.3. Lec{ura de la concentraciÓn
de la proteína
49
49
4.4.2. Cor¡oboración de la contaminación por pruebas
Moleculares
4.4.3. Análisis de la información
53
il
55
V. Resultados y Discusión
5.1. Distribución de la contaminación
55
Parcela 1 a los 80 días
55
5.1.2. Parcnla 2 a los 80 días
58
5,1.3. Parcela 'l a los 120 días
61
5.1.4. Parcela 2 a los 120
64
5.1 .1 .
5.2. Distribución del lote refugio e influencia en el flujo
Génico
66
5.3. Concentración de toxina CrylAc en semillas
hibridadas de lotes
refugios-
71
Vl. Conclusiones
Vll. Recomendaciones
78
Vlll.
Bibliografia
80
lX.
Anexos
90
INDICE DE FIGURAS
79
Figura
1. Descripción de la situación
del Algodón GM en Colombia desde el
año2002 hasta el 2010
Figura 2. Mapa geográfico del municipio de Flandes Tolima.
Figura 3. Situación de siembra GM- Flandes Tolima
Figura 4. Orientación del lote
Figura 5. Metodología de camPo.
Figura 6. Fotos procedimiento ELISA
Figura 7. Contaminación génica en plantas de lote refugio según la distancia al
lote genéticamente modificado
Figura 8. Porcentaje de contaminación de plantas con Bt, según el
distanciamiento
en
metros
al
lote GM.
Figura 9. Distribución de la contaminación en los diferentes surcos evaluados.
Figural0.Contaminacióngénicaenp|antasde||otedosrefugiosegún|a
distancia al lote genéticamente modificado'
Figurall.Porcentajedecontaminacióndep|antasconBtene||otedos,
según el distanciamiento en metros al lote GM'
evaluados'
Figura 12. Distribución de la contaminación en los diferentes surcos
según la
Figura 13. Contaminación génica en plantas del lote dos refugio
distancia al lote genéticamente modificado
'
Figura14.Porcentajedecontaminacióndep|antasconBtene||otedos'
línea de
según el distanciamiento en metros al lote GM' con su
tendencia-
FiguralS.Distribuciónde|acontaminaciónenlosdiferentessurcoseva|uados.
Figura 16. Contaminación génica en plantas
del lote dos refugio según la
distancia al lote genéticamente modificado
plantas con Bt en el lote dos' según
Figura 17. Porcentaje de c¡ntaminación de
el distanciamiento en metros al lote GM, con su línea de tendencia.
Figura 18. Distribución de la contaminación en los diferentes surcos evaluados.
Figura 19. Porcentaie de plantas hibridas, en los dos lotes y las dos fases.
Figura 20. Vectores de polinización que contribuyen al flujo génico de plantas
GM, a las plantas convencionales del lote refugio
Figura 21. Ubicación del lote refugio con respecto al lote GM Bollgard ll
Figura22. Concentración promedio de toxina cry1Ac en semilla hibridada entre
plantas
de
Bollgard ii@ y Nuopal localizada en lote refugio uno'
Figura 23. Elec'troforesis del material evaluado.
INDICE DE ANEXOS
Anexo
1
.
Resultados Concentraciones: ANOVA Fase 1 Lote 1; Prueba T.
Anexo 2. Resultados Concentraciones: ANOVA Fase 2, lote 1; Prueba T.
Anexo 3. Resultados Concentraciones: ANOVA Fase 1, Lote 2; Prueba T.
Anexo 4. Resultados Concentraciones: ANOVA Fase 2, Lote2; Prueba T.
Anexo 5. Resultados Concentraciones: ANOVA Concentraciones totales
Anexo 6. Resultados prueba T para Lotes
Anexo 7. Resultados prueba T para Fases
Anexo 8. Resultados prueba T para Distancias en metros'
Anexo 9. Resultados prueba T para Distanc¡as en metros'
RESUTúEN
La siembra de lotes refugio en cultivos de plantas modificadas genéticamente
se recomienda para dism¡nu¡r la resistencia de los insectos plaga a
estas
plantas. Esta investigación pretendió evaluar la contaminac¡Ón genét¡ca con
polen transgénico Cry1Ac y su incidencia en la resistencia de insectos plaga en
los lotes refugio del algodonero transgénico, determinando la presencia de
toxina cry 1Ac en los órganos reproductivos del algodonero convencional,
estimando los porcentajes de hibridación en semilla F1. El material vegetal fue
colectado en el municipio de Flandes (Tolima), de dos lotes refugio en sistema
96:4 (variedad Nopal), distantes un metro de los lotes transgénicos en prueba
semi-comercial
de
Bollgard@
ll y
Roundup Ready Flex@,.
se
evaluaron
semillas hibridadas provenientes de cápsulas colectadas de cinco surcos. De
cada surco se tomaron diez plantas, distantes un metro entre si, en dos
momentos del cultivo; como muestra contrastante, se analizaron las hojas de
las mismas plantas evaluadas. Para el análisis, se empleó el kit ELISA
"Envirologix Qualiplate para Cry1Ab/Cry1AC. En
el
refugio, lote uno' se
En
encontró un 60% de contaminación con cry1Ac y un 760/o en el lote dos.
todos los surcos evaluados, se detectó semilla híbrida con presencia del cry'
sinembargo,nosepresentóunare|acióndirectaentre|ahibridaciónde|as
entfe estos
olantas convenc¡onales con las plantas modificadas y la distancia
de capsulas
lotes- Se puede inferir que los insectos plaga que se alimentan
hibridasconcontaminacióngenéticaenlos|otesrefugio'aumentan|osproceso
de la resistencia genética.
INTRODUCCION
Los cultivos transgénicos no representan la solución mágica para alimentar a la
humanidad. Pero ciertamente ayudarán ya, que son parte integral del proceso
continuo del mejoramiento genético de los cultivos, razón por la cual no se
debería rechazar esta tecnología, como pretenden algunos, sin conocer un
poco mas de ella, para considerar sus aspectos de mejora (Sdcma' 2009)'
Para asegurar un adecuado aprovechamiento de esta tecnologla novedosa, las
plantas modificadas genéticamente tienen que ser manejadas apropiadamente'
para evitar que las plagas, contra las cuales se dirige el cultivar, adquieran
rápidamente resistencia.
Es el caso
del
control del bellotero Heliothis
lo
w'rescens, cuyas dosis letales medias (DL) no ha variado sustancialmente,
cualmuestra|aausenciadeunaumentoen|aresistenciaa|Cry1Ac'
por
incorporado al algodonero GM (Monsanto, 2001)' El manejo recomendado
no ha sido
la casa comercial productora de semillas de dejar refugios, aunque
acatadoenunl00%de|oscu|tivadoresde|afibra,aparentementehadadoun
en los estudios
resultado positivo en el retardo de la resistencia' Sin embargo
genes que ocure entre las
no se considera la importanc¡a del flujo vertical de
siembras de algodonero transgénico
y los lotes refugio en nuestro país'
y
la dilución de la
aunque se conoce lo importantes que son estos lotes en
contaminación génica que
resistencia genética, no se conocen datos sobre la
puedeexistiren|ostejidosquesehibridanmedianteflujogenéticoconp|antas
GM'nitampocosehaestab|ecido|aincidenciadelaubicaciónespacialde|os
refugios en la tecnología transgénica y su papel en la diluciÓn de la resistencia
por parte de los insectos plaga (ArgenBio,2007).
El flujo de genes se ha explicado como el intercambio de genes (en una o
ambas direcciones)
a
baja velocidad entre poblaciones de organismos
relacionados y sexualmente compatibles, pero distintos. Este intercambio de
genes resulta de la dispersión de las élulas reproductoras maduras, también
denominadas
élulas sexuales o gametos (castro, 2005). En las plantas,
el
flujo de genes suele darse a través de la transferencia de polen proceso m¡smo
quesubyacea|atransferencianaturaldegenesdep|antasgenéticamente
modificadas
a sus parientes silvestres. Por eso es que el flujo de genes'
también denominado migración de genes, es considerado por muchos autores
como
una amenazaa
la diversidad de las variedades nativas. sin embargo no
sehatenidoencuentacuandoocurrebajoe|mismocu|tivoentreespecies
modificadasy|asconvenciona|esqueseencuentranenlos|otesrefugios
(Castro, 2005).
para disminuir la
Los lotes refugio se han considerado como espacios utilizados
que las plantas sembradas en estos
Dres¡ón de selección en el insec{o plaga ya
|otestienencomopropósitoretardaroevitar|aaparicióndeindividuos
generando suficientes
resistentes, allí la plaga se desanolla en forma normal'
cantidadesdeindivicluossusceptib|esenformamuysuperiora|osresistentes'
que se controlan de forma efectiva
lo que genera descendencias de individuos
con la toxina Cry 1Ac (Castro' 2005)'
Los cultivos genéticamente modificados en Colombia ingresaron desde el año
2000, con la aprobación del clavel azul; con esto el pais ingresó a la lista de los
países que utilizan los cultivos genéticamente modificados. A partir de ese año,
se dio un salto hacia la modernidad y se comenzó un recorrido por el camino
de la biotecnologia. En el año 2003 fue aprobado el algodón GM y, en el2OO7
'
el maíz GM (Agro Bio, 2009).
En Colombia, los cultivos de algodón GM aprobados son:
+
Tolerante al herbicida glifosato o RR
$
Resistente a insectos o Bt "Bollgard@.1
y
Bollgard@ 2" (Agro Bio'
2009).
los
Durante los primeros once años de comercialización de los cultivos GM
en 34
agricultores alrededor del mundo han aumentado su ingreso económico
mil millones de pesos. como resultado de las mejoras genéticas los cultivos
aumentansuproductividady|osagricu|toresquelasuti|izanaumentansus
ingresos económicos (Agro Bio' 2009).
EllnstitutoColombianoAgropecuariolCA,encabezadoporlasubgerenciade
protección
y
regulación agrícola;
en uso de sus facultades como
entidad
de las variedades de
regulatoria, es la encargada de realizar las evaluaciones
semillasGM,que¡ngresanalpaís,enelcasodelatecnologíaBollgargll@'
sobre la evaluaciÓn
realizaron el s¡gu¡ente ensayo: Ensayos semicomerciales
de la tecnología conjunta
bollgard@
+
roundup ready en
el cultivo del
alto magdalena y valle del
algodonero en las subregiones naturales valle del
€u€,
evento en
garantizan que
el cual los resultados de
el flujo de polen de
bioseguridad que obtuvieron
algodón
a
otras variedades
es
estadísticamente no significativo y que no existe un impaclo de la tecnología
Bollgard@ sobre insectos no blanco de la tecnología (artrópodos
y anélidos'
entre otros). Estos resultados han sido c¡nfirmados por las evaluaciones semicomerciales de la tecnología Bollgard@ en las zonas agro ecológicas del caribe
Húmedo, seco e Interior del país y por los cultivos comerciales efec'tuados en
las zonas del Garibe Húmedo, caribe seco e Interior del país, Tolima, Huila y
Valle del Cauca.
Teniendo en cuenta que en nuestro país los cultivos GM han tenido grandes
de
debates por falta de conocimiento de las tecnologías y la mala transferencia
información de parte de las empresas dueñas de las semillas, los agricultores
notienen|asayudasparaimp|ementarcorrectamentesuscu|tivos
por
desconociendo así la implementación de todas las normas de bioseguridad,
lo general las empresas se
extensiones, dejando
preocupan
por los agricultores de
grandes
de lado a los pequeños minifundios' que también
bioseguridad
siembran semillas con tecnología; aunque en los estudios de
mostradosanteriormentenoarrojanresu|tadossignificativos,noseeva|uó|a
importanciadelainteracciónde||oterefugioydeelsembradoconsemi||as
para el manejo de plagas en
GM, razón que se considera de vital importancia
estatecno|ogía,por|oqueseproponeen|apresenteinvestigación,.Determinar
la
contaminación transgénica
en plantas convencionales utilizadas
refugio en cultivos de algodón Bollgard ll@''
como
t.
oBJETIVOS
A. OBJET¡VO GENERAL
*
Determinar
la contaminación transgénica en plantas convencionales
utilizadas como refugio de cultivos de algodón Bollgard@'
b. OBJETIVOS
{!
ESPECIFICOS
de
Determinar la presencia de toxina Cry1Ac en órganos reproductivos
algodón convencional provenientes de los lotes refugio'
tEva|uar|osporcentajesdehibridaciónensemi||aFlprocedentesde
plantas refugio.
{
Determinar
la
presencia
de la toxina Cry1Ac en lotes refugio
transgén¡co'
dependiendo de su ubicación en los campos de algodonero
II.
REVISION DE L¡TERATURA
3.I. ALGODÓNERO BOLLGARD EN COLOÍUIBIA
cuando el Bt fue introducido al mercado, se le presentó como la promesa que
reduciría la dependencia de los pesticidas (Principal costo incunido en la
producción), obteniendo
un uso
moderado
de
agroquímicos, mejores
y
rendimientos, nuevas henamientas para manejo y control de plagas, malezas
enfermedades, posibilidad de cultivar plantas
en ambientes extremos y
en
suelospobres,entreotros;además,mejorcontenidonutricionalymayor
calidad del producto final (Knaak & Fiuza' 2006)'
que
según Knaak & Fiuza, 2006 con la aplicación de técnicas alternativas
permitieron modificar las características genéticas del algodón de una forma
dirigida (ADN recombinante), para mejorar
res¡stentes
a
insectos
y a herbicidas
u
obtener nuevos productos
principalmente'
la situación de los
como de producción'
agricultores en el país tendría mejoras tanto económicas
H' zea (Boddie)' así
Las variedades de algo<lón Bt no ejerce control sobre
como el control que si elerce
en
H- vi¡escens y Plutetta gossyprella' puede
para apoyar el control
requerir de aplicaciones de insecticidas tradicionales
ejercidopor|ap|antatransgénica,cuandolasinfestacionesdeestasplagas
puede exceder el umbral de daño económico (Kaiser'1996)'
que tienen los cultivos que han sido
Según Blanco, 2008, el efecto tóxico
contra insectos es et
modificados genét¡camente para hacerlos resistentes
resultado de una proteína cristalizada (Cry) que se expresa en el tejido de la
planta. Las proteínas Cry son selectivas para ciertas clases de insectos y
requieren condiciones específicas para tener
el efecto tóxico.
