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“Clonado, expresión, caracterización y localización
subcelular de las dos deshidrogenasas de la Vía de las
Pentosas Fosfato en Trypanosoma cruzi (Glucosa 6 -fosfato
deshidrogenasa y 6 -fosfogluconato deshidrogenasa)”
Tesis para optar al título de Dr. en Biología Molecular y Biotecnología.
Autor: Bioq. Mariana Igoillo Esteve.
Director: Dr. Juan José Cazzulo.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTIN.
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLÓGICAS
(IIB-INTECH/CONICET)
ABRIL de 2005.
A la memoria de mi abuela.
Agradecimientos.
Deseo expresar mi agradecimiento a todas personas que, en distintos ámbitos hicieron posible
la concresión de este trabajo de Tesis:
*Al Dr. Cazzulo por su confianza y por haberme permitido trabajar en su laboratorio con total
libertad todos estos años.
*Al Instituto de Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad de General San Martín.
*A la Dra. Lena Aslund por enviarnos gentilmente el EST de T. cruzi (AI057839).
* A la Dra. Stefania Hannau, por suministrarnos los inhibidores de la 6PGDH y por sus muy
útiles consejos.
*A Vanina y Fabiola por su amistad y por las largas charlas científicas y no tan científicas que
muchas veces me permitieron mirar las cosas de otra manera y encontrar el camino para seguir
adelante.
*Al resto de los chicos del Lab: Gaby, Ana, Paula, Dante y Gregor por su buena onda y su
impagable ayuda en los momentos de tener que salir corriendo a las cuatro de la tarde para
buscar a los chicos a la escuela.
*Al Dr. Cannata, (nuestro becario de terminación) por su calidéz, su buena onda, y
fundamentalmente por darnos el ejemplo de que cuando uno realmente siente pasión por lo que
hace no existen límites de edad ni tiempo para seguir avanzando y aprendiendo.
*A Berta por su paciencia y empeño en purificar una y mil veces tripomastigotes metacíclicos
para los experimentos de estrés.
*A Agus y Liliana por suministrarnos los epimastigotes, tripomastigotes de cultivo y
amastigotes, por su calidez y diposición.
*A Pablo por su enorme ayuda (y paciencia) en la compaginación de todo este trabajo de Tesis.
*A Mara, Alejandra, Andrea, Andrés, Inés, Marcela, Marianita, Georgina, Luisa, Fabiana, Geo,
Griselda, Alejandro, Javier, Juan, Fernán, Adriana, Vanina, Nico, Fernanda, Susana y Marilén
por su buena onda que hizo que venir a trabajar al Instituto haya sido un verdadero placer.
*A Zulma, por su amistad, su enorme paciencia para tratar de ordenar el caos que
muchas veces (y sobre todo este último tiempo dejaba en el Lab) y por dejarnos
siempre el matecito listo para tomar fuerzas antes de empezar a trabajar.
*A Miguel Flores por su buena onda y disposición.
*A Mónica, Teresa y Nelly.
*A Ernesto, Susana, Carmen, Graciela, Mirna y Mónica.
*A mis padres, por su apoyo.
*A mi tía Marta, por su confianza, su apoyo, sus consejos y cariño.
*A Flopi y Agus, por ser la luz de mi vida, por darme fuerzas para seguir adelante y
tratar de superarme día a día para darles lo mejor.
Finalmente quiero agradecer de manera muy especial a Daniel, por su enorme
paciencia, por su apoyo incondicional, por ser excelente padre, esposo y compañero,
porque sin su apoyo esta Tesis hubiese sido posible.
Indice
Introducción
1 – 40
Enfermedad de Chagas
1-7
Características generales
1–3
Diagnóstico de la enfermedad
4–5
Tratamiento de la enfermedad
6
Perspectivas para el desarrollo de nuevos agentes
quimioterapéuticos
Control vectorial
6
Trypanososma cruzi
Infección y ciclo de vida
7
7 - 22
7 - 11
Características ultraetructurales de T. cruzi
12 - 22
El núcleo
12 – 13
Estructura y genoma
Regulación de los genes nucleares
La superficie celular
14 - 15
Los microtúbulos
Arquitectura de membranas, transportadores y entrada de
drogas.
Bolsillo flagelar, vía endocítica y secretoria
15 - 16
Vía endocítica y reservosomas.
Vía secretoria
El flagelo
Mitocodria y kinetoplasto
16
16 - 17
Editado del RNA.
