Download el cannabidiol inhibe la angiogénesis mediante múltiples mecanismos

 EL CANNABIDIOL INHIBE LA ANGIOGÉNESIS MEDIANTE MÚLTIPLES MECANISMOS REVISIÓN MCCR El componente no psicoactivo del Cannabis Sativa, el cannabinoide (CBD), con estudios se
ha podido demostrar sus acciones anti-proliferativas y pro-apoptóticas sobre diversos
tumores, así con sus propiedades pro-angiogénicas, el CBD logra inhibir eficazmente el
crecimiento de diferentes tipos de tumores y así también regula algunas señales proangiogénicas producidas por las células del glioma. Gracias a su perfil farmacológico y su
baja toxicidad, se han podido hacer estudios sobre la capacidad del CBD para modular la
angiogénesis tumoral. Lo que se hizo primero en este estudio fue evaluar el efecto del CBD
sobre las células endoteliales umbilicales de la vena humana (HUVEC), la proliferación y la
viabilidad a través del ensayo y análisis FACS, así como en la prueba clásica de cámara de
Boyden y en un ensayo de cicatrización de heridas. Consiguiente se investigaron los
efectos del CBD sobre las proteínas relacionas con la angiogénesis liberas por HUVEC. Al
final se evaluaron sus efectos sobre la angiogénesis en HUVEC, y se obtuvo que con esto
invaden una capa Matrigel.
Después de estas pruebas o exámenes se pudo ver que el CBD indujo citostasis HUVEC sin
inducir apoptosis, también se pudo notar que el CBD inhibe la migración HUVEC, a su vez la
invasión, la germinación y la angiogénesis en las esponjas Matrigel. Al final de los estudios
se pudo concluir que estos efectos estaban asociados con la baja modulación de varias
moléculas relacionadas con la angiogénesis. En conclusión con esto se puede asegurar que
el CBD ejerce un efecto anti-angiogénico potente al afectar ampliamente carias vías
implicadas en este proceso, y que su efecto doble tanto en los tumores como en las células
endoteliales sugiere que el CBD podría representar un medicamento potencial para la
terapia del cáncer.
2015
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RESUMEN HISTORIAL Y OBJETIVOS : Varios estudios han demostrado acciones anti-proliferativas y pro-apoptóticas de los
cannabinoides sobre diversos tumores, junto con sus propiedades anti-angiogénicss. El
cannabinoide (CBD) inhibe eficazmente el crecimiento de diferentes tipos de tumores y
regula algunas señales pro-angiogénicas producidas por las células de glioma. Como sus
propiedades anti-angiogénicas no han sido examinadas a fondo hasta la fecha, y teniendo
en cuenta su perfil farmacológico y toxicológico muy favorable, aquí, se evaluó la capacidad
del CBD para modular la angiogénesis tumoral.
APROXIMACIÓN EXPERIMENTAL : En primer lugar, se evaluó el efecto del CBD sobre células endoteliales umbilicales de la
vena humana (HUVEC) la proliferación y viabilidad a través del ensayo y análisis FACS tanto
en una prueba clásica de cámara de Boyden y en un ensayo de la cicatrización de heridas.
Después se investigó los efectos del CBD sobre diferentes proteínas relacionados con la
angiogénesis liberadas por HUVECs, utilizando un kit de gama de la angiogénesis y un
ELISA dirigida a MMP2. Luego evaluamos sus efectos sobre la angiogénesis en HUVECs, con
esto invaden una capa Matrigel y en esferoides HUVEC incrustados en geles de colágeno, y
caracterizado además sus efectos mediante un modelo de esponja Matrigel de la
angiogénesis en ratones C57/BL6.
RESULTADOS CLAVES : El CBD indujo citostasis HUVEC sin inducir apoptosis, inhibe la migración HUVEC, la
invasión, la germinación y la angiogénesis en las esponjas Matrigel. Estos efectos se
asociaron con la baja modulación de varias moléculas relacionadas con la angiogénesis.