Primero, la
proteína debe ser ingerida (Blanco, 2008). Esto sucede cuando el insecto come
del tejido de la planta que expresa esta proteína. El pH del sistema digestivo
debe ser 9.5 o mayor y deben existir receptores específicos dentro del intest¡no
para que la protelna se enlace. Es por ello que ciertas cepas de Bf no son
de
toxicas para la mayor parte de los organismos, incluyendo a otras especies
¡nsectos.En|osanimalesquenosoninsectose|sistemadigestivoesácido,
conunpHmenoresde2noexistenreceptores@n|osque|aproteínapueda
en|azarse,por|otanto,desdee|puntodevistade|atoxicidad,e|Efresu|ta
seguro (Blanco, 2008).
de transporte de
Así también se realizaron ensayos para estimar la distancia
lca en
polen. Las pruebas se realizaron en los centros de investigación del
NataimayPalmira.ParalaregiónCaribe,ellCAautorizóensayos
semicomerciales (Agro bio' 2009)'
3.2. Regulación colombiana RESOLUC',ÓN No' @1681
128
tAY
2008)
algodón con la tecnología
Esta resolución autoriza siembras comerciales de
(15985) x (88913) a la empresa
conjunta Bollgard ll / Roundup Ready Flexr@
Bayer CroPScience S.A.
En|aduodécimasesiÓnde|ComitéTécnicoNaciona|deBioseguridad,
del cual hacen parte los Ministerios
CTNBio, realizada el 26 de mazo de 2008'
1
de Ambiente, Vivienda
Agricultura
y
y
Desarrollo Tenitorial; de
Desarrollo Rural; Colciencias
realizada por
el
representante legal
la Protección Social;
y el lCA, se
analiz'ó
la
de
solicitud
en Colombia de la empresa
Bayer
cropscience s.A., en donde se tuvo en cuenta los resultados de los estudios
de Bioseguridad que se realizaron en colombia con el evento
Bollgard ll
/
combinado
Roundup Ready Flex (15985) x (88913), en las diferentes zonas
agroecológicas del alto Magdalena, Valle del cauca, caribe húmedo, caribe
seco
y
Orinoquia colombiana los cuales sugieren que el evento c¡mbinado
Bollgard
ll / Roundup Ready Flex (f 5985) x (88913) es tan seguro como su
que se debe recomendar
contraparte convencional y por c¡nsenso se concluyó
a|lCAautorizar|aso|icitudrealizadapor|aempresaBayerCropScienceS.A.
que contengan el
en el sentido de evaluar agronómicamente sus genotipos
evento combinado Bollgard
ll / Roundup Ready Flex (15985) x (88913) y
se
pueda así realizar siembras con este material'
3.2.1. Resultados en otrag zonas
cTNBio'
En la octava sesión del comité Técnico Nacional de Bioseguridad'
rea|izadae|6dejuniode2ooT,sepresentaron|osresu|tadosobtenidosen|os
estudiosdebioseguridadrea|izadosene|a|toMagda|enae|va||egeográfico
de
del Río Cauca, habiéndose encontrado que los datos disponibles
los
del alto Magdalena y Valle del
estudios desarrollados en las zonas algodoneras
Caucapermiteninferirqueelalgodóncontecno|ogíaconjuntaBo||gard@||i
para el medio
posee riesgos comparables o menores
Roundup Ready Flexr@
ambiente que el algodón convencional
8
Según Resolución ICA (2008), en
Nacional
la novena sesiÓn del Comité Técnico
de Bioseguridad, CTNBio, realizada el 18 de julio de 2007'
presentaron
los resultados obtenidos en los estudios de
se
bioseguridad
realizados en caribe húmedo, caribe seco y orinoquia, habiéndose encontrado
que no hubo efecto negativo de la variedad en estudio sobre
el
agroecosistemas donde se desanollaron los estudios'
según Resolución lca (2008), en las diferentes zonas agroecolfuicas del alto
Magdalena, Valle
del Cauca, Caribe húmedo, Caribe seco y
Orinoquia
colombiana los cuales sugieren que el evento combinado Bollgard ll / Roundup
Ready Flex (15985) x (88913) es tan segufo como su contraparte c¡nvencional.
3.3. SITUACION ACTUAL DEL ALGODÓNONERO GT EN COLOMBIA
En el 2010, se sembraron 37.657 hectáreas de algodón GM' Los años
anteriores,e|a|godónhabíasidoe|principa|cuhivogenéticamentemodificado
que se siembra en el país, sin embargo en el 2009 se sembraron 18'784
hec'táreas para
hectáreas, lo que representa un aumento de más de 18 mil
2010 (figura 1) (AgroBio' 2010)
Figura. 1. Situación pasada y actual del algodón GM en Colombia. Tomado de
de Agro bio, 2010.
3.4.
ALGODÓN CON TECNOLOG¡A DE BOLLGARD II CON SOLUCIÓN
FAENA FLEX@
herbicida Faena
Incorpora dos tecnologías en la misma semilla: La tolerancia al
FuerteconTransorb@parae|contro|dema|ezasy|atecno|ogíaBo|lgard||@
para el manejo de plagas (Monsanto ,CO, 2009)'
3.4.1. Organismo donador genes Cry
Esta bacteria habita
El organismo donador es la bacteria Bacillus thuringiensis.
(endotoxina) que actúa
de manera natural en el suelo y produce una proteína
al destruir su sistema
específicamente sobre las larvas de insectos lepidópteros
digestivo (BaYer S.A' S.F.)'
10
3.4.2. Elgen CrylAc
Contenido dentro del vector PV-GHBKO4
fue construido combinando
los
primeros 1398 nucleótidos del gen cry1Ab (correspondientes a los aminoácidos
1 a 466) (Fischhoff
et al., 1987) con los nucleótidos número 1399 a 3534 del
gen crylAc (conespondientes a los aminoácidos 467
a
'1178) (Adang ef a/''
1985). La proteína producida por este gen se clasifica como CrylAc, ya que si
bien es el resultado de la fusión de dos porciones de proteínas cry diferentes,
la mayoría corresponde a la proteína Cry1Ac (Bayer S'A')'
3.4.3. El gen Cry2Ab
del
Este gen es el evento Bollgard ll es una versión optimizada sintéticamente
gen
de
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. La optimización fue nec€sar¡a
para proveerle al gen las secuencias reguladoras que perm¡tieran su expresión
en la planta de algodón. La proteína Cry2Ab tiene un tamaño de
aminoácidos, con una masa aproximada
de
7',1
633
kDa (Whiteley, 1990). se
introdujoademásunaminoácidoadiciona|paracrearunsitiodeclivajepara
proteína Cry2Ab está
una enzima de restricción con fines de clonado' La
presente como un producto estable en las plantas de algodón transgénico
(Bayer S.A, S.F.).
3.4.4. Organismo donador del gen cp4 epsps
gen cp4 epsps codifica la
Es la bacteria Agrobacterium sp. cepa cP4, el
síntesisde|aenzimacP4EPSPSqueesnatura|menteto|erantea|herbicida
Roundup@. El mecanismo de acción de Roundup@ consiste en la inhibición
competitiva
de la enzima 5-enolpiruvil shikimato'3-fosfato sintasa (EPSPS).
Esta enzima es esencial en
(triptófano, fenilalanina
y
la
producción
tirosina) en
la rrlta
de
aminoácidos aromáticos
metabólica del shikimato en
plantas. Cuando las plantas son tratadas con Roundup@, ristas no pueden
producir aminoácidos aromáticos necesarios para su supervivencia. Por lo
tanto, la aplicación de este herbicida puede afectar plantas no blanco y se
deben tomar todas las precauciones durante la aplicación para evitar la deriva
del producto hacia especies de plantas deseables (Resolución lca, 2008).
Para determinar la estabilidad del evento Bollgard
ll
por generaciones, se
de
realizaron una serie de testeos de progenie en base a ELISA de Cry2Ab
cuatro generaciones. La signiftcancia estadística para los datos de segregación
se determinó utilizando un análisis de Chi cuadrado (Bayer S'A, S'F )'
3.4.5. Canüdad de probína total de cada gen
CrylAc,NPTll,AAD,evaluaronlosnivelesdeproteínasexpresadas(Cry1Ac'
3-6 semanas) y
NPTII y potencialmente AAD) en hojas jóvenes (plántulas de
blot' Además' se
tejido de semilla utilizando los métodos de ELISA y Western
reco|ectaronp|antasmadurasjustoantesdeladefo|iaciónycosechapara
establecer
la
crecimiento
y
cons¡stencia
de la expresión a través de la estación
para estimar la cantidad de proteinas Cry1Ac
podrían llegar
a
ingresar
y
NPTII que
al medio ambiente al final de la estación
t2
de
de
crec¡miento. La expresión de la proteína CrylAc también se evaluó en néctar y
polen de la línea Bollgard ll (cultivada en invernadero) (Bayer S.A' S.F.).
3.4.5.1. Hojas ióvenes
y
Semilla: los datos muestran que las proteínas
cry1Ac y NPTII se expresan a niveles extremadamente bajos y relativamente
constantes en hoia y semilla de algodón Bollgard ll (menos de 2 pg/g de peso
secodeCrylAcymenosde4pg/gramodepesosecodeNPTI|enhojayteiido
de la semilla, respectivamente). Tal como se predijo, no se detectó AAD ni en
hoja ni en tejido de la semilla de la línea Bollgard (Bayer S'A' S'F )'
g'4'5.2.P|antaenbra:|osnive|esdeproteínasCrylAcyNPT||entejidode
plantas enteras fueron mucho menores, en base a peso fresco, que en tejido
concentración
de hojas jóvenes. Las proteínas cry1Ac y NPTII presentaron una
en la
de aproximadamente 0.044 y 0.57 Ug/g de peso fresco (respectivamente)
línea de algodón Bollgard madura (Bayer S'A' S'F )'
3.4.5.3. Néctar
(1
y Polen: los niveles de proteína CrylAc
medidos en polen
de néctar)
1.5 ng/g peso fresco de polen) y néctar (<1'6 ng/g peso fresco
fueron extremadamente bajos (Bayer S'A' S'F')'
3.4.5.¡1. Gry2Ab, GUS
nuevos de hojas
Se evaluaron los niveles de proteína Cry2Ab en brotes
recolectados durante
y
la estación de crecimiento' planta completa' polen
semi||adealgodónuti|izandométodosdeEL|SAvalidados.sedetectó|a
en varios tejidos
Cry2Ab en el evento Bollgard ll en niveles bajos
proteína
vegetales var¡as veces a lo largo de la estación de crecimiento. Los niveles de
proteína Cry2Ab en hojas jóvenes fueron consistentes en todos los lotes y
localidades, con un rango que varió entre 20,'t
a 33,3 pg/g tpf (total
peso
fresco) En tejidos de planta entera, los niveles medios de proteína Cry2Ab
t
- 10'46 ¡tg/g'
No se detectó proteína Cry2Ab en la línea control DP50B o DP50 no
fueron 8,80
1,2 ltgtg tpf, con un rango entre localidades de 7,28
transgénica.
En polen, la proteína cry2Ab no fue detectada por sobre el límite de detección
del ensayo (0,25 Ug/g) en ninguna localidad en ninguna de las muestras
testeadas o control (Bayer S-A, S.F.).
3.4.6. Persistencia de la proteína GrylAc y Cry2Ab en el medio ambiente
se
determinó el destino en el ambiente de la proteína
crylAc midiendo la
cuando la
velocidad a la cual se disipa la bioactividad de la proteína cry1Ac
de
misma es adicionada al suelo como proteína pura y como un componente
tejido de algodón resistente
a insectos (West, 1984)' La bioactividad de la
proteínaCrylAcpurificadasedisipaconunavidamediaestimadade9'3a
proteína crylAc
20,2 dias, dependiendo de la dosis La bioactividad de la
adicionada
al suelo como 0.01 g /polvo de tejido/ g de suelo seco
como
componentedelalgodónBollgardll,sedisipaconunavidamediaestimadade
proteína Cry1Ac se
41 días. Los resultados de este estudio sugieren que la
en 41 días) cuando la
degradará fác¡lmente (con una vida media estimada
misma es inconcorada
al suelo como un componente postcosecha de
14
las
plantas de algodón. La vida media medida de la proteína CrylAc purificada en
el suelo es comparable a la medida para preparaciones microbianas de
B.
thuringiensisvar. Kurstaki Núest, 19&4; Pruelletal.,1980) (BayerS'A' S.F.)'
se
realizaron observaciones sobre las características agronómicas, de
enfermedades y susceptibilidad a plagas del evento Bollgard ll por tres años en
más de 200 ensayos en campo en los Estados unidos, además de numerosos
estudios
en invernadero y laboratorio. Todos los parámetros
medidos del evento Bollgard
agronómicos
ll se encuentran dentro del rango normal de
variabilidad observado en variedades de algodón convencionales, salvo la
diferencia intencional en el control de insectos lepidópteros. No se esperan
impactos en el medio ambiente que pudieran derivar de la liberación del oGM
en el sitio específico más allá del impacto deseado sobre los
¡nsectos
lepidópteros (BaYer S.A, S.F.)
ConrespectoalaproteínaCry2Ab,serealizaronobservacionesextensivasde
se realizó
insectos durante los ensayos de los años 1998 y 1999. El monitoreo
de
en forma semanal desde la aparición de las infestaciones de larvas
virescens'
lepidópteros. Los insectos blanco monitoreados fueron H'
frugipeda' Spodoptera
Helicoverpa zea, Pectinophon gossypietla, Spodoptera
Trichoplusia ni' Lygus
exigua, Spdoptera omithogotli, Psuedoplusia includens'
lineolaris (BaYer S.A' S.F.)'
3.5. POTENCIAL DE POLINIZAGóN CRUZADA
15
"outcrossing" puede definirse como la
Ef potencial de polinización c¡uzada o
habilidad de los genes de escapar hacia parientes silvestres del algodón' El
flujo de genes puede ocurrir de manera vegetativa, por semilla o por polen' La
propagación vegetativa es poco común para el algodón igual que la dispersión
de semillas por viento y animales (Bayer S.A, S.F.). No hay barreras genéticas
entre de algodón modificado genéticamente cultivado y los campos vec¡nos
de
algodón convencional.
El polen de algodón es grande y pegajoso y el
viento es la tasa de dispersión más baja. La mayoría del algodón se
los
autopoliniza por el tipo de flor, y los cruces se producen como resultado de
insectos, en particular, las abejas. (McGregor' 1976)'
la
El alcance del flujo de genes dependerá del tipo de insectos polinizadores'
proximidadde|oscamposdea|godónGMa|ano-GM,|adirecciónde|vientoy
|afuezayaqueestoafectaa|ospatronesdevue|ode|osinsectos,asícomo
otrosfactoresambienta|estalescomoe|paisaje.Laseparaciónfísicamediante
es el principal
el uso de distancia o de zonas de amortiguam¡ento en el algodón
génica (Pesticide' 2002)'
método de reducción del riesgo de contaminación
en polinización de algodón
En resumen se pueden citar como elementos claves
los siguientes:
La auto-polinización es la regla general en el algodón'
pesados' y de material viscoso
Los granos de polen son relativamente
de el
por lo que el viento no es un factor en la polinización cruzada
algodonero.
La polinización cruzada en el algodón puede variar de cero a 20 por
c¡ento.