Glicosomas
17 - 22
Características generales
Características ultraestructurales y funcionales.
Acidocalcisomas
Vías metabólicas y su posible explotación para el desarrollo de
nuevos agentes quimioterapéuticos.
22
22 - 40
Vía glicolítica
22 - 25
Proteasas
25 - 27
Mecanismos de defensa contra el estrés oxidativo.
28 – 31
Metabolismo de poliaminas.
31
Metabolismo de esteroles y lípidos. Señalización y
diferenciación celular
Vía de las Pentosas Fosfato.
31
32 – 40
Glucosa 6- fosfato deshidrogenas.
6- fosfogluconato deshidrogenasa.
Objetivos
41
Glucosa 6- fosfato deshidrogenasa
Resultados G6PDH.
42 – 89
42 – 76
Identificación y clonado de la G6PDH de Tripanosoma cruzi.
42 – 44
Organización genómica de la G6PDH de T. cruzi
45 – 48
Análisis de la secuencia primaria de la G6PDH.
48 – 50
Expresión de la G6PDHcorta y G6PDHlarga recombinantes de T. cruzi
50 – 52
Determinación de la masa molecular aparente de subunidad de la
G6PDH activa de T. cruzi.
Efecto del DTT sobre la actividad enzimática de la G6PDH de T.
cruzi.
Determinación de los parámetros cinéticos de la G6PDHcorta y
G6PDHlarga de T. cruzi.
Determinación de actividad de G6PDH en extractos totales de los
distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi clon CL Brener.
Localización subcelular de la G6PDH en los distintos estadíos el
ciclo de vida de T. cruzi.
Análisis de la expresión de la G6PDH frente a estrés oxidativo en
tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.
52 – 53
Discusión G6PDH.
6- fosfogluconato deshidrogenasa.
Resultados 6PGDH
Identificación, clonado y análisis del número de genes de la
6PGDH de T. cruzi .
53 – 56
57 – 62
62 – 63
64 – 71
71 – 76
77 – 86
87 – 117
87 – 113
87 – 89
Clonado del gen de 6PGDH de T. cruzi en el vector de expresión
pET28a(+).
89 – 90
Análisis de la secuencia primaria de la 6PGDH de T. cruzi.
90 – 93
Expresión de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.
93 – 95
Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa
95 – 96
Modelado molecular y mutaciones sitio dirigidas de la 6PGDH de
T. cruzi.
Determinación de pH óptimo y parámetros cinéticos.
96 – 100
100 – 105
105 – 108
Detección de actividad de 6PGDH en extractos totales de T. cruzi,
purificación parcial de la enzima nativa y determinación de sus
parámetros cinéticos.
Estudios de inhibición de la 6PGDH de T. cruzi.
108 – 111
Localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi.
111 – 113
Discusión 6PGDH.
Conclusiones generales.
Materiales y Métodos
Cultivo de parásitos y obtención de extractos libres de células
114 – 117
118 -120
121 – 146
121
Purificación parcial de la 6PGDH de T. cruzi nativa.
121 – 122
Preparación de los plásmidos.
122 – 123
Mini preparación de los plásmidos .
Preparación de plásmidos para transfectar.
Ligaciones.
124
124 – 125
123
Preparación de bacterias competentes, electrocompetentes y
transformación.
Preparación de bacterias competentes.
123 – 124
123 - 124
Preparación de bacteris electrocompetentes.
Transformación bacteriana mediante shock térmico
Transformación bacteriana mediante electroporación.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes.
124
124 – 126
Expresión de las G6PDHlarga y G6PDHcorta recombinantes.
124 – 125
Purificación de las G6PDHlarga y G6PDHcorta recombinantes.
125 – 126
Expresión y purificación de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.
126
Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).
126
Tinción de geles de poliacrilamida.
127
Tinción con Coomasie Brillant Blue.
Tinción con nitrato de Plata.
Digestión tríptica en gel de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.
Electrotransferencia de proteínas y Western blot.
Obtención de anticuerpos anti G6PDH y 6PGDH .
128
128 -129
129
Purificación de anticuerpos específicos anti-G6PDH.
130 – 131
Acople de la G6PDH recombinante a la matriz.
130
Purificación de los anticuerpos mediante cromatografía de afinidad.
Determinación de masa molecular aparente por filtración en gel.
Determinación del peso molecular aparente de la G6PDHcorta activa
de T. cruzi.