CONCLUSIONES E IMPLICACIONES: Este estudio revela que el CBD inhibe la angiogénesis por varios mecanismos. Su doble
efecto tanto en tumor y células endoteliales apoya la hipótesis de que el CBD tiene
potencial como un agente eficaz en la terapia del cáncer.
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ABREVIACIONES : ET-1, endotelina-1; HUVEC, células endoteliales de vena umbilical humana; PDGF-AA, factor
de crecimiento AA derivado de plaquetas; TIMP1, inhibidor tisular de metaloproteinasas 1;
uPA, de tipo uroquinasa activador del plasminógeno.
INTRODUCCIÓN : Varios estudios han demostrado que los cannabinoides ejercen una acción inhibidora
sobre la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer, y son capaces de disminuir la
velocidad o detener el crecimiento de diferentes modelos de xenoinjertos de tumor en
animales de experimentación. Estos datos han atraído un creciente interés por la
explotación clínica de terapias contra el cáncer basadas en cannabinoides. Recientemente,
además de sus acciones anti-proliferativas y proapoptóticas, se ha demostrado que los
cannabinoides pueden afectar a otros procesos importantes en la génesis de tumores, en
particular la angiogénesis. La angiogénesise es la formación de nuevos vasos sanguíneos
de los pre-existentes, representa una parte esencial del crecimiento tumoral, invasión y
metástasis y constituye un objetivo terapéutica para la terapia del cáncer. Diversas
acciones celulares complejas están implicadas en la angiogénesis, tales como degradación
de la matriz extracelular, migración y proliferación de células endoteliales, diferenciación
morfológica de las células endoteliales para formar tubos. Todos estos procesos requieren
un equilibrio afinado entre las señales inhibitorias y estimulantes. Las señales estimulantes
incluyen
factores
de
crecimiento,
tales
como
VEGF,
integrinas,
angiopoyetinas,
quimioquinas, así como otros factores. Las moléculas que inducen señales inhibidoras
incluyen trombospondina, interferones y otras citocinas, así como otros factores
inhibidores de la angiogénesis endógenos, que pueden dirigirse a las células endoteliales
ya sea directamente o indirectamente. Los cannabinoides que se unen a los receptores
CB1 y CB2 de cannabinoides (WIN5512-2, HU210, JWH133 y THC) se han reportado para
inhibir la supervivencia celular endotelial vascular y la migración como parte de su acción
anti-angiogénica. El tratamiento con estos cannabinoides reduce la densidad vascular en
tumores experimentales. Además, los cannabinoides son también capaces de suprimir la
producción del factor de pro-angiogénico, así como inducir directamente la apoptosis de
las células endoteliales.
El cannabinoide no psicoactivo, el cannabidiol (CBD), que tiene una afinidad muy baja para
los receptores CB1 y CB2 de cannabinoides, pero de forma variable interfiere con los
receptores de potencial transitorio (TRP), los receptores y receptores de PPAR, se ha
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informado de inhibir el crecimiento de varios tumores. El tratamiento de células de glioma
con CDB desencadena la apoptosis / autofagia, la activación de la cascada de caspasas, el
estrés oxidativo, así como la modulación de la ruta de la lipoxigenasa y el sistema
endocannabinoide.
Las propiedades anti-angiogénicas del CBD no se han investigado a fondo hasta la fecha.
Dado su perfil farmacológico y toxicológico muy favorable, aquí, hemos investigado las
propiedades anti-angiogénicas del CBD sobre las células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC). Se encontró que el CBD induce citostasis de células endoteliales sin
inducir la apoptosis, inhibe la migración de células endoteliales, la invasión y germinación y
la angiogénesis inhibida.
MÉTODOS: REACTIVOS: Los productos químicos estándar y reactivos para cultivo celular se adquirieron de SigmaAldrich Srl (Milán, Italia). El recombinante murino VEGFA y el recombinante murino TNF-a
se adquirieron de Peprotech (Offenbach, Alemania); la heparina se obtuvo de Sigma
(Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Alemania). El CBD fue un generoso regalo de GW
Pharmaceuticals (Salisbury, Reino Unido). Se disolvió inicialmente en etanol a una
concentración de 50 mM y se almacenó a -20 ° C y se diluyo adicionalmente en un medio
de cultivo tisular; la concentración final de etanol nunca superó 0,05%.