Muchos insectos son atraídos por las flores de algodÓn, y son activos
en la polinización cruzada (l-Kisan, S.F.)
3.5.I.
FLORAGIÓN Y POLINIZACIÓN DEL ALGODON
Las flores del algodonero son hermafroditas; nacen en las axilas foliares a lo
largo de las ramas fructíferas- cada rama puede producir hasta 10 botones.
cada flor está compuesta por un cáliz tubular, ligeramente pentalobulado,
corola de cinco grandes pétalos que son de color blanco cremoso por las
mañanas, color que cambia gradualmente
a
púrpura, después
de
ser
fecundada.E|gineceoestáformadoporunovariosúpero'contresacinco
caroelos unidos cada uno con dos
a siete óvulos; el estilo termina en un
la base del
estigma lobulado. El androceo es un tubo corto que se inicia en
gineceo envolviéndolo, dando origen
-
en toda su longitud' a estambres
(Bayer S'A' S'F )
filamentosos que term¡nan en anteras bilobuladas
Cada botón floral está protegido por tres
a
cinco brácteas triangulares
formando|oqueseconocecomúnmentecomocuadros.Lasbrácteaspersisten
emerge la corola de
hasta la maduración del fruto. Un día antes de la antesis
y ocurre la liberación de
los cuadros, en el día de la antesis la corola abre
polinización
polen. El algodÓn, 'se considera una especie cleistogama' La
la flor'
poc€ls horas de la mañana del día de la apertura de
ocurre durante unas
de la antesis y más tarde se
La corola se torna de c¡lor rojo un día después
cae de la planta. El periodo de floración puede ser de 20 días en promedio
(Bayer S.A, S-F.).
3.5.2. CASOS DE IMPORTANCIA DE POLINIZACIÓN CRUZADA EN EL
MUNDO.
3.5.2.1. Semillas de algodón contaminadas por polinización cruzada
Grecia.
y
Greenpeace tomó muestras de semillas de algodón vendidas en Grecia las
envió al Laboratorio GenScan en Freiburg, Alemania para su análisis. Dos de
las siete muestras se encontraban contaminadas. Las muestras de semillas
proveníandeMississippiyArizonadondecercade2/3de|a|godónproducido
fuetransgénico.Másde18.000hadea|godónp|antadoconsemi||as
(Greenpeace'
contaminadas con transgénicos tuvieron que ser destruidos
1997).
2001
3.5.2.2.Siembra ilegal de algodón transgénico India-
de algodón transgénicas
10.000 ha plantadas ilegalmente con semillas
Cerca
de
ilegalmente
10.000 hectáreas de algodón transgénico fueron
por la compañía Navbharat' Se
cultivadas en India, con semillas vendidas
se produjeron por el cruce de variedades
estima que las semillas
estadounidenses transgénicas
de
algodón
y
variedades locales' Los
agricultores fueron informados para eliminar sus cultivos
cosechas de
de
algodÓn
la aprobación oficial para ser plantadas en
algunos
algodón fueron destruidas. En
transgénico tuvieron
y las
el
2002, algunas variedades
estados de India, sin embargo cultivos ilegales de variedades no aprobadas en
este país continúan (Greenpeace, 1997).
En Colombia, más de 700 solicitudes para pruebas en €mpo con organ¡smos
transgénicos fueron aprobadas hasta
20M,la mayoría se referían a variedades
vegetales con tolerancia a herbicidas o resistencia a insectos. En el caso del
algodón GM, la solicitud para su cultivo fue realizada por
la
multinacional
Monsanto Colombia Inc (AgroBio, 2009).
3.6. BIOSEGURIDAD
3.6.1. Legislación intemacional'
países para la elaboración
La FAO pone su larga experiencia al servicio de los
de leyes eficaces y a
de políticas agrícolas, así como para ayudar a la reacción
las metas del desarrollo
diseñar estrateg¡as nacionales con el fin de alcanzar
que maneja mundialmente
rural y la reduc¡ión de la pobreza' Esta es la entidad
vigila constantemente
todo lo respectivo de seguridad alimentaria y además
estén cumpliendo'
oue todas las normas respecto a los OGM se
Ademásde|aFAocadapaísocontinenteposeeentidadesquevigi|any
maneio de la bioseguridad
proporcionan la normatividad específica para el
integral de sus Países.
3.6.1.1. Unión Europea.
La primera legislación comunitaria sobre OGM se aprobó al inicio de los 90 y' a
través de la última década, el marco normativo se ha ido ajustando y refinando.
Actualmente, la directiva que rige es la 90l22OlCE, la cual ha sido modificada
por la directiva 2OO1l18 /CE, que entró en vigencia el 17 de octubre del
2OO2
(Agrobio, 2011).
La normativa vigente establece un prooeso de aprobación, paso por paso y
caso por caso que tenga en cuenta los riesgos a la salud humana, animal y al
medio ambiente que pueda ocasionar cualquier producto que sea o contenga
OGM (Agrobio,2011).
SegúnAgrobio,20,tl,Unacompañíaqueintentacomercia|izarunoGMdebe
país donde en
inicialmente solicitarlo a la autoridad competente nacional del
Si la
primer lugar se va a comercializar, presentando un informe de riesgo'
autoridadnacionaldaunaopiniónfavorable,elEstadoMiembroinformaal
el producto
de países a través de la Comisión' Si no hay objeciones'
resto
el contrario' si
podrá ser puesto en el mercado en toda la Unión Europea' Por
pedirá opinión a los Comités
se levanta algún tipo de objeción, la Comisión
Cientíticos.
Decisión a un Comité de
Si ésta es favorable, la Comisión propondrá una
da una opinión favorable' la
Regulación. Si dicho Comité de Regulación
por el contrario' la opinión del Comité de
Comisión adopta dicha Decisión' Si
pasará al Consejo de Ministros' el cual
Regulación no es favorable, la Decisión
20
tendrá que adoptarla o rechazarla por unanimidad. Si el Consejo no actúa en
un periodo de tres meses, la Comisión puede adoptar dicha decisiÓn (Agrobio'
20111.
3.6.1.2. Estados Unidos
Según Agrobio, 2011, los fines para los cuales se vayan
a
utilizar los
organismos genéticamente modificados, este país cuenta con tres instancias
reguladoras: El Departamento de Agricultura, USDA, la Agencia de Protección
del Medio Ambiente, EPA, y la Administración de Drogas y Alimentos, FDA'
general.
E| USDA regu|a e| cu|tivo, transporte y propagación de las p|antas en
Loscu|tivosgenéticamentemodificadosestánsometidosaunaregu|ación
especia|ycomoene|casoeuropeo,tienenquesuperarunaseriedecontro|es,
genes introducidos
dando una especial importancia a la posibilidad de que los
enunaespeciecu]tivadapasenaotrasi|vestreemparentada(Agrobio'2011).
si son peligrosos' la
En el caso de productos químicos nuevos, especialmente
regulación corresponde
a la EPA' Hace algunos años esta agencia decidió
genética para el control de las
regular los "agentes" utilizados por la ingeniería
plagas, como la toxina Bt (Agrobio' 2011)'
a la FDA' cuyo
La regulación de los alimentos y medicamentos conesponde
objetivoprimarioes|aseguridada|imentaria'LaFDAnodiscriminasegúne|
a los alimentos producto de la
método de obtenciÓn, por lo que no considera
(Agrobio' 201 1)'
ingeniería genética distintos de los convencionales
3.6.2. Legislación nacional.
Según
el
ministerio de agricultura colombiano, 2006, en
desarrollado un amplio marc¡ normativo en
antes de entrar en vigencia
el
el país se
ha
el sector agropecuario incluso
Protocolo que, sin embargo, seguía las
recomendaciones de precaución que éste hizo obligatorias:
- Resolución lcA 3492/1998: Establece el procedimiento para la introducción,
producción, liberación y comercialización de OGM (agrícolal).
- Acuerdo 013 de Dici1998, modificado por el Acuerdo 002 de Feb/2002: crea
el consejo Técnico Nacional como
órgano asesor para
la
introducción,
producción, liberación y comercialización de OGM agrícola'
- Resolución lcA 2935 de 2001: Reglamenta y establece el procedimiento
bioseguridad para
la
de
introducción, producc¡ón, liberación, Gomercializac¡ón,
de interés en
investigación, desarrollo biológico y control de calidad de OMG
salud pecuaria, sus derivados y productos que los contengan'
Pecuario
- Acuerdo 004 de20O2: Crea el Consejo Técnico Nacional
normas para el registro
- Resolución ICA 1063 de 2005: Por la cual se expiden
de
personas que realicen actividades
de
importación' comercializaciÓn'
calidad de OMG de interés en
investigación, desarrollo biolfuico y control de
y productos que los contengan'
salud y producción pecuaria, sus derivados
22
En diciembre de 2005, el Gobierno Nacional expidió el Decreto Reglamentario
4525 que, además de constituir un esfuezo institucional entre los Ministerios
de Agricultura y Desarrollo Rural, Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, y
Protección Social, es sin duda, un avan@ en la utilización de los instrumentos
legales creados recientemente para regular un tema innovador
y
polémico
como el de transgénicos.
Este Decreto aplica al movimiento transfronterizo, tránsito, manipulación y
utilización de los Organismos Vivos Modificados y, básicamente, separa las
competencias
de las autoridades nacionales según el uso de los
OVM
(Ministerio de Agricultura, 2006).
3.7. FLUJO HORIZONTAL Y VERTICAL DE GENES
se puede hablar de transferencia génica horizontal y transferencia génica
vertical.Laprimeraserefierea|atransferenciadegenesde|organismo
modificado hacia otras especies
no
relacionadas, incluidos
los
microorganismos,y|asegundaserefierea|atransferenciadegenesentre|os
individuos pertenecientes
a la
misma especie
o
especies cercanas
filogenéticamente (González, 2003).
transgénico cultivado
Claramente, no hay barreras genéticas entre de algodón
y los campos vecinos de no
algodón transgénico (si crecido orgánicamente
las tasas
o convencional). El polen de algodón es grande y pegajoso'
de
La mayoría del algodón es
dispersión por el viento se consideran muy bajas'
23
auto-polinización, pero el flujo de genes, se produce como resultado de los
insectos, en particular, las abejas (Kapanda,
etal,
2002).
Según el anterior autor, el alcance de el flujo de genes dependerá del tipo de
insecto polinizadores, la proximidad de los campos de algodón GM a
los
no-
GM, la dirección del viento y la fueza como esto afecta a los patrones de vuelo
de los insectos, así como otros factores ambientales tales como el paisaje; La
separación física mediante el uso de distancia o de zonas de amortiguamiento
en el algodón es el principal método de reducción del riesgo de contaminación.
so observamos otro punto de vista el flujo de genes también puede ocurrir por
la dispersión del polen o por las semillas que caen de las máquinas o que
permanecenene|campodespuésde|acosechatambién||amadasp|antas
espontaneas
añadidos
o rebrotes, las variedades
transgénicas transmiten sus genes
a variedades de cultivo no transgénicas o a especies
silvestres'
(Cabrera, S.F.).
iniciando con e||o, una cadena de contaminación génica
SegúnC|UC,GMScienceReviewPane|,sedebatesie|f|ujo'enotroscasos
benigno,
de
transgenes
a
variedades originales
oa
otras variedades
ambiental, ya que los
convencionales constituya por sí mismo un problema
cu|tivosconvenciona|eshaninteractuadodeestaformacon|asvariedades
origina|esdurantemuchotiempo(c|Uc).Senecesitaninvestigacionespara
evaluarmeiorlasconsecuenciasambientalesdelflujodegenes,especialmente
genes entre los principales
a largo plazo, y para comprender mejor el flujo de
en centros de diversidad'
cultivos alimentarios y las variedades originarias
Los científicos no están plenamente de acuerdo en si el flujo de genes entre
cultivos transgénicos y sus parientes silvestres tiene importancia en sí mismo y
por sí mismo, si un híbrido transgénico/silvestre resultante tuviera alguna
ventaja competitiva sobre la población silvestre, podría persistir en el medio
ambiente y trastomar el ecosistema. Según el informe del GM Science Review;
(citado por El Estado Mundial de Agricultura y la Alimentación 2003-20041)' la
hibridación entre cultivos transgénicos y sus parientes silvestres parece <con
toda probabilidad transferir genes que son ventajosos en entornos agrícolas,
pero no prosperará en el entorno silvestre... Además, ningún híbrido entre
ningún cultivo y sus parientes silvestres ha llegado nunca a ser ¡nvasor en el
entorno silvestre en el Reino Unido> (GM Science Review Panel' 2003)'
3.7.I. IMPACTO ECOLOGICO DE LA HIBRIDACóN CULTIVO MALEZA.
'
planta cultivada o su
El carácter de maleza se refiere a la situación en que una
híbrido||egaaestab|ecersecomoma|ahierbaenotroscamposocomoespecie
invasora
en otros hábitats. Los científicos están de acuerdo en que
hay
so|amenteunriesgomuybajodeque|oscu|tivosdomesticadosseconviertan
como
en malas hierbas debido a que los rasgos que los vuelven indeseables
para sobrevivir y reproducirse
cultivos en muchos casos los hacen menos aptos
en forma silvestre (CIUC, GM Science Review Panel)'
que forman híbridos con
Esta organización afirma, que las malas hierbas
de adquirir el rasgo de
cultivos resistentes a herbicidas tienen el potencial
tolerancia
al
herbicida,
si bien esto les dará una ventaja
solamente en
presencia del herbicida; <experimentos detallados de campo con varios cultivos
modificados genéticamente en una serie de entornos han demostrado que los
rasgos transgénicos investigados -tolerancia
a
herbicidas
y resistencia
a
insectos- no aumentan sensiblemente la capacidad de las plantas en hábitats
seminaturales.