Determinación del peso molecular aparente de la 6PGDH activa de
T. cruzi
Ensayos enzimáticos.
130 – 131
131
132 – 137
Determinación de actividad de la G6PDH de T. cruzi.
132
Determinación de pH óptimo para la G6PDHcorta de T. cruzi
132.
Determinación de los parámetros cinéticos de la G6PDHcorta y
G6PDHlarga de T. cruzi.
Determinación de actividad de la 6PGDH de T. cruzi.
132– 133
133
Determinación de pH óptimo para la 6PGDH de T. cruzi.
134
Determinación de los valores de Km aparentes y reales para la
6PGDH de T. cruzi. Perfiles de inhibición.
Estudios de inhibición.
134
135
Determinación de concentración proteica.
135
Modelado molecular de la 6PGDH de T. cruzi.
136
Preparación del ARN total de parásitos mediante el método de TRIZOL.
136
Transcripción reversa, síntesis de la primera hebra de ADNc.
137
Preparación de ADN total de T. cruzi.
137
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Colony PCR.
Mutación del gen de 6PGDH.
138 – 139
138
138 - 139
Digestión de ADN genómico con enzimas de restricción.
139
Marcación de sondas por PCR.
140
Southern blot.
140 – 141
Northern blot.
141
Electroforesis en campo pulsante (Pulse Field gel electroforesis)
142
Preparación de muestras.
Electroforesis y detección de los genes de la G6PDH de T. cruzi.
Microscopía de fluorescencia.
Inmunofluorescencia indirecta utilizando segundos anticuerpos
acoplados a fluoróforos .
Marcación del bolsillo flagelar de epimastigotes de T. cruzi y colocalizazción con la G6PDH.
Marcación del aparato de Golgi en epimastigotes de T. cruzi y colocalización con la G6PDH.
Transfección de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.
Análisis de la expresión de la G6PDH frente a estrés oxidativo en
epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.
Bibiografía
143 – 144
143
144
144
144 – 145
145 – 146
147 – 156
Introducción.
Introducción - 1
Enfermedad de Chagas.
Características generales.
La tripanosomiasis Americana o enfermedad de Chagas fue descubierta en 1909 por Carlos Chagas al
detectar parásitos flagelados en sangre periférica de una niña de dos años que padecía una enfermedad
cuyos signos y síntomas no se correlacionaban con los de ninguna de las patologías descriptas hasta el
momento. Meses después, este mismo científico describía y le daba nombre al agente causal de esta
enfermedad: Trypanosoma cruzi, un parásito flagelado del orden de los Kinetoplástidos que, junto con
Trypanosoma brucei, agente causal de la enfermedad del sueño, (ambos del género Trypanosoma), y
Leishmania sp, causante de leishmaniasis viscerales y tegumentarias, pertenecen a la familia
Trypanosomatidae. Carlos Chagas continuó llevando a cabo un exhaustivo estudio de esta patología,
publicando numerosos trabajos referentes a características clínicas de la enfermedad, poblaciones de
riesgo y diagnóstico en su etapa aguda. Actualmente la enfermedad de Chagas es considerada una
patología endémica de América del Sur y Central y afecta a más de 18 millones de personas; siendo
mayoritariamente afectados los sectores más carenciados de la población [Prata; 2001]. La enfermedad
es transmitida fundamentalmente a través de las deyecciones, en el momento de la picadura, de insectos
pertenecientes a la familia Reduviidae subfamilia Triatominae: Triatoma infestans (conocido vulgarmente
como Vinchuca) que se distribuye en el Norte de Argentina, Chile y Uruguay; como así también en
Bolivia; Paraguay; Sur de Peru y Sur-Este de Brasil, Panstrongylus megistus, Triatoma dimidiata y
Rhodnius prolixus (Fig.1). También se conocen otras formas de transmisión de la enfermedad, de
menor frecuencia pero de gran importancia: la transfusión de sangre, el trasplante de órganos y la vía
congénita. Esta última excede el área de transmisión endémica vectorial pudiendo ocurrir en zonas no
endémicas. El riesgo de transmisión está presente durante cualquier etapa de la infección materna y el
parásito puede infectar al feto con o sin compromiso placentario. La transmisión de la enfermedad de
Chagas a través de transfusión sanguínea fue comprobada por Freitas en 1952 en Brasil, y actualmente
es el segundo mecanismo en frecuencia de transmisión, superando también los limites de las áreas
endémicas de transmisión vectorial. El riesgo de transmisión de la enfermedad por sangre y hemoderivados,
radica en que T. cruzi es capaz de sobrevivir en sangre total mantenida a 4ºC por períodos prolongados,
en hemoderivados de sangre, concentrados de glóbulos rojos y crío precipitados. Son viables hasta 250
Introducción - 2
Rhodnius prolixus
Triatoma dimidiata
Triatoma infestans
Panstrongylus megistus
Fig.1. Zonas endémicas para la enfermedad de Chagas en América del Sur y Central. Distribución geográfica de
los distintos insectos vectores (pertenecientes a la familia Reduviidae subfamilia Triatominae) transmisores de la
enfermedad.