CULTIVOS DE CÉLULAS: HUVEC fueron ya sea aislados a partir de cordones umbilicales mediante digestión con
colagenasa como se describe por Jaffe o comprado de Promoción de la célula (Heidelberg,
Alemania) o Lonza (Basilia, Suiza). Estas ex células fueron cultivadas rutinariamente en
medio 199 (M199), suplementado con 20% de suero bovino fetal inactivado térmicamente
(FBS), 25 mg · ml de factor de crecimiento-1 de células endoteliales y 50 mg · ml-1 de
heparina. Este último se cultivó en medio de crecimiento endotelial como se indica por el
proveedor. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de atmósfera humidificada
de CO2 y se utilizan entre el segundo y el octavo paso.
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Para los estudios, las células se sembraron en medio completo, y después de 24 h de
incubación, el medio se reemplazó por medio con 2% de FBS que contienen el compuesto
a ensayar a las concentraciones indicadas.
PRUEBA DE MTT: Para determinar los efectos del CBD sobre la proliferación celular, el (MTT) ensayo
colorimétrico se llevó a cabo como previamente reportado. Brevemente, las HUVEC se
sembraron en medias completas en una de múltiples pocillos de fondo plano de 96
pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo. Después de 24 h, el medio se
reemplazó por un medio con 2% FBS y 2 ng · ml-1 de VEGF y las células se trataron con CBD
a las concentraciones indicadas durante 24 h. Al final de la incubación con el fármaco, de
MTT (0,5 mg · ml-1 de concentración final) se añadió a cada pocillo y se continuó la
incubación durante 4 h más. Los cristales de formazán insolubles se solubilizaron
mediante la adición de 100 ml de 100% de sulfóxido de dimetilo. Las placas se leyeron a
570 nm, usando un lector de placas de microtitulación automático y el control de
porcentaje se calculó como la absorbancia de las células tratadas por las células de control
X 100.
ANÁLISIS CITOFLUORIM ÉTRICO: HUVEC (6 x 105) se incubaron con diferentes concentraciones de CBD durante 24 h en 2%
FBS medio completo. Las células se sedimentaron y se re suspendieron en un regulador de
unión Anexina V-(HEPES 0,01 M (pH 7,4) y NaCl 0,14 M; mM de CaCl2 2,5). La fluoresceína
isotiocianato de Anexina V y 7-amino-actinomicina D (BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.)
se añadieron a cada tubo de ensayo y se incubaron durante 15 min a temperatura
ambiente en la oscuridad. Las células fueron lavadas en PBS, los sobrenadantes descartan
y se re suspendieron en 400 ml en un regulador de unión. Las muestras se adquirieron con
fluoro citometría de flujo utilizando un FACSCanto (BD Biosciences) y se analizaron
utilizando el software FACSDiva 6.1.2. El experimento se realizó dos veces y cada condición
era por duplicado.
ENSAYO DE MIGRACIÓN CELULAR – CÁMARA DE BOYDEN Y ENSAYO DE CURACIÓN DE HERIDAS DESDE CERO: Los ensayos de migración HUVEC se realizaron en una cámara de Boyden modificada de 48
pocillos
como
se
describe
anteriormente.
Brevemente,
los
filtros
Nucleopore
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polivinilpirrolidona de policarbonato libres (8 mm) recubiertas con 10 mg · ml-1 de
colágeno de tipo IV se colocaron sobre una cámara inferior que contiene M199
suplementado con 10% de FBS como el factor atrayente. Las células, suspendidas en M199
que contiene ácido graso de 1% de BSA libre, se incubaron durante 1 h con las
concentraciones indicadas de CBD, y después se añadieron a la cámara superior a una
densidad de 5 x 104 células por pocillo. El CBD era continuamente presente durante los
experimentos. Después de 6 h de incubación a 37 ° C, las células no migradas en la
superficie superior del filtro se separaron por raspado. Las células que migraron al lado
inferior del filtro se tiñeron con tinción Diff-Quick, y 5 campos de unidad por filtro se
contaron a 160 aumentos con un microscopio (Zeiss, Oberkochen, Alemania).