3.7.2. ANALISIS DE RIESGO
Para brindar consistencia internacional en el análisis de riesgos de OGM y
alimentos GM que incorpore evaluación de riesgos, gestión y componentes de
comunicación, una serie de organismos internaciones
de regulación y
de
establecimiento de normas han introducido normas uniformes. Estas incluyen
normas para la evaluación de inocuidad de oGM y alimentos GM para la salud
humana y el medio ambiente,
y notificación de su circulación a través de las
fronteras nacionales. El objetivo de normas mundiales uniformes para la
evaluación de riesgos sería un desafío ya que las naciones están limitadas a
si
tomar diferentes decisiones en base a la evaluación, particularmente resolver
incluir o no los aspectos sociales o económicos (FAO/OMS 2003a)'
precisamente
La introducción de un transgén en un organismo receptor no es
un proceso controlado, y puede tener varios resultados con respecto a
la
huésped (FAO/OMS
integración, la expresión y la estabilidad del transgén en el
2003a).
discutido por primera vez
El concepto de evaluación de riesgos de los OGM fue
(Talbot 1983)' El descubrimiento
en la conferencia de Asilomar en el año 1975
del ADN recombinante suscitó preocupación entre los investigadores con
respecto a la potencial creación de virus recombinante que en caso de escapar
representarían una amenaza para la salud pública. Catorce meses después de
una prórroga voluntaria de
recombinante,
la
investigación sobre técnicas
de
ADN
se redactaron y aceptaron lineamientos preliminares para
contención física
y
la
biologica de los experimentos más riesgosos. Estos
principios guía fueron la base de las pautas de los EE.UU. para la investigación
en biotecnología moderna desarrolladas en 1976 por el comité consultivo
sobre ADN Recombinante de los Institutos Nacionales de Salud (OECD 1986)
Desde entonces, muchos países han establecido sistemas regulatorios
específicos previos a la comercialización requiriendo la evaluación rigurosa de
los oGM y los alimentos GM antes de su liberación al medio ambiente y/o su
uso en el suministro de alimentos. En el sitio de Intemet de la oECD hay un
resumen de algunas legislaciones nacionales e internacionales (oECD 2005).
producto
El concepto que permite la comparación de un producto final con un
que tiene un nivel aceptable de inocuidad es un elemento importante de la
principio fue elaborado por
evaluación de inocuidad de los alimentos GM. Este
1990 y se lo denominó
la FAO, la OMS y la OECD a principios de la década de
'equivalencia sustancial' (FAO/OMS 1990)'
El
principio sugiere que los
los alimentos
alimentos GM pueden ser considerados tan inocuos como
convenciona|escuandoloscomponentestoxico|ógicosynutriciona|esc|aves
de los alimentos GM son comparables con los alimentos
27
c¡nvencionales
(dentro de la variabilidad que ocurre naturalmente), y cuando la modificación
genética en sí se considere segura (OECD 1993).
Los sistemas de reglamentación internacionales sobre inocuidad de los
alimentos GM (Pnncrprbs del codex)
(cAc 2003b) e inocuidad
ambiental
(Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología) (CBD 2000)
entraron en vigencia en 2003.
3.7.3. PROTOCOLO DE CARTAGENA
en
Se completó el texto del convenio sobre la Diversidad Biologica en Nairobi
de
mayo de1992 y éste quedó abierto a la firma el 5 de junio de 1992 en Río
Janeiroen|aConferenciade|asNacionesUnidassobreelMedioAmbienteye|
de 1993'
Desarrollo (UNCED). El Convenio entró en vigor el 29 de diciembre
Hoyendía,e|Convenioessindudae|principa|instrumentointernaciona|para
todos los asuntos relacionados con la diversidad biolfuica'
el de la seguridad de la
Uno de los asuntos de los que trata el Convenio es
proteger la salud humana
biotecnología. Este concepto atañe a la necesidad de
de los productos de la
y el medio ambiente frente a posibles efectos adversos
que la biotecnología
moderna biotecnología. Al mismo tiempo, se reconoce
pro mover el bienestar de la humanidad'
moderna t¡ene un gran potencial para
particu|armenteencuantoasatisfacernecesidadescriticasdealimentación,
de Cartagena' 2000)'
agricultura y cuidados sanitarios (Protocolo
3.7.3.1. oB'rETlVO
De conformidad con el enfoque de precaución que figura en el Principio
l5
de
la Declaración de Río sobre el Medio Ambiente y el Desanollo, el objetivo del
presente Protocolo es contribuir a garantizar un nivel adecuado de protección
en la esfera de la transferencia, manipulación y utilización seguras de
los
organismos vivos modificados resultantes de la biotecnologia moderna que
puedan tener efectos adversos para la consewación y la utilización sostenible
de la diversidad biológica, teniendo también en cuenta los riesgos para la salud
y
humana,
centrándose concretamente en los movimientos transfronterizos
(Protocolo de Cartagena, 2000).
3.7.g.2. Artículo
1l:
PROCEDIMIENTO PARA ORGANISMOS VIVOS
MoD|F|cADoSDEST|NADoSPARAUSoD|REcTocoMoAL|MENTo
HUMANO O ANIMAL O PARA PROCESAMIENTO
l.UnaPartequehayaadoptadounadecisióndefinitivaenre|aciónc¡ne|uso
nacional, incluida
su colocación en el mercado' de un organismo vivo
modificadoquepuedeserobjetodeunmovimientotransfronterizoparauso
procesam¡ento, informará al
directo como alimento humano o animal o para
respecto
a todas las partes, por conducto del Centro de
Intercambio de
en un plazo de 15 días' Esa
lnformación sobre Seguridad de la Biotecnología'
especificada en el anexo
información deberá incluir, como mínimo, la
ll'
La
al centro focal de cada
parte suministrará una copia impresa de la información
parte que haya informado por adelantado
acceso
al Centro de Intercambio de
a la secretaría de que no tiene
Información sobre
29
la Seguridad de
la
Biotecnología. Esa disposición no se aplicará a las decisiones relacionadas con
ensayos prácticos.
2. La Parte a que se hace referencia en el párrafo
I
supra al adoptar una
decisión se asegurará de que existe una prescripción legal que estipule el
grado de precisión de la información que debe proporcionar el solicitante.
3. Una Parte podrá solicitar información adicional del organismo gubernamental
especificado en el inciso b) del anexo ll.
4.UnaPartepodráadoptarunadecisiónsobre|aimportacióndeorganismos
o an¡mal
vivos modificados destinados para uso directo como alimento humano
óparaprocesamientoconaneg|oasumarcoreg|amentarionaciona|quesea
compatible con el objetivo del presente Protocolo'
5'LasPartespondránadisposiciónde|Centrode|ntercambiode|nformación
leyes' reglamentaciones
sobre Seguridad de la Biotecnología ejemplares de las
y directrices nacionales
aplicables
a la
importación
de organismos
vivos
humano o animal' o
modificados destinados para uso directo como alimento
para procesamiento, en caso de que existan'
que sea país con
6. Una Parte que sea país en desarrollo o una Parte
del marco reglamentarlo
economia en transición podrá declarar, en ausencia
párrafo 4 supra y en el eiercicio de su
nacional a que se hace referencia en el
jurisdicciÓn ¡nterna, por conducto del Centro
de Intercambio de lnformación
que su decisión anterior
sobre Seguridad de |a Biotecno|ogía,
a |a primera
importación de un organismo vivo modificado destinada para uso directo como
alimento humano
o
animal,
o
para procesamiento, sobre
suministrado información con arreglo
la cual ha
al párrafo 1 supra, se adoptará de
conformidad con lo siguiente:
a) una evaluación del riesgo realizada de conformidad con el Anexo lll, y
b)
una decisión adoptada en plazos predecibles que no excedan los doscientos
setenta días.
7. El hecho de que una Parte no haya comunicado su decisión c¡nforme al
párrafo
6 supra no se entenderá como su consentimiento o negativa a
la
como
importación de un organismo vivo modificado destinado para uso directo
alimento humano
o animal o para procesamiento a menos que esa
Parte
especifique otra cosa.
información y
8. El hecho de que no se tenga certeza científica por falta de
los posibles efectos
conocimientos pertinentes suficientes sobre la magnitud de
adversosdeunorganismovivomodificadoen|aconservaciónyuti|ización
sosteniblede|adiversidadbio|ogicaen|aPartedeimportación,teniendo
no impedirá a esa Parte'
también en cuenta los riesgos para la salud humana'
posibles efectos adverso s ' adoptar una
a fin de evitar o reducir al mínimo esos
la importación de ese organismo vivo
decisión, según proceda , en relación con
alimento humano o animal o para
modificado destinado para uso directo como
procesamiento (Protocolo de Cartagena' 2000)'
3.7.4. NORMAS DE ETIQUETADO
5_t
Las autoridades nacionales han desarrollado varios enfoques para etiquetar
alimentos que contienen o derivan de los OGM. En algunos de los países con
regímenes obligatorios
de
etiquetado
de
alimentos GM, los alimentos
convencionales pueden contener rastros de material GM dentro de los niveles
de umbral establecidos, por ejemplo la soja proveniente de fuentes
que
contienen soja GM sin rotular. Los alimentos específicamente declarados libres
deGMnecesitanmayormenteunapruebaana|íticacuidadosadequenoseha
involucrado ningún material ni proceso GM.
alimentos GM:
Existen dos amplios enfoques regulatorios para el etiquetado de
.
El etiquetado voluntario
-
que es impulsado principalmente por las fuezas
en la
del mercado, sin requisitos legislativos para declarar el uso de OGM
producción alimentaria.
.E|etiquetadoob|igatorio_querequieredec|araciónde|ascaracteristicas
genética (ya sea a los fines
impartidas a un alimento por el uso de tecnología
o el uso de tecnologÍa
de salud e inocuidad y/o relacionada con el proceso)'
genética en sí en la producción alimentaria'
Hastaelaño2004,másde30paísesdetodoelmundohabíanadoptadoo
planeado cierta forma
de normas de etiquetado obligatorio de
alimentos
por lo general requieren
producidos usando tecnología genética' Estas normas
una declaración de las características de salud
commodities GM,
e
identificación
e
inocuidad que traen los
del uso de tecnología genética en
la
legislado es que se
producción alimentaria. El requisito más frecuentemente
5Z
usen las palabras 'genéticamente modif¡cado' asoc¡adas al nombre del alimento
o el ingrediente principal.
Algunas regulaciones de etiquetado requieren el uso de métodos analíticos
para la detección de proteínas
o
ADN recombinantes como criterio de
etiquetado. Dichos métodos analíticos, especialmente la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), se han vuelto tan sensibles que puede detectafse una
mÍnima contaminación con ADN recombinante, y por lo tanto se han introducido
los límites umbral para contaminación no deseada'
CrylAc
3.8. METODOLOGIA PARA LA DETERilIINACION DE LA TOXINA
Labiotecno|ogíauti|izadiferentestécnicasométodos,yesap|icadaenvarios
sectores
o
campos. Su aplicación brinda herramientas para
sostenible de la agricultura, la pesca
el
desarrollo
y la actividad forestal' así como de
las
industriasa|imenticias,farmaéuticasyquímicasentreotras(oEcD'2005).Por
de Cartagena
su parte, la biotecnologia modema se define en el Protocolo
sobreSeguridadde|aBiotecno|ogía_ConveniodeDiversidadBio|ógica,como
la
aplicación de técnicas
in vitro de ácido nucléico' incluidos el
ácido
desoxiribonuc|éicorecombinante(ADNr);|ainyeccióndirectadeácidonuc|éico
en
élulas
u orgánulos; o la fusión de
élulas más allá de la familia taxonómica'
Co|ombiaratificóe|Protoco|odeCartagenaenBioseguridadmediante|aLey
74Q
de
2002
de
en el cual se plantea la necesidad del establecimiento
manipu|ación y uti|ización de
orocedimientos adecuados para |a transferencia,
para la conservación y la utilización
OGM que puedan tener efectos adversos
33
sostenible de la diversidad biológica. Por medio de un grupo interinstitucional y
el Banco Mundial se formuló y gestionó ante el Global Environmental Facility
,,Desarrollo de capacidades para lmplementar en colombia
(GEF) el proyecto
el
Protocolo
de cartagena en Bioseguridad
-
convenido de Diversidad
Biológica" (Maldonado C, 2007).
La detección de un oGM se basa en determinar las diferencias entre un
organismonomodificadoyunoGM.Estopuederea|izarseyaseadetectando
análisis químico
el ADN insertado en el organismo modificado o por medio del
de|anuevaproteínaexpresada(Querci,2006).Parae||oexistendos
por medio de la
aproximaciones científicas: los métodos basados en ADN'
amp|ificaciÓndesecuenciasespecíficasmediante|areacciónencadenade|a
proteínas
polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y los métodos basados en
permiten observar la
formando complejos antígeno-anticuerpo' Estos métodos
pueden obtener
posible presencia/ausencia de OGM y, en algunos casos' se
analizadas (Querci'
una cuantificaciÓn o porcentaie de OGM en las muestras
una serie de etapas para
2006). Para cualquiera de los dos casos, es necesaria
reducir|avariabi|idaclyasegurar|aca|idadde|osresu]tados(Ma|donadoC,
2007).
3.8.1. PCR
conocida como PCR por sus siglas en
La reacción en cadena de la polimerasa'
inglés (Potymerase Chain Reaction)'
es una técnica de biología molecular
es obtener un gran número de
descrita en '1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo
copias de un fragmento de ADN particular. Esta técnica se utiliza para
amplificar un fragmento de ADN, empleando primers o cebadores específicos
(secuencias de oligonucleótidos) que corresponden
a los dos extremos del
segmento de ADN objetivo (Saiki ef a/., 1985). La tecnología de PCR se ha
convertido en una de las principales Herramientas de la biología molecular y
por consiguiente es muy utilizada para la detección e identificación de oGM.
Dependiendo
del objetivo del análisis (cualitativos o
cuantitativos), la
amplificación de ADN se puede desarrollar por medio de PCR t¡empo real o
PCR punto final. si se ha realizado PCR punto final es necesario efectuar una
electroforesis en gel de agarosa con el fin de visualizar
el resultado de
la
amp|ificación.Pore|contrariosiseharea|izadounaamp|ificaciónconPCR
tiemporeale|aná|isissel|evaacaboatravésde|softwarede|equipo
(Maldonado C,2007)'
3.8.1.1. ELECTROFORESIS
medio
Para visualizar los productos amplificados por
de una
PCR
convenciona|,esnecesario¡ea|iza¡unae|ectroforesis.Lae|ectroforesisenge|
para separar' visualizar y
de agarosa es un método comúnmente empleado
permite la separación de
purificar fragmentos de ADN' La técnica
macromoléculas con base
en su tamaño y carga eléctrica mediante
la
la influencia de un campo magnético' El
migración de partículas cargadas bajo
35
ADN en solución está cargado negativamente por sus grupos fosfatos, los
cuales migran hacia el ánodo separándose de acuerdo con su tamaño (pares
de bases). Pa¡a realizar la visualización se emplea algún colorante
como
bromuro de etidio, el cual se intercala entre las bases de ADN y fluóresce bajo
luz ultravioleta (Longo ef a/., 2005).