días en muestras con citrato, a temperatura ambiente y en sangre refrigerada hasta 18 días. [Rosa y col;
2001]. Debido a su importancia epidemiológica, numerosos países de América Latina se han abocado
al estudio de la clínica y serología de la enfermedad, habiéndose determinado la existencia de variadas
manifestaciones clínicas, como así también diferencias geográficas en la prevalencia de las mismas y en
la respuesta a los tratamientos. Las manifestaciones clínicas en el estado agudo facilitan su diagnóstico y
están caracterizadas por: inflamación edematosa en el sitio de la infección (Chagoma), y síndrome de
Romaña; comienzan entre los 6 y 10 días post infección y pueden permanecer de 1 a 2 meses. Sin
embargo, numerosos casos agudos pasan desapercibidos, ya que cursan con síntomas generales tales
como, fiebre, linfoadenopatías, y rash cutáneo. Es importante destacar que unicamente en la etapa
aguda de la enfermedad los parásitos pueden detectarse en sangre periférica, ya que una vez establecido
el balance inmunológico entre el huésped y el parásito, el número de trypomastigotes circulantes disminuye
sustancialmente, haciéndose imposible un diagnóstico parasitológico directo. Luego de dicha etapa, los
pacientes se convierten en asintomáticos, un 70- 85 % de ellos continúan en ese estado por el resto de
su vida (esta presentación es conocida como la forma indeterminada del Chagas crónico), mientras
que un 27 % sufre cardiopatías crónicas (miocardiopatía chagásica), un 6 % padece lesiones digestivas
(megaesófago y megacolon), y un 3 % presenta desórdenes neurológicos (manifestaciones que pueden
aparecer de 10 a 25 años después de la infección inicial). Este amplio espectro sintomatológico ha
Introducción - 3
desencadenado largos debates acerca si se debe a diferencias genotípicas del parásito, al trasfondo
genético del huésped, a factores del medio ambiente, o a la combinación de todos ellos. Es ampliamente
conocido que T. cruzi está compuesto por un pool de organismos denominados cepas, stocks o
aislamientos, que circulan entre los huéspedes mamíferos y el insecto vector y que presentan marcada
heterogeneidad en morfología, virulencia, patogenicidad, tamaño del genoma, antígenos de superficie y
sensibilidad a drogas. Unos de los grandes desafíos para la comunidad científica ha sido la determinación
de marcadores genéticos de T. cruzi que permitan realizar el diagnóstico de la enfermedad, tipificar las
poblaciones parasitarias, agrupar las distintas cepas en grupos definidos, y reconstruir su evolución
histórica [Fernandes y col ].
Con fines diagnósticos los blancos genéticos deben ser especie-específicos, preferentemente abundantes
y conservados entre las distintas poblaciones. Para tipificación, en cambio, los blancos moleculares
deber permitir la discriminación de poblaciones dentro de una misma especie. En estos casos, las regiones
intergénicas del DNA han sido ampliamente utilizadas, ya que son zonas con alta frecuencia de mutagénesis,
comparado con el resto del genoma. En el caso particular de T. cruzi se ha desarrollado una técnica
denominada low-stringency single-specific primer polymerase chain reaction (LSSP-PCR) que está
dirigida a la región variable del kinetoplasto (DNA parasitario mitocondrial). Dicha técnica ha sido
utilizada con la finalidad de tipificar parásitos aislados de distintos órganos, y ha permitido detectar coinfecciones por distintos clones de una misma cepa que difieren en su tropismo por organos o tejidos.
