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análisis
2°C 8°C
4200-16
MICROWELL ELISA
BETA-2 MICROGLOBULINA
KIT DE ANÁLISIS ENZIMO-INMUNOENSAYO
Enzimo-Inmunoensayo para la Medición
Cuantitativa de Beta-2 Microglobulina
(B2MG) en Suero Humano.
Introducción
La Beta-2 Microglobulina humana (B2MG) es
una proteína de 11.8 kD, idéntica a la cadena
ligera del antígeno HLA-A, -B y C. La B2MG es
expresada en células nucleadas y es encontrado en
bajos niveles en el suero y orina de individuos
normales. Las concentraciones de B2MG
aumentan en enfermedades inflamatorias, algunas
enfermedades virales, disfunción renal y
enfermedades autoinmunes. Está disponible un
número de publicaciones que explican la
interpretación de los niveles de B2MG en suero,
en la evaluación del estado de individuos con
varias condiciones clínicas. El EnzimoInmunoensayo
permite
la
determinación
cuantitativa de B2MG en suero. En este análisis,
la B2MG en las muestras está ligada a un exceso
de anticuerpos monoclonales contra la B2MG,
que son inmovilizados en la superficie de los
pocillos de microtitulación. Después de un lavado
para remover todas las sustancias extrañas, la
cuantificación de la B2MG unida se lleva a cabo
agregando una enzima (Peroxidasa de rábano
picante o HRP), que también se enlaza a la
B2MG. La cantidad de enzima es directamente
proporcional al contenido de B2MG. El sustrato
es entonces convertido a un compuesto
cromogénico que puede ser determinado
fotométricamente a 450 nm.
Materiales y componentes
Materiales proporcionados con el kit de análisis:
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

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Placa de microtitulación recubierta de
anticuerpo Anti-Beta-2 MG con 96 pocillos.
Diluyente de muestra, 100 mL
Reactivo conjugado enzimático, 22ml.
Estándares de referencia de B2MG, 1 set
(líquido), listo para usar. 1.0 ml
Sustrato TMB, 12 ml.
Solución STOP, 12 ml.
Materiales requeridos, más no proporcionados:

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
Pipetas de precisión y puntas, 0.1ml, 0.2ml,
1ml y 5ml.
Agua destilada.
Puntas desechables para pipeta.
Mezclador Vortex.
Papel absorbente o toallas de papel.
Lector de placa de microtitulación.
Papel milimetrado.
Uso del test B2MG EIA
El test Beta-2 Microglobulina EIA es un EnzimoInmunoensayo (EIA) para la medición de Beta-2
Microglobulina en el suero como ayuda para el
diagnóstico de la artritis reumatoidea activa y
enfermedad renal.
Recolección y preparación de muestra
1.
2.
3.
La sangre debe ser tomada utilizando técnicas
de venopunción estándar, y el suero debe ser
separado de las células rojas tan pronto como
sea posible. Evite muestras gravemente
hemolizadas, lipémicas o turbias.
Las muestras de plasma recolectadas en
tubos, que contengan EDTA, heparina, u
oxalato,
podrían
interferir
con
los
procedimientos del análisis y deben ser
evitados.
Las muestras deben ser tapadas y
almacenadas por hasta 48 horas a 2-8°C antes
de realizarse el análisis. Las muestras
retenidas por un período más largo pueden ser
congeladas a -20°C por hasta 6 meses previos
al análisis. Las muestras descongeladas deben
ser invertidas muchas veces para mezclarlas
antes del análisis.
Almacenamiento de los kits de análisis e
instrumentación
Los kits de análisis que no han sido abiertos deben
ser almacenados a 2-8°C después de ser recibidos
y la placa de microtitulación debe mantenerse en
una bolsa sellada con desecantes para minimizar
la exposición al aire húmedo. Los kits de análisis
que han sido abiertos permanecerán estables hasta
la fecha de expiración mostrada, siempre y cuando
sea almacenada como se ha prescrito arriba. Un
lector de placa de microtitulación con un ancho de
banda de 10 nm ó menos y un rango de densidad
óptica de 0-2 DO ó mayor, a una longitud de onda
de 450 nm; es aceptable para medir la
absorbancia.
Preparación del reactivo
Todos los reactivos deben ser llevados a
temperatura ambiente (18-22°C) antes de su uso.
Todos los reactivos deben ser mezclados
girándolos o invirtiéndolos suavemente antes de
su uso. NO permita la formación de espuma.
Procedimiento del análisis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Para mejores resultados tanto, las muestras de
suero del paciente como los sueros control,
deben ser diluidos antes de ser utilizados.
Prepare una serie de tubos pequeños (como
tubos para microcentrífuga de 1.5 ml) y
mezcle 10 l de suero con 1.0 ml de diluyente
de muestra (dilución 101). No diluya los
estándares; ya han sido pre-diluídos.
Asegure el número deseado de pocillos
recubiertos en el soporte. Administre 5 l de
estándares B2MG, muestras diluidas y
controles diluidos en los pocillos adecuados.
Agregue 200 l de diluyente de muestra.
Mezcle suavemente por 10 segundos. Incube
a 37°C por 30 minutos.