3.8.2 ELISA
genes. Para
Las proteínas son el resultado de una expresión regulada de los
gen de
obtener un oGM se inserta una secuencia de ADN que posee no sólo el
interés,quecodificaparadeterminadaproteína,sinotodasaque||assecuencias
que regulan su expresión' El resultado es un organismo que expresa dicha
proteína, confiriéndole nuevas características (Maldonado C' 2007)'
Segúne|autor,estametodologíasebasaene|reconocimientoespecíficode
recreando la
un epítope, o porción de la proteína, por parte de un anticuerpo'
por un epítope
resouesta inmune. La especlficidad de determinado anticuerpo
para la detección
único permite que el uso de esta tecnología sea ideal
cuantitat¡va y cualltativa de proteinas'
en la técnica Enzyme
Muchos métodos de inmunoensayos se han basado
esta prueba
Linked tmmuno So¡bent Assay (ELISA)' Básicamente'
es
una
reacciónantígeno-anticuerpoquese||evaacaboenunafasesó|ida(p|acasc|e
y produce un complejo estable que
96 pozos). El antígeno-anticuerpo reacciona
anticuerpo unido
puede ser visualizado por la adición de un segundo
a
una
con la enzima resuJta en una
enzima. La adición de un sustrato que reacciona
formación de color,
la cual puede ser medida fotométricamente. Así
se
compara el color de las muestras con los de un estándar determinando, el
rango de la concentración en la muestra (Miraglia et al.'2004)'
3.8.3. LIOFILIZACIÓN
Esteprocesobuscaunadeshidratacióncomp|etasine|aumentode
temperatura que puede hacer variar
la composición química del tejido a
evaluar. Es una técnica de congelación-desecación, en la que se congela el
tejido(sa|tandoe|pasopore|estado|iquidode|aso|uciónacuosaensu
químicos que inducen
interior), a esa baja temperatura se impiden los cambios
pasar
el deterioro, para después someterla a una presión de vacío que haee
del estado sólido al gaseoso ( Mejía, ef a/' 2008)'
Esunaoperaciónmediantelacua|see|iminatota|oparcia|mentee|aguade|a
por la migración de
sustancia que lo contiene, la transferencia de masa ocurre
la acción de un diferencial
vapores a través de la capa seca de la muestra bajo
es grande; se
de presión, esta transferencia es alta cuando la diferencia
su humedad y por
emplea con el fin de conservar el material al disminuir
que se evapora por sublimación)
consiguiente, la actividad del agua (haciendo
(Mejía. et al. 2008).
Lasetapasde|a|iofilizaciónson:|acongelación(acondicionamiento)abajas
hielo' generalmente a muy baja
temperaturas, el secado por sublimación del
en condiciones controladas'
presión y el almacenamiento del producto seco
3.9.
REFUGIO
37
La adquisición de resistencia a las proteínas Cry por los artrópodos blanco es
probable debido
a la exposición continua a la que están sometidos en los
cultivos Bt. Esta presión selectiva llevaría a seleccionar aquellos individuos en
los cuales se presenten mutaciones (recesivas) que afecten la acción de la
toxina (eliminación del sitio de unión de la misma) (Maagd et al, 1999). Por tal
motivo se han desarrollado estrategias para
el retardo de la aparición
de
individuos resistentes por medio de alta dosis de proteína cry expresada en las
plantas y la aplicación de un refugio consistente en un área lindante al cultivo
transgénico en la cual se cultiva
el mismo híbrido, pero en este caso no
transgénico (Rousch y Shelton, 1997)'
según Blanco, (2008), el área refugio se denomina genéticamente como la
zona para la producción de individuos susceptibles que se cruzan con aquellos
que pueden emerger del algodonero Bú' Los individuos susceptibles
(genéticamentedescritoscomoSSportenerdoscopiasdea|elossusceptib|es
(aEfenestecaso)ensuADN)yheteroc¡gotos(RS,una|e|oresistenteaBfy
¡nsectos
el otro susceptible) son susceptibles a 8f, siendo únicamente los
homocigotosresistentes(RR)|osquetienena|gunaposibi|idaddesobreviviry
provocar resistencia'
A 10 años de la introducción del
primer cultivo transgénico que expresa las
y
el 2005 no se había detectado
endotox¡nas de Bt (algodonero Bollgard) hasta
plagas documentado (Blanco'
en el campo un caso de resistencia en estas
2008).
38
3.9.I. FENOMENO DE LA RESISTENCIA.
Según Borrero & Zenner,1996 ; en Colombia, al igual que otros países, en los
cuales predomina el control químico de insectos plagas, enfrenta el problema
de la resistencia: la res¡stencia es un proceso dinámico evolutivo, que depende
de la presión de selección ejercida por los productos aplicados a la población
de la plaga (Metcalf, 1983; citado por Borrero & Zenner, 1996); bajo
condiciones de campo el fenómeno de resistencia significa no control
plaga
económico con las dosis previamente establecidas y efectivas contra la
(Zenner,1991),|ocua|tienecomoconsecuenciaunaumentode|costode|
control químico de la plaga y la disminución de la productividad del cultivo
(
Borrero & Zenner, 1996).
E|desarro||ode|aresistenciadependedeinteraccionescomplejasentre|as
de| pesticida
características bio|ógicas de |a población tratada, |a natura|eza
usados para la represión
usado y la secuencia con la que estos productos son
por Castañeda' & Miranda'
de un complejo de plagas (Sawicki' 1976; citado
1982),
el
fenómeno tiene mayor importancia
en aquellas especies
que
oresentanune|evadonúmerodegeneracionesanualesyuna|topotencia|
biótico (Castañeda & Miranda' 1982)'
por selección a partir de
Según este mismo autor, la resistencia se origina
superviv¡entes,
y
como los factores que
la
confieren son controlados
resistentes tiende a ser más
genéticamente, la descendencia de progenitores
por Castañeda' 1982)' por tanto' no se
resistente (Winteringhan, 1962; Citado
perderá con el transcurso de las generaciones, aunque se interrumpa el
tratamiento con un determinado plaguicida (Whitten
y Bull' 1970; Citado por
Castañeda, & Miranda. '1982).
3.9.2. PLAGA DEL ALGODÓN DE IMPORTANCIA ECONOMIGA (HetÍoÚhrb
virescens)
La aparición de la plaga H. virescens como una de las principales plagas de
importancia económica en las áreas algodoneras colombianas data desde el
año 1962. Según estudios realizados sobre fluctuación de las poblaciones de
Heliothis,
la especie más abundante, especialmente durante la etapa de
fructificación del cultivo es H. yirescens (García, 1971; Cilado por García.
1978).
Coaker(1957),CitadoporGarcía.1978,describee|dañoquee|insectocausa
a|abe||otadesdee|ataqueparcia|aun|ócu|ohasta|adestruccióncomp|eta
delaúpsu|a'E|autorafirmaquee|dañohechopore|insectoa|ascápsu|as
la e¡secha'
maduras constituye una perdida real que se refleja en
que el daño por
Según la investigación de García' 1978 et a/, expresan
puede traer un incremento
insectos al cuttivo en su primera etapa de desarrollo
en los rendimientos' pues la planta de algodón tiene la habilidad
recuperarse del daño, especialmente cuando
el período vegetativo es
largo;
cuando
Los autores advierten que los rendimientos son afectados
la cosecha'
infestaciones de la paga se presentan cerca a
40
de
las
En un estudio realizado por Lincoln ef a/. (1959), Citado por García' (1978);
encontró que una larva
de
Heliothis daña
cápsulas, mientras que Kincade
en promedio 3,8 botones y
et al. (1967), citado por García
2,2
(1978)'
contabilizaron un total de 10 botones, 1,2 flores y 2,1 cápsulas consumidas por
el insecto entre 15,0 y 18,3 días de duraciÓn del estado larval (García. 1978).
IV. MATERIALES Y METODOS
4.1. Localización
(Tolima)
Las muestras se tomaron en el año 2009, en el municipio de Flandes
el cual que se encuentra en el centro del país a 4"
',17"
de latitud norle y 74" 49"
de|ongitudoestede|meridianoGreenwichaunaa|turasobree|nive|de|mar
del
de 285 msnm. se ubica en la región centro oriente del Departamento
Tolima,enlamargenizquierdadelRíoMagdalena,distantedeBogotáasolo
(Figura 2)'
123 Kilómetros de Bogotá y a 70 kilómetros de lbagué
4t
Figura 2. Mapa geográfico del municipio de Flandes Tolima, en
amarillo se resalta la zona donde se desarrollo el traba¡o.
Los Iimites del municiPio son:
Norte: Municipio de Girardot y Ricarte (Cundinamarca)
Sur:
MuniciPio de EsPinal (Tol.)
Oriente:
Municipio de Suarez (Tol.).
Occidente: Municipio de Coello (Tol.).
Extensión totall 95 Km2
Extensión árca rural: 92'77 Km2
oC Centígrados
Temperatura media: 28
42
el
cuadro
Situación de siembra del año 2009 en el sector de Flandes Tolima, se refleja en
la figura 3.
CONVENCIONES
MODIFICADAS GM
co
r
5
o
4,tÉ
l---.t-t --J-L---l-t--J-J
vENClOl{AtEs
Figura3.SituacióndesiembraGM-F|andesTo|ima,EIco|orazu|c|aro
demarcaloscultivosgenéticamentemodificadossembradosenestaépoca'el
color rojo los cult¡vos convencionales' Cabe resaltar
que
los espacios azules
si no también aquellos
no solo simbolizan los cultivos con tecnología Bollgard
RR.
43
4.2.Matc¡ial vegetal.
El lote evaluado refugio correspondió a plantas de algodón convencional Delta
Opal RR, correspondiente al lote refugio de un cultivo de la variedad Bollgard@
ll / Roundup Ready Flex@. Los lotes refugios se encontraban en un extremo de
la plantación en un área de 10m por 40m, en una plantación denominada 96:4.
Las muestras se tomaron en dos etapas del cultivo, en la de fructificación (80
días después de la siembra) y en la de maduración (120 días después de la
siembra).
4.3Recoleccióndematerialvegeta|paraladeterminaciónde|a
contaminación en lotes refugio'
De los lotes refugio, sembrados con algodón convencional, se colectaron hojas
jóvenes procedentes de la rama fructífera 6 (RF6) y cápsulas inmaduras sin
dehiscencia colectadas de
la RF-S, posición uno, a los 80 días, para las
primeras muestras. En la segunda toma de muestras, de igual forma se
de la
colectaron hojas de la RF-8 y cápsulas maduras dehiscentes tomadas
RF-7, posición uno, a los 120 días. De las cápsulas se evaluaron ún¡camente
lassemillas,considerandoquesonelobjetomedibledelacontaminación
génica.Lashojascump|ieron|afuncióndecorroborarlaconvenciona|idadde|a
plantas
planta evaluada y de esta manera evitar evaluaciones sobre
modificadas.
en cuanto al
Se evaluaron dos metodologías de ubicación del lote refugio'
cultivodeplantasgenéticamentemodificadas'Elprimero'presentabalos
lote de plantas GM
surcos en la misma orientación (norte-sur) que los del
los surcos de las plantas convencionales
plantas GM' estaban en
presentaban la orientación norte-sur, mientras que las
(Figura
4).
el sentido
En
el
segundo
lote,
(oriente-occidente).
M
De cada lote, se evaluaron 9 distancias al cultivo GM ('lm, 2m, 3m, 4m, 5m,
6m, 7m, 8m, y 9m).Por cada distancia se tomaron 5 repeticiones (surco1, surco
2, surco 3, surco 4 y surco 5), evaluando un solo individuo por repetición' La
orimera toma de muestras se realizó a los 80 días de sembrada la planta. La
segunda muestra a los 120 días.
rÉfglglFÉr?|g
lllllll
ttiüñdr.r!úad lo¡t Pffid
r
!ffi,*,
ü ffi,*
PbÍú
GT
LOTEGI
BC¡LLCARO
I
O
b.
Figura 4. a. Orientación del lote Uno
b. Orientación
45
del lote dos.
Los muestreos (Figura 5), se realizaron siguiendo la metodología de custodia,
recomendada por Mejía (2008), en la cual se hace una efectiva rotulación, de
cada una de las muestras, las cuales se empacaron en bolsas Ziploc, con
cierre hermético, permitiendo reducir la posible contaminación o mezcla de las
etapas. Finalmente las muestras, se
almacenaron en contenedores plásticos (neveras portátiles) con material
refrigerante (Hielo eutético e¡nservador reaprovechable a -4oC)' para ser
muestras
en
cualquiera
de las
trasladadas al laboratorio.
Debido a la alta sensibilidad de los protocolos para la detección de oGM, se
buscó mantener especial cuidado en impedir contaminación o mezcla entre
lotes de muestreo o entre muestras de laboratorio según lo recomendado por
Olsen ef a/., (2005), en Mejía (2008)
Figura
5.
Metodología de campo
A'
Figura del lote refugio en posición
refugio en posición vertical
horizontal respecto al lote GM B' Figura lote
46
respecto al lote GM C. Figura @rcana de plantas recolectadas D. Planta de 80
días para muestreo E. Partes de plantas recolectadas.
4.4. Análisis de las mueetras en laboratorio.
Esta parte del trabajo se realizÓ en el laboratorio de Biotecnología Vegetal de la
universidad de ciencias Aplicada y Ambiental, u.D.c.A, ubicada en la zona
norte del campus Universitario.
En el laboratorio, las muestras se clasificaron por número de muestreo, y
oosteriormente se llevaron al congelador para mantenerlas en una
T'de
-10
oC, requerimiento necesario para el proceso de liofilización'
La liofilización, se realizó por un período de 48 horas, con una presión de 220
mb, y temperatura de
-52'C. En cada recipiente de vidrio del liofilizador' se
de las
introdujeron las hojas y cápsulas de una misma muestra. La totalidad
40 dÍas.
muestras correspondientes a las dos etapas, tardaron en liofilizarse
de hoja y cápsula; ésta
Cada muestra liofilizada, se separó en las submuestras
ú|timaseabriÓyseextrajeron|assemi||as.Estosdostiposdetejido,fueron
para evitar su mezcla' Para
macerados por aparte en morteros de porcelana'
con agua y jabón; y
impedir los residuos de tejido en los morteros, se lavaban
Las muestras liofilizadas se
oosteriormente se limpiaban con alcohol al 7|o/o'
conservaron
a temperatura ambiente, en ftasc¡s serológicos de vidrio
capacidad de 100
ml,
de
la etapa'
rotulados con un código que resumía' el lote'
tejido'
el surco, la distancia de la muestra y el tipo de
47
4.4.1 Determinación de la contaminación génica por ELISA.
Para la determinación de la contaminación génica, se tomó como base la
existencia de la toxina Cry1Ac, en los tejidos evaluados. Para ello, se utilizó el
Kit "Envirologix Qualiplate para Cry1Ab/Cry1Ac". Este kit ha sido diseñado para
la detección cualitativa de proteína
crylAc en muestras de semillas u hojas de
algodón BollGard@, BollGard ll, o WideStrikeil.