Los ensayos se realizaron por triplicado. Para investigar la migración de HUVEC, las células
se sembraron a una concentración de 4 x 104 células · 500 ml-1 de medio por pocillo en
placas de cultivo de 24 pocillos. Después de 24 h, las mono capas confluentes se rayan con
una punta de pipeta de plástico para crear un uniforme, la zona libre de células “herida” y
tratados con CBD a las concentraciones indicadas. El vacío creado y el tiempo necesario
para que las células migren a la zona se registraron por microscopía de contraste de fase
utilizando un objetivo de 10x, a los 0, 16 y 24 h. En cada punto de tiempo, se tomaron ocho
fotografías de cada área de la herida y el efecto migratorio se cuantificó contando las
células presentes en la brecha utilizando el software ImageJ.
ELISA: Los HUVEC se sembraron en medio completos en un multipocillo de 24 pocillos de fondo
plano a una densidad de 5 x 104 células por pocillo. Después de 24 h, el medio se
reemplazó por medio con FBS al 2% y 2 ng · ml-1 de VEGF y las células se trataron con CBD
a las concentraciones indicadas durante 24 h. Al final del periodo de incubación, se
recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron y el contenido de proteína se determinó de
acuerdo con el ensayo BCA (Pierce, IL, EE.UU.). Las muestras (50 ml) se añadieron a pocillos
individuales en una placa de micro pocillos recubiertos comercialmente con un anticuerpo
policlonal contra MMP2 humana. Después de 2 h a temperatura ambiente, los pocillos se
lavaron y se añadieron anticuerpos de detección contra MMP2 conjugados con peroxidasa
de rábano picante. Los pocillos se lavaron después y la solución de sustrato, que contiene
tanto el peróxido de hidrógeno y tetrametilbencidina como cromógeno, se añadió durante
30 min a temperatura ambiente. Después de la adición de la solución de parada, la
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intensidad del color se midió a 450 nm en un lector de micro placas (EL800, Bio-Tek,
Winooski, VT, EE.UU.).
Los valores de absorbancia de las muestras desconocidas se encontraban dentro de la
gama de linealidad de la prueba de ELISA, evaluada por las curvas de calibración obtenidas
con cantidades conocidas de MMP2.
ANIMALES: Ratones machos (6-7 semanas de edad, 20 g de peso corporal) se mantuvieron con una
dieta estándar de bolitas chow y tuvieron libre acceso al agua, con ciclos de 12 h luz /
oscuridad. De tipo salvaje (WT), los animales (cepa C57/BL6; Charles River, Italia) Se han
usado 7 días después de la llegada. Los grupos de ocho ratones se utilizaron para cada
tratamiento para un número total de 40 animales. Los animales se controlaron
diariamente para el estado de salud. Todos los procedimientos se realizaron con apego a
los lineamientos publicados por el Ministerio de Sanidad italiano (DL116/92) y las directivas
de la Comunidad Europea que regulan la investigación con animales (86/609/CEE). Los
resultados de todos los estudios con animales se presentan de acuerdo con las directrices
de llegada.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO : Los resultados se presentan como media ± SEM. La significación de las diferencias se
evaluó mediante ANOVA de una vía, seguido de un análisis post-hoc de la prueba de
Dunnett, realizado con el paquete de software Prism (GraphPad Software for Science, Inc.,
San Diego, CA, EE.UU.).