Remueva la mezcla de incubación vaciando el
contenido de la placa en un contenedor de
basura. Enjuague y vacíe la placa de
microtitulación 5 veces con agua destilada.
Golpee la placa de microtitulación en papel
absorbente o toallas de papel para remover
todas las gotas de agua residuales.
Dispense 200 l de reactivo de enzima
conjugada en cada pocillo. Mezcle
suavemente por 10 segundos. Incube a 37°C
por 30 minutos. Remueva el contenido y lave
la placa como se describe arriba, en el paso 3.
Dispense 100 l de de solución TMB en cada
pocillo. Mezcle suavemente por 10 segundos.
Incube a temperatura ambiente en la
oscuridad por 20 minutos.
Detenga la reacción añadiendo 100 l de
solución STOP a cada pocillo. Mezcle
suavemente por 10 segundos. Es muy
importante asegurarse de que el color azul
cambie a amarillo completamente. Lea la
densidad óptica a 450 nm con un lector de
placa de microtitulación en 15 minutos.
Nota Importante:
1.
2.
3.
El procedimiento de lavado es crítico. Un
lavado insuficiente tendrá como resultado
poca precisión y lecturas de absorbancia
falsamente elevadas.
Se recomienda no utilizar más de 32 pocillos
para cada análisis si se usa manualmente la
pipeta, ya que para todos los estándares de
pipeteo manual, muestras y controles deben
ser completados en 5 minutos. Una placa
llena de 96 pocillos puede ser utilizada si está
disponible el pipeteo automatizado.
La duplicación de todos los estándares y
muestras, aunque no es requerida, es
recomendada.
Cálculo de resultados
Calcule la media de absorbancia por cada set de
estándares de referencia para la B2MG, muestras
y controles. Construya una curva de calibración
graficando la media de la absorbancia obtenida de
cada estándar de referencia contra su
concentración en g por ml en papel milimetrado,
con los valores de absorbancia en el eje vertical ó
Y y las concentraciones en el eje horizontal ó X.
El mejor ajuste de la curva para el análisis de
programación es cuadrático. Utiliza la media de
los valores de absorbancia para cada muestra, para
determinar la correspondiente concentración de
B2MG en g por ml en la curva de calibración. Se
recomienda que las muestras sean analizadas por
duplicados. Ya que los estándares B2MG han sido
diluidos 1:101, no hay necesidad de que las
muestras y controles sean multiplicados por el
factor de dilución.
Ejemplo de una curva de calibración
Los resultados de un típico análisis estándar con
una lectura de densidad óptica a 450nm mostrada
en el eje Y, contra las concentraciones de B2MG
mostradas en el eje X. Esta curva de calibración
tiene sólo el propósito de ilustrar y no debe ser
utilizada para calcular muestras desconocidas.
Cada usuario debe obtener sus propios datos y
curva de calibración.
Valores B2MG (g/ml)
0
0.5
2.0
5.0
10.0
20.0
Absorbancia (450 nm)
0.040
0.334
1.035
1.930
2.599
3.394
Conc. de Beta-2 MG
Valores esperados y sensibilidad
Se espera que los individuos saludables tengan
valores de B2MG por debajo de 2.0 g/ml.
Limitaciones del procedimiento
1.
2.
3.
Serán obtenidos resultados confiables y
reproducibles cuando el procedimiento de
análisis se lleve a cabo con una plena
comprensión de las instrucciones incluidas en
el inserto, sumado a la buena práctica de
laboratorio.
El procedimiento de lavado es crítico. Un
lavado deficiente resultará en poca precisión
y lecturas de absorbancia falsamente
elevadas.
Anticuerpos
heterófilos
tales
como
anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) son
frecuentemente encontrados en el suero de
sujetos humanos. Esos anticuerpos pueden
causar interferencia severa en muchos
procedimientos inmunodiagnósticos, Este
análisis ha sido diseñado para minimizar ese
tipo de interferencia. Sin embargo, la
eliminación total de esa interferencia en todas
las muestras de pacientes no puede ser
garantizada. Un resultado de análisis que sea
inconsistente con la imagen clínica y el
historial del paciente debe ser interpretada
con precaución.
Referencias
1. Berggard I and Beam AG: 1968. Isolation and
properties of a low molecular weight ß2-globulin
occurring in human biological fluids. J Biol Chem
243: 4095-4103.
2. Grey HM, Kubo RT, Colon SM, Poulik MD,
Cresswell P, Springer T, Turner M and
Strominger JL: 1973. The small subunit of HL-A
antigens is ß2-microglobulin. J Exp Med 138:
1608-1612.
3. Nakamuro K, Tanigaki N and Pressman D:
1973. Multiple common properties of human ß2-
microglobulin and the common portion fragment
derived from HL-A antigen molecules. Proc Natl
Acad Sci 70: 2863-2865.
4. Evrin PE and Wibell L: 1972. The serum levels
and urinary excretion of ß2-microglobulin in
apparently healthy subjects. Scand J Clin Lab
Invest 29: 69-74.
5. Crisp AJ, Coughlan RJ, Mackintosh D, Clark B
and Panayi, GS: 1983. ß2-microglobulin plasma
levels reflect disease activity in rheumatoid
arthritis. J Rheumatol 10: 954-956.
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