Este kit Qualiplate es un ensayo ELISA tipo sándwich, ésta prueba es una
reacción antígeno-anticuerpo que se lleva a cabo en una fase sólida (placas de
96 pozos). El antígeno-anticuerpo, reacciona y produce un complejo estable
que puede ser visualizado por la adición de un segundo anticuerpo unido a una
enzima. La adición de un sustrato que reacciona con la enzima resulta en una
formación
de color, la cual puede ser medida fotométricamente. Así,
se
comparae|co|orde|asmuestrascon|osdeunestándar,determinandoe|
rango de la concentración en la muestra (Mejia; et al' 2008)
Enelcasodeesteensayo,eltejidopulverizadoaevaluar'seadicionóalos
pocillos que están tapizados con anticuerpos frente a la toxina CrylAb/Cry1Ac'
se une a los anticuerpos
Cualquier residuo presente en la muestra de extracto
y
posteriormente es detectado mediante
la adición de anticuerpo frente
a
de un paso de lavado
Cry1Ab/Cry1Ac, conjugado con peroxidasa' Después
sencillo,losresultadosdelensayosonvisualizadosmedianteeldesarrollode
Cry1Ac en el extracto de
color, el cual es proporcional a la concentración de
muestra.
48
Los componentes requeridos para este análisis son:
o
Una placa tapizada con anticuerpos frente a Cry1Ab/Cry1Ac
o
Un control Positivo Cry1Ab/Cry1Ac
o
Un conjugado enzimático CrylAb/crylAc
¡
Un substrato
4.4.1.1. Prcpanción
& las muestras.
Decadarecipiente,setomaronmuestrashomogéneasporvolumende
material liofilizado (hasta la marca de 0,1 ml del Eppendor), según la
etal (2008). La muestra colectada se
con 250 pl del buffer de extracción basado
metodología recomendada por Mejía
coloca en tubos de microcentr¡fuga
en PBS (0.55olo), por un período de 24 horas en solución para la determinación
de la proteina Cry1Ac por la técnica de Micro ElisaSe evaluaron por aparte las semillas y las hojas de cada muestra'
4.4.1.2. Metodología de la Prueba.
y
a los 80 y
se evaluaron en total 360 muestras; 180 de hojas (lotes uno dos
y
días)' Para esto' se
120 días) y 180 de semillas (lotes uno y dos a los 80 120
emplearon 4 kits de ELISA (Figura 6)'
I
.
Pasadas las 24 horas con
el buffer de extracción' las muestras
durante 3 minutos'
homogenizaron en una microcentrifuga a 5600 rpm'
49
se
2. En el primer y último pozo de la placa de micro
muestras Blanco, conespondientes
ELISA, se colocaron
al tampón de extracción como
control negativo.
J.
En el segundo
y
penúltimo pozo
de la placa de micro ELISA, se
colocaron las muestras del Control Positivo CrylAb.
4. Una alícuota del sobrenadante de las muestras a evaluar, se añadió a
los pozos vacíos de la placa de ELISA (Del pozo 3 hasta el pozo 94)'
5.
Los reactivos se deben dejar en un período de acondicionamiento a
temperatura ambiente antes de comenzar (30 minutos). Se recomienda
que el conjugado, el substrato y la solución de parada, se añadan con
una pípeta de salida múltiPle.
6.
Se añadió
a
cada pozo de la placa 50 pl de la enzima conjugada
Cry1Ab/Cry1Ac. Siempre siguiendo
el mismo orden de adición
para
todos los reactivos.
7.
Semezc|ócuidadosamente|oscontenidosde|ospoci||osmoviendo|a
placa con de forma circular y rápido sobre la mesa de trabajo durante 30
segundos. Teniendo cuidado de no derramar los contenidos'
8.
Se cubren los pocillos con Parafilm para prevenir la evaporación e
que se emplea
incubar a temperatura ambiente' El tiempo de incubación
es de 120 minutos
50
9. Tras
la incubación, se quita cuidadosamente la cubierta y se eliminan los
contenidos de los pozos en un contenedor adecuado. Se inundan
completamente los pozos con la solución de lavado, y posteriormente se
vacía el contenido (proceso repetido tres veces).
10.Se añade 100 pl de Sustrato a cada pozo.
1
1.
12.
Se mezcla cuidadosamente el contenido de los pozos.
Se cubren los pozos con Parafilm
y se incuba por 30 minutos a
temperatura ambiente.
13.Se añade 100 pl de una solución de parada a cada pocillo y se mezcla
cuidadosamente. Esto genera en los pozos un cambio de color, el cual
se torna en caso de ser positivo a |a proteína, de co|or amari||o (Mejía ef
a/. 2008)
5L
Figura6.FotosprocedimientoEL|SA.A.Muestrasdealgodónde|otesrefugio
el buffer de extracción.
después de| proceso de |iofi|ización y maceración, con
Se agrego la enzima
B. Alícuota del sobrenadante de las muestras de algodón'
pozos con Parafilm' por 120
conjugada en cada poso del test. D' Se cubren los
minutos a temperatura ambiente.
E' Se inundaron completamente los pozos
contenido (proceso
con la solución de lavado, y posteriormente se vacío el
de la solución de lavado'
repetido tres veces). F. Se eliminaron los residuos
posos sobre papel absorbente
dejando escurrir por unos segundos los
G. Posos con el sustrato mezclado en tiempo de espera. H. Test terminado.
4.4.1.3. Lecfura de Ia concentración de proteína.
El
Color obtenido se midió utilizando un BioRad 'Benchmark' lector de
microplacas (BioRad Laboratories; Tokio, Japón)
450
nm.
a una longitud de onda
de
Se debe comparar la absorbancia de las muestras, con
la
absorbancia del control positivo para determinar la presencia o ausencia de
endotoxina
cry1Ac. Las muestras con absorbancia menores o iguales a
los
pozos blanco se consideran libres de endotoxina cry1Ac. Las muestras con
absorbancia significativamente superiores
positivas para endotoxina
Bt.
a las de los pocillos Blanco
son
Las lecturas obtenidas se llevan a una ecuación
de línea recta que se obtiene de la curva de calibración con muestras de
concentración conocida.
pruebas moleculares'
6.4.2. Corroboración de la contaminación por
plantas de los lotes refugio' se
Para corroborar la contaminación génica en las
realizó una PCR, evaluando las semillas
de muestra positivas y
sus
positivo se tomo el Cry1Ac que v¡ene en
correspondientes hoias. Como control
ACT GCA GGA GTG AT-3'y 5'el kit de ELISA. Los cebadores fueron: S'-GGG
genera una banda de 653
AAT TGC TTT CAT AGG CT-3', cuya amplificación
pb.
de |nvitrogen
Para la extracción de| DNA se utilizo el Kit
Kit" (Pure Link Plant).
,,Tota| DNA Purification
4.4.3. Análisis de Ia información.
Los datos obtenidos a partir de las muestras de los diferentes lotes permitieron
analizar: contaminación genética
en los lotes refugio, distribución de
la
contaminación en el lote refugio, concentraciones de la expresión de toxina en
semillas procedentes de plantas sin el gene de transformación y disposición de
los lotes refugio en cultivos de Algodón genéticamente modificado,
Todos los datos fueron analizados mediante una prueba de significancia
(Anovas). Para diferenciación de medias entre tratamientos con diferencias
significativas se utilizo la prueba t (test). Se analizaron los datos de diferencias
entre: Lote
1 y 2;
convencionales hacia
Fenologías
y
distancias
en metros de las
plantas
el lote Genéticamente Modificado. De igual forma se
hicieron análisis de tipo no paramétrico comparando los porcentajes de
contaminación entre las diferentes distancias.
54
V. RESULTADOS Y DISCUSóN
5.1 Distribución de la contaminación en las parcelas uno y dos en dos
tiempos de evaluación.
5.1.1 Parcela uno a Ios 80 días.
En este lote, se encontró contaminación en todas las distancias evaluadas,
desde el primer hasta el noveno metro, las semillas que aunque correspondían
al lote refugio, presentaban la contaminación con el transgen cry1Ac. Según
los análisis estadísticos, no hubo diferencias significativas en cuanto a la
contaminación según
las distancias evaluadas' Lo que deduce' que
la
que hay entre
contaminación con el transgene es independiente de la distancia
el lote refugio y el lote de plantas GM (anexo 1)' El
porcentaje de
contaminación,encontradofuesuperiora|40o/o,e|cua|sededuceenminimo
evaluadas'
dos plantas contaminadas por cada distancia de las nueve
las
En los primeros cinco metros evaluados, la hibridación de
plantas
fue @rcano al 60% lo que
convencionales del lote refugio con las plantas GM'
indicaunaa|taincidenciade|osmecanismosdepolinizaciónc¡uzadaenesta
el porcentaje
distancia. Conforme se evalúan los otros cinco metros
de
el promedio de hibridación
contaminación disminuye en un 10%' Sin embargo
(Figura 7)- Razón por la cual
es del 50%, muy alto para una planta autfuama
reconocido' es
esta planta, a pesar de su mecan¡smo de autopolinización
(2009), como una planta de
considerada por autores como Paredes
de polinización cruzada como de
oolinización mixta, ya que sus niveles
autopolinización se presentan en diferentes grados. Esta mismo autor cita que
los niveles varían entre un 5 al 25o/o, con reportes similares al de la presente
investigación del 50%, en lugares donde hay abundancia de insectos como lo
son las abejas melíferas.
Á
5
4
I Sin contam¡nar
¡ Contaminadas
2
1
0
Figura
7.
Contaminación génica en plantas de lote refugio según la distancia al
lote genéticamente modifi cado.
Pese a no encontrar diferencias estadisticamente significativas, es importante
del lote
resaltar que en la medida que se hace más distante el lote refugio,
genéticamente modificado,
la
contaminación
e¡n el
transgene tiende a
disminuir.Loanteriorsedemuestraconlalíneadetendencianegativa'quese
obtiene
en la expresión del porcentaje de contaminación a través de
pena destacar
diferentes distancias evaluadas. sin embargo, vale la
disminución de
las
que
la contaminación no es constante ya que se dieron
la
picos
fluctuantes entre el
81o/o
al
40o/o
de hibridación entre las distancias evaluadas
(figura 8).
90,oo
ao,oo
70,oo
60,oo
5(),oo
40,oo
30,oo
20,oo
10,oo
o,oo
1
Figura
8.
Porcentaje
de
contaminación
de plantas con Bt, según
el
distanciamiento en metros al lote GM.
La
No se encontró un patrón, en la expresión del flujo génico en los surcos'
al lote de
variabilidad de la contaminación es independiente de la distancia
plantas genét¡camente modificadas
embargo en los surcos
I y 4 (R1 y
contaminación en los primeros
surcos 2 y
3
y del surco
evaluado (Figura
9)'
Sin
R4), se presentó una continuidad en la
4 metros, de cada surco' De igual forma
los
de la
(R2 y R3) presentaron una homogeneidad en la expresión
planta de por medio' Los cuatro
contaminación génica, la cual se presentó
del transgene en el primer metro
surcos anteriores, ev¡denciaron la presencia
de|asmuestraseva|uadas'E|surcocinco(R5),fuetota|mentedisparejoen|a
formaenqueseexpresó|apresenciade|transgene(figurag).Estepatrón
variable de flujo génico,
se puede atribuir a la polinización entomófila'
se explicará más adelante'
especialmente dada por las abejas' como
>t
r)
I+
+
*
!
I
nantc
"ln
contdn¡nar
PlütüGt
n"ttacontamlnadc
Figura 9. Distribución de la contaminación en los diferentes surcos evaluados'
La hibridación con el carácter transgénico como lo muestra la figura'
no
presenta un patrón definido de flujo génico. T: Distancias al lote de plantas GM.
(T1: 1 metro T2: 2 metros... T9: 9 metros) R: Repeticiones (surcos evaluados).
5.1.2. Parcela 2 a los
80 dias
diferencias
Las pruebas de ANAVAS realizadas en esta parcela' arrojaron
Las p|antas |oca|izadas
significativas entre las distancias eva|uadas (anexo, 3).
a los 4, 8 y 9
metros fueron estadísticamente diferentes'
distancias (Figura
10)'
al resto de
las
En esta parcela tampoco se encontró un patrón
el transgene' sin embargo
determinante que expl¡que la contaminación con
despuésde|osochometrosyanosepresentólahibridaciónen|asp|antasde|
lote refugio. El promedio de contaminación total para este lote fue del 24,60/o;
un 35, 4% menos que el primer lote evaluado.
6
AA
BAA
AB
4
I
I
3
Sin
contam¡nar
Contaminadas
,|.
0
I
Figural0.Contaminacióngénicaenp|antasde||otedosrefugiosegún|a
distancia al lote genéticamente modificado'
En los primeros c¡nco metros evaluados la hibridación de las
plantas
36%' dato que
convencionales del lote refugio con las plantas GM, fue del
podría ser interpretado como
de baja interacción con los
mecanlsmos
seis metros de distancia
facilitadores de polinización c¡uzada' Después de los
y después de los 8 metros'
al lote GM, el porcentaie de hibridación baja al 10%'
en este lote fue
ya no se evidencia la contaminación' Aunque la hibridación
alto
menor, el porcentaje de contaminación sigue siendo
para
considerarla
forma la teoría de una planta de
como planta autógama, respaldando de esta
polinización mixta'
En la evaluación de la tendencia de contaminación en las diferentes distancias,
se encontró una pendiente negativa, de la misma manera que en el lote uno,
pero más pronunciada, bajando en un 30% el porcentaje de hibridación
conforme se distanciaban las plantas del lote GM (Figura 11). A pesar de lo
anterior, a los cuatro metros se identifica una fluctuación, por la ausencia de la
hibridación en las plantas del lote refugio, la cual se restablece
al
metro
siguiente.
70
OU
50
40
30
20
10
0
plantas con Bt en el lote dos, según
Figura 11. Porcentaje de contaminación de
el distanciamiento en metros al lote GM'
Entodoslossurcosevaluadoshubohibridaciónconeltransgene'sinembargo
metros de distancia al lote GM
esta fue más evidente en los primeros cinc¡
puede inferir que el flujo de
(figura 12). lgual que en el caso del lote uno se
genes se considera
de
forma azarosa, posiblemente debido
a los agentes
polinizadores ya que el viento define el vuelo de estos.
I
I
Pl{|6Cn
corttanlnáf
Planb
co|tl rlnadPlaú..
cll
LOTEGT
BOLLGARD II @
Figural2.Distribuciónde|acontaminaciónen|osdiferentessurcosevaluados.
La hibridación con el carácter transgénico como lo muestra la figura,
no
presenta un patrón definido de flujo génico lote 2'
5.1.3. Parcela
I
a los 120 dias
con plantas distintas a las
Se tomó una segunda muestra de los lotes refugio
de primera fase, a los 120 días para corroborar la
presencia
de
la
de las muestras las plantas
contaminación. En el momento de la recolección
cápsulas'
se encontraban en la fase de apertura de
las Pruebas
Las plantas evaluadas en esta parcela' según
mostraron diferencias significativas en cuanto
bl
al
estad ísticas no
comPortamiento de la
contaminación (anexo
2).