RESULTADOS : CBD INHIBE LA PROLIFERAC IÓN DE HUVEC En primer lugar, se investigó si el CBD podría afectar a la proliferación de HUVEC. La
adición de CBD a las células durante 24 h dio como resultado una inhibición dependiente
de la concentración del metabolismo oxidativo mitocondrial, como se determina por el
ensayo MTT. El rango de concentraciones ensayadas WA desde 1 mM a 19 mM. No se
observaron diferencias estadísticamente significativas desde el mando a concentraciones
de 9 mm o mayor. La reducción de MTT a 9 mM era 36,2%, con una IC50 de la inhibición de
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MTT de 9,90 1,02 mm. Estos hallazgos indican que el CBD inhibe la proliferación de HUVEC,
como la actividad metabólica medida por MTT refleja el número de células.
CBD NO INDUCE TOXICIDAD O APOPTOSIS EN HUVECS Para verificar si el CDB fue citotóxico o apoptosis inducida por las células endoteliales, se
realizó
un
análisis
de
la
viabilidad
citofluorimétrica.
HUVEC
se
expusieron
a
concentraciones diferentes de CDB mM durante 24 h, y, después de la incubación, las
células se analizaron tanto para Anexina V y 7-amino-actinomicina D. Se observó un alto
porcentaje de células viables (aproximadamente 90%) en todas las muestras, sin diferencia
significativa entre las células tratadas y no tratadas. Estos datos muestran que el CBD no
tenía ningún efecto tóxico sobre las HUVEC, lo que sugiere que los efectos inhibidores
ejercidos por CBD en HUVEC no se debieron a la apoptosis o la toxicidad sino más bien a la
citostasis.
CBD INHIBE POTENTEMENTE LA MIGRACIÓN HUVEC Para investigar si el CBD es capaz de modular la migración de HUVEC, se empleó un ensayo
de cámara de Boyden modificada de 48 pocillos. El tratamiento de CBD causó una
disminución en la migración celular del 30% al 75% en el rango de 1 -10 mM, y la
significación estadística se alcanzó a 1 mM, a concentraciones mucho más bajas que las
que inducen citostasis (ensayo de MTT, IC 9,90 1,02 mM). Para confirmar este efecto antimigratorio, se realizó un ensayo de curación de heridas de cultivo celular. Las imágenes de
la zona de la herida sin células fueron tomadas después de 16 h y 24 h. En el grupo control,
las células han emigrado en la brecha, mientras que en células tratadas con CBD hay una
clara reducción de la migración. La cuantificación de los datos mostró un efecto
dependiente de la dosis de CBD en la inhibición de la migración de células evidente
después de 16 h de tratamiento y persiste durante hasta 24 h.
CBD INHIBE LA ANGIOGÉNESIS El modelo de esponja se utiliza como un sistema rápido y cuantitativo para la medición de
la actividad anti-angiogénica de CBD disuelto en Matrigel. Un cóctel de VEGF, el TNFa y la
heparina, se mezcla con el Matrigel, induce una reacción angiogénico fuerte. Cuando se
añadieron concentraciones crecientes de CBD a esta mezcla, se observó una inhibición
significativa de la respuesta angiogénica, como se detecta midiendo el contenido de
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hemoglobina de los geles recuperados. A la dosis más baja empleada, el efecto de CBD,
aunque todavía significativo, fue menor, lo que sugiere un efecto dependiente de la dosis.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES La angiogénesis es un proceso de múltiples pasos altamente regulado que involucra
migración quimio táctica endotelial de células, invasión, la proliferación, la diferenciación
en los capilares tubulares, y la producción de una membrana basal alrededor de los vasos.
En este estudio, el CBD exhibe propiedades anti-angiogénicas potentes, inhibiendo el
crecimiento de HUVEC, la migración y la invasión, así como la angiogénesis en el ensayo de
esponja de Matrigel. Los estudios moleculares han demostrado que el CBD ejerce sus
efectos a través de la baja regulación de varios mecanismos angiogénicos. En conjunto,
estos datos sugieren que el CBD tiene un gran potencial como un nuevo medicamento
anti-angiogénico.