En comparación con las muestras evaluadas en la
fase uno, el porcentaje de contaminación fue del 85%, mostrando un aumento
considerable de la presencia del transgene en todas las distancias evaluadas
(figura 13)
6
¡
I
5in contamtnar
Contaminadas
I
Figura 13. Contaminación génica en plantas
del
lote dos refugio según la
distancia al lote genéticamente modificado
de la
En la gráfica de la línea de tendencia figura 14' el comportamiento
contaminaciónestotalmentediferentea|opresentadoanteriormente'yaque|a
aumento de la
pendiente en esle caso es positiva' lo que traduce en un
de la planta del lote
contaminación a medida que hay un mayor distanciamiento
refugio con las plantas que tienen el transgene'
A pesar de lo anterior
40% hasta el 100%'
encuentran fluctuaciones que van desde el
62
se
Figura 14. Porcentaje de contaminación de plantas con Bt en el lote dos, según
el distanciamiento en metros al lote GM, con su línea de tendencia'
Los resultados mostraron plantas positivas con patrones de contaminación
1' En
dispersos sin continuidad, igual que las muestras estudiadas en la fase
positiva al transgén
este lote se encontró un 68.9% de las plantas con semilla
Cry 1Ac. Figura 15.
¡+
r+
¡+
¡+
¡+
f
I
¡¡lxnxtr¡
n-tt-
aln
cor¡tln¡n'¡
t
I p¡rt¡er
er*r eomr.mar
63
Figura 15. Distribución de la contaminación en los diferentes surcos evaluados.
La hibridación con el carácter transgénico como lo muestra la figura, no
presenta un patrón definido de flujo génico lote 1 fase 2.
5.1.4. Parcela 2 a los 120 días
Las plantas evaluadas en esta parcela, según las pruebas estadísticas no
mostraron diferencias significativas
contaminación (anexo
4).
en cuanto al
comportamiento
de
la
En comparación con las muestras evaluadas en la
fase uno, el porcentaje de contaminación fue del 31,17o, mostrando un leve
aumento en comparación con esta misma parcela a los 80 días. Es importante
destacar que en esta parcela, no se encontraron muestras con el transgene en
los últimos tres metros de evaluación, una más que en la fase uno (Figura, 16).
6
Figura 16. Contaminación génica en plantas del
distancia al lote genéticamente modificado
64
lote dos refugio según la
En la gráfica de la línea de tendencia Figura 17, el comportamiento de la
contaminación es similar
a la fase uno, con la
negativa, lo que indica que
contaminación.
A
a mayor
presencia de una pendiente
distanciamiento, menor posibilidad de
diferencia de los otros lotes evaluados, los datos no
presentaron fluctuaciones, fueron regulares
en la
disminución
de
la
contaminación en la med'lria que aumenta la distancia al lote de plantas GM.
según
Figura 17' Porcentaje de contaminación de p|antas con Bt en e| |ote dos,
el distanciamiento en metros al lote GM, con su línea de tendencia'
E|patróndecontaminaciónnosedispersódeformaazarosacomoen|asotras
parcelas. (Figura 18)
En
este caso la contaminación con el transgene se
los primeros seis
mantiene casi uniforme en una esquina del lote, solo en
metros de los surcos 1 al 4'
65
r
I
:ffi,Í]
11ffi,..o""
Pl.nb
GT
LOTEGT
BOLLGARD¡IO
---L,'-r--r-i.-
Figura 18. Distribución de la contaminación en los diferentes surcos evaluados.
La hibridación c¡n el carácter transgénico como lo muestra la figura'
no
presenta un patrón definido de flujo génico lote 2fase 2'
génico'
5.2 Dietribución del lote refugio e influencia en el fluio
A|comparar|acontaminaciónconpo|entransgénicoen|osdos|otesrefugio'se
entre los mismos (anexo 5 y 6)' por lo
encontraron diferencias significativas
de los surcos del lote
cual inferimos que existe una relación entre la disposición
plantas convencionales y GM
refugio, con el porcentaje de hibridación entre
(figura
19). El mayor
el
porcentaje de c¡ntaminación génica se encontró en
de los surcos con el lote de
lote uno, el cual conservaba, la misma orientación
lasolantasGM,conunrangopromedioentre60%y71o/opatalasdosfases;
66
en comparación con el lote dos, con un rango entre
24o/o
al 31% de
contaminación, es decir un 50% menos de plantas hibridadas con el transgene.
Vale la pena resaltar que el lote dos tenía los surcos en una disposición
diferente a los surcos del lote de plantas GM.
80
70
o
860
!
5ro
E
¡H¡br¡dadas
c
!30
r
¡No
h¡bridadas
€zo
x
10
0
Figura 19. Porcentaje de plantas hibridas, en los dos lotes y las dos fases. L:
lote F: fase 1 y 2.
cuando se ubica el refugio de manera que se conserva la continuidad entre
plantas GM y plantas convencionales en un mismo surco (como en el lote uno
eva|uado),|aposibi|idaddehibridaciónaumentaconsiderab|emente,|a
que haya un
prolongación del surco GM con las plantas del refugio permite
y mariposas (figura
mayor contacto de agentes polinizadores, como las abejas
que fácilmente
20); además de las mariquitas en estado adultos y sus ninfas'
que
pasan de planta en planta por la cercanía de las hojas' sin diferenciar
pasan de surcos GM
a
convencionales. De igual forma, la proximidad de las
o|antashacequelaatracc¡óno]fatoriade|osnectarios(floralesyextraflora|es:
floral, interno o circumbracteal, enerno o subbracteal, foliar y unipapilado), para
los insectos sea mayor, por ende la polinización cruzada aumentará
considerablemente. Los agentes polinizadores específicos para esta planta
que se reportan en la literatura son principalmente insectos del
Hymenoptera como: Apis do¡sata,
thoracica, Helictus
spp.
orden
A. florea, A. indica, A. mellifera-,
Elis
Megachile spp., Melisssodes spp., Melitoma
euglossorUeg Nomia spp (MacGregor, 1976). En la presente investigación se
presentó en mayores cantidades Apis indica
y algunos
lepidópteros aun no
identificados
flujo gén¡co de plantas
Figura 20. Vectores de polinización que contribuyen al
GM,
a las plantas
convencionales
del lote refugio' (a) Insectos del
hymenóptera
68
orden
Cuando la ubicación del lote refugio no permite esta continuidad entre las
plantas sobre un mismo surco, como
el lote dos de esta investigación,
el
espacio entre surcos (un metro aproximadamente) se podría considerar
hipotéticamente como un factor que disminuye la hibridación entre las plantas
convencionales y las GM. Figura 21.
rl
IIIITITI
I
lt
I
T
IIINN
n
ru
-n
-
I t- 1l- ]-T:l
r t lr -l r r,
ltil
'"1
I
del lote refugio con respecto al lote GM Bollgard
Figura 21. Ubicación
-
ll'
Los
cuadrosro|osrepresentan|asp|antasnohibridadasy|osazu|eslasquesehan
hibridadocone|8f.E||oteunoconservae|mismosentidodelossurcosqueet
loteBolgardll,ademásdepresentarcontinuidadentreplantasmodificadasy
convencionales en
el mismo surco. El lote dos aunque conserva el
(Fase uno)
oaralelo de los surcos, se ubica en surcos diferentes'
69
sentido
Dos agentes pueden interactuar en este proceso: la atracción olfatoria y el tipo
de insecto polinizador. La distancia mínima que hay entre las plantas del lote
refugio y el lote GM (un metro), es la barrera que disminuye la hibridación entre
estos dos tipos de plantas. lnsectos polinizadores como las abejas estas tienen
un vuelo estimado de 5 km a 8km (Allen et a1.,2005) y las mariposas, podrían
llevar el polen con el transgene fácilmente en un mismo surco, por la cercanía
de las flores modificadas y las convencionales. sin embargo estos insectos no
tienen una conducta lineal de vuelo, por lo que esta hipótesis pierde algo de
valor; pero si consideramos el papel que tiene el otro tipo de insectos que
influye en la polinización, las ninfas de mariquitas, al carecer de alas no pueden
pasar tan fácilmente de un surco a otro, por lo que el movimiento de estos
¡nsectos entre plantas conserva el sentido de las surcos, lo que conllevaría a
tener una mayor interacción entre las plantas GM y las del lote refugio. En esta
investigación, aunque no se consideraran
los
niveles de incidencia de estas
ninfasenloslotesunoydos,lapresenciadeestosinsectosfuemuyalto'
que se alimentaban
característica atribuible a la abundancia de presas con las
(mosca blanca). El hecho de que estas ninfas no se pasen entre surcos'
y por
disminuiría la hibridación con el gene Bt, en las plantas convencionales
endedisminuye|acontaminacióngénicacomoocurrióene||otedos.Va|e|a
cerrado las
pena resaltar que a los 80 y 120 días de evaluación' no se habían
plantas de surcos anexos'
calles, por lo que no había interacción entre las
Considerando que
la flor del
oolinización cleistógama
algodonero
se descarta
que
70
presenta
el
un
mecanlsmo
oe
mecanismo vector de la
contaminación sea el viento, ya que los granos de polen son pesados, largos y
están cubiertos de un material viscoso que los adhiere entre sí. Aunque
genéticamente el algodón presenta el mecanismo de autopolinización, el cual,
hipotéticamente evitaría el fenómeno de contaminación génica; los nectar¡os de
la flor del algodonero son una atracción olfatoria para los insectos, debido a
ello, el índice de los polinizadores en estas flores favorece o sobrestima la
polinización c¡uzada, la cual explica los índices de contaminación obtenidos
que fueron dependientes de la distribución del lote entre 24o/o y
Según MacGregor (1976),
el
movimiento
6o0/o.
del polen es posible solo
transporte de insectos ya que el polen es pesado
por
y largo, lo que evita ser
conducido por el viento. Los índices de polinización entomófila reportados por
este mismo autor oscilan entre 2,8
y
18,5 o/o, dependiendo no sOlo del número
de individuos polinizadores, si no del numero de flores presentes en
la
población.
según los análisis estadísticos no se ene¡ntraron diferencias significativas
de muestreo
entre las dos fases de los lotes, lo que nos indica que los tiempos
nofueroninfluyentesen|osresu|tados,@mosi|ofue|adisposicióndelos
lotes de muestreo (anexo 7)
de lotee
5.3 Concentración de toxina CrylAc en semillas hibridadas
refugios.
ELISA de
La cuantificación obtenida en el lector de microplacas de
las
generando resultados
muestras que dieron control positivo fueron variantes'
que van entre 1 ,2 y 12,55 ppm de toxina Cry1Ac' Figura 22'
7t
¡
L1F1
.
L1F2
rL2tl
A I2F2
Figura 22. Concentración promedio de toxina cry1Ac en semilla hibridada entre
plantas de Bollgard ll@ y Nuopal localizada en lote refugio uno'
LaconcentraciónpromediodetoxinaCrylAcencontradaen|assemi||as
hibridadas de los dos lotes fue diferente. En el lote uno fue de
6'02 ppm (pg de
mayor
toxina/ g de tejido verde liofilizado), concentración considerablemente
que el lote dos el cual tenía una concentración de
3,M2 ppm' Según' Zenner'
serían
(1991), las concentraciones de toxina promedio para ambos lotes'
Lo cual' puede alterar
mayores iguales al rango de la DL50 para H' virescens'
ya que los insectos que se críen en
la dinámica funcional de los lotes refugio,
por esta razón' la
estas plantas estarán interac{uando con el transgene;
cantidad de alelos susceptibles
a la acción de la toxina
reduciendo
cruzam¡entos disminuiría considerablemente'
disponibles para
de esta forma
el
Sin embargo esta hibridación solo
tiempo de aparición de la resistencia génica'
refugio' lo que indicaría' que solo
se presentaría en las semillas F1 de los lotes
los insectos que se alimentan de tejido proveniente de la hibridación alogama
de gámetas recombinantes, serian los susceptibles.
Las muestras que dieron positivo a la contaminación con CrylAc en semillas,
se les corroboró su condición de planta convencional mediante una prueba de
PCR (Figura 23). Esta prueba permitío establecer la identidad de las plantas
evaluadas como convencionales pero con índic¿s de contaminación génica.
Figura 23. Electroforesis del material evaluado.
(planta no
MM. Marcador Molecular. C+: control positivo; C-: control negativo,
M5: muestras
transformada); C. Abs: control absoluto (agua); M1, M2, M3' M4'
(Hojas de plantas
de evaluación (Proveniente de semilla hibridada); M6 y M7
que el testigo
hibridadas). Las muestras de 1 al 5 dieron positivo igual
de las muestras
absoluto, la muestras 6 y 7 (correspondientes a las hojas
dieron negativo a la presencia de toxina Cry'
73
I
y 2)
Coaker (1957), Citado por García. 1978, describe el daño que el insecto causa
a la bellota desde el ataque parcial a un lóculo hasta la destrucción completa
de la cápsula. La alimentación en botones contribuye a la pérdida temprana de
estructuras productivas en el algodonero. Durante su alimentación taladran la
estructura
y consumen todo su interior, causando la pérdida de estas y
por
ende la reducción del rendimiento de algodón.
Los lotes refugio fueron desarrollados dentro de los cultivos genéticamente
modificados, como una herramienta que reduciría el fenómeno de la resistencia
en los insectos plaga, al no tener contacto con la toxina Bt; y de esta manera
reducir
la
presión
de
selección. Sin embargo,
lo
encontrado
en
esta
investigación,demuestraque|apreocupaciónde|flujogénicoentrep|antas
modificadas
y
convencionales
es pertinente, ya que se en@ntraron en
el transgen
cápsulas procedentes de plantas no modificadas, semillas con
desde el primer metro evaluado hasta el noveno metro'
una planta que presenta
Genéticamente, se ha identificado el algodón, como
puede traducir' en un alto nivel
un mecanismo de autopolinización, lo cual se
si consideramos
de homogeneidad en cuanto a sus alelos' especialmente'
los
que les dan la connotación de transgénico' Sin embargo
aquellos
de polinización pueden
fitomejoradores consideran que estos mecanismos
contemplar un 5
%
y un
de fecundación cruada para las plantas autógamas
plantas alógamas (Vaissiére'
mismo porcentaje de autofecundación en las
1990). Lo anterior, conduce
a
poblaciones F1 que
homogéneas genéticamente'
74
no son
totalmente
Algunos estudios de polinización cruzada sugieren que el movimiento de polen
disminuye muy rápido a medida que aumenta la distancia a la fila donde se
encuentra el polen marcado, y la transferencia de polen más allá de 12 metros
es muy baja. Vaissiére, (1990) preparó un estudio conteniendo una revisión de
la
literatura sobre polinización
de algodón y un resumen de su
estudio,
"Dispersión y Traslado de Polen en Algodón Upland", conducido en Texas en
1983.
El estudio de Texas se llevó a cabo utilizando una línea macho estéril rodeada
por plantas masculinas fértiles. se suministraron sesenta colonias de abejas.