Nuestros resultados demostraron que el CBD fue eficaz en la inhibición de la proliferación
de células endoteliales sin inducir apoptosis de células endoteliales o necrosis, lo que
sugiere una acción citostática. Varios fármacos quimioterapéuticos tienen propiedades
antiangiogénicas sólo en cerca o totalmente concentraciones citotóxicas, por lo tanto, su
relevancia clínica es controvertida. Curiosamente, el CDB no indujo apoptosis o necrosis
HUVEC incluso con la dosis más altas probadas (12 mM). Varias moléculas antiangiogénicas inhiben la proliferación de células endoteliales, sin ejercer ninguna acción
citotóxica y puede incluso inhibir la apoptosis en las células endoteliales. Esto parece estar
en contraste con sus efectos sobre las células tumorales, donde a menudo estos
compuestos son citotóxicos, al menos en dosis altas. Sin embargo, esto puede depender
de varias características de las células tumorales, incluyendo el estrés crónico relacionado
con la producción de alto nivel de oxígeno y otros radicales, alteraciones metabólicas y la
dependencia oncogén. Además estrés celular en las células tumorales empuja la celda por
encima del umbral y en la apoptosis, mientras que en las células normales, esto puede
actuar como una forma de estímulo ‘pre acondicionamiento’ que hace que las células más
resistentes a insultos posteriores.
La falta de CBD de la citotoxicidad hacia las células endoteliales es muy diferente de la
reportada en estudios previos con otros cannabinoides. En estos estudios, la citotoxicidad
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de las células endoteliales se consideraron un mecanismo potencial de la acción. Nuestros
datos sugieren que, a diferencia de otros cannabinoides, los efectos del CBD no se deben a
la toxicidad de las células endoteliales, sino más bien a la modulación de las vías
intracelulares que conducen a una disminución de varios factores pro-angiogénicos. El CBD
mostró una potente inhibición de la migración celular endotelial, tanto en el ensayo de
curación de la herida y de cero, con un efecto aún más fuerte, en el ensayo de cámara de
Boyden. La diferente eficacia de CBD en estas pruebas podría atribuirse a la diferente
sensibilidad de los ensayos, puesto que el ensayo de curación de la herida es en general
menos sensible que la cámara de Boyden. Por otra parte, el uso de HUVECs frescos
primarios en la cámara de Boyden en comparación con las células disponibles
comercialmente empleadas en el ensayo de curación de la herida podría ser responsable
de la diferente potencia observada.
Sin embargo, en nuestras manos, el CBD provocó efectos significativos en la migración a
concentraciones más bajas que las que causan 50% de inhibición de la proliferación.
Nuestros datos actuales no nos permiten indicar un dependiente del receptor frente al
mecanismo
independiente
del
CBD
en
HUVEC.
Dado
que
ambos
mecanismos
dependientes e independientes de cannabinoides se muestran anteriormente para CBD
efectos anti-tumorales, también es posible que su actividad anti-angiogénica pueda ser
debido a un mecanismo independiente del receptor que implica diferentes objetivos
celulares primarios. En línea con esto, estudios recientes han demostrado que los efectos
anti-invasivos y anti-proliferativos del CBD en cáncer de mama están estrechamente
asociados con la inhibición de Id-1, un inhibidor de factores de transcripción hélice bucle
hélice básicos que se sobre expresa en células tumorales. Los ID de proteínas juegan un
papel vital en la regulación de la angiogénesis durante el desarrollo embrionario y la
génesis tumoral y ectópico Id-1 de expresión en HUVECs conduce a un aumento de la
migración de las células, mientras que la supresión de sus resultados de la expresión
endógena de migración reducida. Por lo tanto, Id-1 podría representar una vía de
señalización clave para CBD en HUVEC.
En conclusión, nuestros resultados indican que el CBD ejerce un efecto antiangiogénico
potente al afectar ampliamente varias vías implicadas en este proceso. Su doble efecto
tanto en el tumor y las células endoteliales sugiere, además, que el CBD podría representar
un agente eficaz potencial en la terapia del cáncer.
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I NFORMACIÓN
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PUBMED ID: PMC3504989
PMCID: 22624859
Nombre Original: Cannabidiol inhibits angiogenesis by multiple mechanisms
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