Los resultados mostraron que el traslado de polen en algodón disminuye en
y
proporción a la inversa de la distancia a la ftla polinizadora más cercana no
hubountras|adosignificativodepo|enmása||áde|osl2metros'Meredithy
Bridge(1973);CitadoporVaissiére(1990),nodetectaronoutcrossingentre
p|antasadyacentesenunestudiorealizadoenStonevil|e,MS;e||ímite
y los métodos fue de
aproximado de detección para el tamaño de la muestra
aproximadamente 0-046%
(1990), se reafirma que la
En otros estud¡os mencionados por Vaissiére
conforme aumenta la
frecuencia de polinización cruzada natural disminuye
Según estos autores' se ha
distancia entre las plantas donadoras y receptoras'
natural puede disminuir desde
visto que la frecuencia de polinización cruzada
hileras con 2 m de separación y c€ro en
2,17Vo enh¡leras adyacentes a 1 ,42 en
hileras a 10 m de distancia
75
Algunos estudios realizados en USA citados por (Rufina, S.F.., Citado por
Vaissiére (1990)) revelan la importancia de las abejas en el cultivo de algodón
ya que gracias a su efecto de polinización el cultivo aumenta su producción de
capsulas. Este estudio de 2 años investiga la relación entre la producción de
algodón y la proximidad de las fuentes de abejas en un campo de algodón Bt
de regadío, utilizando un campo similar, sin las abejas para la comparaciÓn'
Durante el año uno, los indicadores de rendimiento de algodón disminuyeron al
aumentar la distancia de las fuentes de abejas en el campo de las abejas, lo
que corresponde con la disminución de la actividad de forrajeo de abejas con el
aumento de distancia de las fuentes de abejas. No hubo tales tendencias entre
las
los indicadores de rendimiento o actividad de las abejas y la distancia de
año dos
esquinas de campo. Tendencias similares se encontraron durante el
delestudio,cuandoelestadodecampo(deabejaonodeabejas)seinvirtió'
los campos que
Hubo, sin embargo, un número significativo de las abejas en
no abejas en ambos
años'
Estos resultados sugieren un impacto positivo
de algodón'
significativo de las abejas de consulta sobre el rendimiento
de miel sobre los
Este estudio sugiere un impacto positivo de las abejas
a,
indicadores de rendimiento de algodón respecto
el algodón Bt, según
lo
con el aumento de distancia
indicado por la disminuciÓn del peso del algodón
consistentes durante los dos
de la fuente de las ábeias. Las tendencias fueron
cambiadas de un campo de
años del estudio, aun cuando las abelas fueron
estudio a
en
otro. Las tendencias se han detectado igualmente
campos de
productores,conuncontrollimitadosobrelascondicionesexper¡mentales'
Otras fuentes de variación que se incluyeron fueron las tendencias hacia tasas
de crecimiento mayor de algodÓn, más tarde la floración al aumentar la
distancia de los bordes de campo
y las variaciones en las condiciones
climáticas entre años. Aunque el estudio menciona otras fuentes de variación
estas no son consistentes con los patrones observados
parcialmente
y
pueden ocultar
el impacto de las abejas (Rufina, S.F.., Gitado por Vaissiére
(1990).
77
vl. coNcLusroNEs
Se determinó la presencia de toxina Cry'lAc, en semillas provenientes de
cápsulas de plantas de algodón ubicadas en los lotes refugio, lo cual es un
indicio de la contaminación génica entre plantas con el transgene y las plantas
del lote refugio, esto nos demuestra que la función determinada para los
campos refugio no es efectiva y se pierde el objetivo primordial que es
el
de
disminuir la resistencia en insectos lepidópteros.
Se encontró que |a h¡br¡dación con e| transgene en |os |otes refug¡o, es
superior
al
encontrada
250/o,
pese a su condición de planta autógama. La concentración
en la presente investigación es mayor a lo reportado en
la
literatura.
de p|antas GM, afecta
La distribución de |os surcos entre e| |ote refugio y e| |ote
cons¡derab|emente|aposibi|idaddelf|ujogénicoentreestosdostiposC|e
ya que los insectos se
plantas. Y por ende la contaminación con el transgene'
les facilita el paso de planta GM a plantas convencionales'
no es una condición que
La autógamia de plantas de algodonero transgénico
evita el flujo génico
y
la c¡ntaminación con el transgene' debido a
la
proximidad entre plantas'
oolinización cruzada por insectos y a la
existentes en los cultivos del
Los altos porcentajes de fecundación cruzada
revisar la política de contratación
algodonero transgenico, hacen pertinente
7A
entre agricultores y casas comerciales, para evitar las demandas por el uso
ilegal de la semilla genéticamente modificada.
VII. RECOfTENDACIONES
Para montajes de lotes refugio se recomienda, variar la ubicación en cuanto a
la distribución de los surcos, evitando así la continuidad de estos con los surcos
de los lotes de plantas GM. De igual forma aumentar la distancia entre los
surcos continuos correspondientes a lotes GM y lotes refugio'
se debe considerar el manejo de hospederos alternos para disminuir el impacto
en
de resistencia ocasionado por la toxina Cry; encontrado como contaminante
los lotes refugio.
génico hacia los lotes refugio
Se recomienda continuar con los estudios de flujo
(Bollgard ll)' de
en otras localidades del país donde se siembre esta tecnología
dos periodos
igual forma ampliar este tipo de estudios considerando
la resistencia'
algodoneros para determinación la evolución de
79
VIII. BIBLIOGRAFIA
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tx. ANEXOS
89
Anexo
1.
Resultados estadísticos ANOVA Fase 1 Lote 1
Sistera
SAs
Procediniento
VariabLe dependiente:
GLl.l
concentracionl concentr¿ción fase 1, lote
suna
de
Cuadrado de
Fuente
DF
cuadfados
¡bdeIo
a
4&.7Aa384
Error
36
3645-919309
TotaI correcto
44
40a6.ro7693
R-cuadrado
9.797724
la media F-Valor Pr > F
55.O2354a O.s4
701.275536
l|sE conce¡t.acionl
coef va¡
Raiz
757 .6743
7A.06357
t lests
Errcr de cuadrado
Valor crÍtico de t
6.384938
medio
0.9s
r07.2755
2.g2as9
Oiferencia Feños significativa
la
nisma
letra
L2.9gA
no son significativamente diferentes'
Núñero de
t
l¡lediaobservaciones
Agrupamiento
T
A
12.551
5
t5
A
9.507
5
t3
A
7.95A
5
t8
7.380
5
t2
5.787
5
t4
4.729
5
t1
4.580
5
t9
2.653
5
t7
A
A
lledia
(LSD) Para concentracionl
Alfa
Error de grados de libe.tad
iledias con
1.
lote 1
Anexo 2. Resultados estadísticos ANOVA Fase 2'
90
0.8159
Sistena
SAS
Procedimiento
GLü
variable dependiente: concentracion2 concentración Fase 2, Iote
de
1
Fuente
DF
cuadrados
cuadrado de
Ia nedia
¡,lodeIo
a
209.L76444
26.139556
Ef'ror
36
1559.936000
41.331556
Tot¿l coaaecto
44
7769.052444
l6F
R-cuadrado
coef Var
Raiz
s.71a20a
7L6.9737
6.5a267].
t
¡¡oTA; Este
suña
F-VaIor
0.60
concentracion2 ¡ledia
5.671111
de error coiPariso¡rise de
tipo I,
no
eI índice
experiñentuise.
g.o5
Alfa
Errc. de grados de tibertad
Er.or de cuad.ado ñedio
valor crítico de t
DifeFencia n€nos
36
LO7.27S'
2.O28O9
significativa
12.908
Ia nisna Ietra no son significativamnte diferentes'
Núltero de
t
Agrupaniento
¡ledia observaciones
T
12.551
5
t5
9.591
5
t3
7.95A
5
t8
7.380
5
t2
5.7A1
5
t4
4,729
5
t1
4.SAO
5
t9
2.653
5
t7
2.329
5
t6
91
F
0.7644
Tests (LsD) Para concentracionl
test cootrola el Índice
Medias coñ
Pn >
de
Anexo 3. Resultados estadíst¡cos ANOVA Fase 1. Lote 2
Procediniento
GLll
Variable dependiente: concentracion3 concentración Fase
Fuente
DF
f,lodelo
8
Sum de
cuadrados
110,289855
44
lloTA: Este
1.33
¡tSE
coef var
Raiz
0.227604
794.L224
9.LL9937
de
concentracionS ia€dia
4.694025
erro¡ coíParisonwise de tipo I, no eI índice
exPerimentYise.
Alfa
o 'os
36
Enror de grados de libertad
A3,77324
Erron de cuadrado nedio
2.g2ao9
valor crítico de t
Diferencia nenos
la
ñisma
letra
significativa
11.698
no son significativaFente diferentes'
Núnero de
t
Agrupamiento
A
BA
BA
BA
BA
BA
BA
BA
8A
BA
B
B
B
B
B
lledia observaciones
t2,o24
9.047
a.342
8,238
2.E15
1.816
g.oeo
o,o@
a.g@
97
5
5
5
5
5
s
5
5
5
T
t3
t5
t2
t6
t1
t7
t4
t8
t9
F
0.2623
Tests (LSD) Para concentiacion3
test controla eI Índice
l,ledias con
>
3a76.555627
R-cuadrado
t
F-Valor Pr
83.173244
2994,236790
co¡recto
2
cuadrado de
la ñedia
882.318837
Err9r
lotal
1, Iote
de
Anexo 4. Resultados estadísticos ANOVA Fase 2. Lote2
Procediniento
GL¡l
2, Iote
Variable dependieñte: concentfacioM concentnaclon Fase
suma
de
Fuente
DF
cuadrados
itodelo
8
63.360¿W
Error
44
coef
R-cuadrado
t
Este
la media F-Valor Pr > F
1.19
7.929@@
5.6453333
Raiz
Van
ilSE
concentracion4 ¡l€dia
2,577A54
1,386667
Tests (LSD) Pa.a concentracion4
test controla el Índice
de error corparisoneise de
tipo I,
ño
el índice
experiñentwise.
alfa
Error de grados de libentad
Error de cuadrado nedio
valon
crítico
de
Diferencia nenos
o'05
36
5'645333
2.02499
t
siSnificativa
3'
3066
ll€dias con Ia nlsna Letra no son si8nificativanente diferentes'
tlúnero
t
Agrupamieñto
A
A
0.3311
392.5926990
185.9010
o.209397
¡¿oTA:
Cuad.ado de
239.232A@g
Total correcto
2.
de
iledia observaciones
T
3.2@
5
t3
2.800
5
t1
2.560
5
t4
1.680
5
t5
!.200
5
t2
1.W
5
t6
o.w
5
t7
0.6@
5
t8
o.goo
5
t9
93
de
Anexo 5. Resultados estadíst¡cos ANOVA concentrac¡ones totales
Procediniento 6t}|
Variable deDendiente: concentracionl concentraciones Totales
suna de
cuad.ados
cuadrado de
Fuente
DF
¡bdeIo
t4
1s67.82397
Ernor
155
9725.AA578
Total correcto
t79
R-cuadaado
0.146613
Fuente
LOTE
FAsE
T
Suncos
Coef
Ia ñedia F-valor Pr > F
7
7
a
4
0.gta7
55.30791
7A693.62975
Var
R¿iz
llSE
concentaacionl l¡ledia
L63.ga2g 7.436929
DF
2.O2
t77.9a743
Tipo
I 5s
cuadrado de
La media
4.535185
F-valo¡ Pr
&1.7425624 &L.7425624
1a2,273A925 L82.273AA25
@a.4P54É74 76.050¡6759
J76,OO22ga6 94.9€€5504
94
7.25
3.30
1.38
7.70
>
F
g.go1a
0.9713
0-2!@
0.1525
Anexo 6. Resultados prueba T para Lotes
t
l,loTA: Este
ennor
Tests (LsD) para concentraclón Lotes
test contaola €1 índice
d€
error coíparison{ise de tipo
I,
no
el indice
exp€rinentrise.
Alfa
O.O5
libertad
nedio
Enror de grados de
Enror de cuadrado
Valor c¡ítico de t
Diferencia nenos
¡tedias con
la nisna letra
165
55.30791
significativa
7.97445
2.1889
no son significativaipnte diferentes'
Núnero de
t
AgFupaoiento
B
l{édiaobservaciones
LolE
6.O2a
90
Lotel
3.642
9O
Lote2
95
de
Anexo 7. Resultados prueba T para Fases
t
error
tloTA: Este
Tests (LSD) para concentracionl
test contrcIa eI índice
de errer comparisonwise de
tipo I,
no
el índice
exoeainentrrse'
Alfa
Errlr
A.g5
de grados de libertád
Errer de cuadnado nedio
válor crítico de t
Diferencia nenos
lledias con Ia misna
t
letra
165
55.30791
significatlva
7.97445
2.1889
no son si8nificativan€nte diferentes.
Número de
Ag.upaniento
¡lediaobsenvaciones
FASE
5,541
90
fAsEl
3.529
9O
Fase2
9b
de
Anexo 8. Resultados prueba T (X) de contaminación
en
Distanc¡as en metros.
Procedimiento Glll
t
error
NoTA: Este
Tests (Lso) para Concentracines de fratafiientos (n€tros)
test contnola eI indice
de error comparisonwise de
tipo I,
no
el índice
exDe¡lñentutse.
Alfa
Errlr
Error de cuad.¿do
Valor crítico de t
Oiferencia menos
¡ledias con
fibe.tad
ñedio
o.gs
de g.ádos de
la nisoa letra
165
55.3a79!
!.97Ms
siSnificativa 4.&34
no son siSnificativaltente diferentes.
Nún€ro de
t
Agrupaniento
A
BA
BA
8A
BA
BA
BA
BA
BA
BA
lledia observaciones
T
8.119
t5
7
.243
20
t3
4.777
t2
4.699
t6
4.@6
tt
3,489
t8
3.O25
t9
B
2.767
t4
B
2.697
B
B
B
97
20
t7
de
Anexo 9. Resultados prueba T para contaminación en las Distanc¡as en metros.
Procediniento
t
NOTA:
Este
GL¡l
Tests (Lso) pata concet.ación por ñetnos
de error comparisonrise de
e|"rcr
experimentt¡ise.
test controla ef índice
Alfa
Iibertad
oedio
Dif€.encia [enos
l¡ledias con
eI Índice
165
55.30791
significativa
7'97Ms
J
'46I
Ia nisna letra no son siSnificativanente diferentes'
Núnerc de
t
no
0.05
Error de grados de
EFrcr de cuadrado
Valor crítico de t
tipo I,
Agrupamiento
A
llediaobservaciones
Surcos
6.4A
36
54
BA
8A
BA
BA
BA
5.529
36
51
4,U4
36
52
3.798
36
53
B
2.257
36
55
98
de