A su vez, mediante el análisis de patrones electroforéticos de diferentes isoenzimas, técnicas de riboprinting,
la utilización de marcadores de microsatélites y el análisis de genes de mini exón; se ha podido separar
a T.cruzi en dos subgrupos altamente divergentes denominados linaje tipo 1 y linaje tipo 2. El primero
está conformado por parásitos que afectan a una amplia gama de mamíferos y cuyo ciclo de vida se
desarrolla fundamentalmente en un ambiente selvático. El otro, en cambio, comprende parásitos que
poseen un rango de huesped más restringido, se distribuyen en un hábitat peridoméstico, y son
considerados los principales agentes causales de la enfermedad de Chagas [Barrett y col; 2003]. T.
cruzi es un organismo diploide, y si bien posee una reproducción prominantemente asexual,
determinando que las distintas cepas sean consideradas poblaciones clonales [Tibayrenc y col; 1986],
se ha demostrado que también puede sufrir intercambio genético dentro de su hospedador mamífero.
Esto último hace que los datos de estructuras poblacionales deban ser tomados con precaución.
Introducción - 4
Diagnóstico de la enfermedad.
En la etapa aguda, los estudios están centrados en la búsqueda del parásito en sangre. Debido a que
la sensibilidad de los métodos utilizados es variable, se aconseja seguir con una rutina diagnóstica predeterminada:
* Examen directo: búsqueda de T.cruzi en sangre periférica. Es un método 100% específico, pero de
muy baja sensibilidad, dando numerosos falsos negativos.
* Método de Strout: este método concentra los elementos parasitarios mediante centrifugación. La
especificidad es de 100% y la sensibilidad de 95%.
* Microhematocrito: la sangre es extraída por capilaridad mediante punción digital o plantar en tubos
de microhematocrito, centrifugándose posteriormente. Este método es recomendado en los recién
nacidos, por la escasa cantidad de sangre utilizada. Su sensibilidad es de 95% y la especificidad de
100%.
* Xenodiagnóstico: este método continúa siendo el de elección en la etapa aguda, por su especificidad
de 100% y sensibilidad cercana a 100%, debido a la amplificación parasitaria producida.
* Hemocultivo: consiste en la siembra de sangre venosa en un medio apropiado en busca de crecimiento
parasitario (Civila y col; 1991).
En la etapa crónica de la enfermedad las parasitemias son transitorias, esto hace que la probabilidad de
detectar el parásito en sangre sea muy baja y que el diagnóstico se base en la detección de anticuerpos
circulantes anti T. cruzi. El diagnóstico serológico se realiza de manera rutinaria, se lleva a cabo la
determinación de IgM (en la etapa aguda de la enfermedad), y de IgG en la etapa crónica. Se recomienda
utilizar por lo menos dos técnicas complementarias al mismo tiempo para identificar a un paciente como
chagásico, y de acuerdo a pautas establecidas por la OMS una de ellas debe ser la inmunofluorescencia
indirecta (IFI). Esta técnica posee una sensibilidad del 100% y una especificidad cercana a 100%. Se
consideran títulos significativos las diluciones superiores a 1/30. Las demás métodos serológicos utilizados
son:
* Hemaglutinación indirecta (HAI): se consideran títulos significativos los superiores a la dilución 1/
16.
* ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): se destaca su utilización para “screening” por su
alta sensibilidad. (Civila y col; 1991).
Para el caso de Chagas congénito, es sumamente importante tener en cuenta que sólo es posible realizar
un tratamiento curativo de la enfermedad en su etapa aguda, por lo que los métodos de elección serán
Introducción - 5
aquellos basados en la observación directa del parásito en la sangre del neonato, constituyendose asi un
diagnóstico de certeza. Los métodos inmunoserológicos permiten detectar la presencia de IgM fetal
específica y la presencia de IgG específica materna en los primeros seis meses, y propia luego del sexto
mes de vida. La totalidad de los recién nacidos hijos de madre chagásica tienen serología convencional
positiva por pasaje transplacentario de anticuerpos IgG durante los primeros seis meses de vida. Las
IgM específicas son detectadas por IFI, aglutinación directa (AD) o ELISA de captura. Si estos resultados
resultan positivos se debe intensificar la búsqueda del parásito, ya que antes de los seis meses de vida
solo deben tratados aquellos niños en quienes se haya comprobado la presencia del parásito [Civila y
col; 1991].
Los métodos serológicos mencionados anteriormente utilizan antígenos de epimastigotes de T. cruzi
semi-purificados, lo que conduce en muchos oportunidades a tener falsos positivos, o resultados no
concluyentes, sobre todo en casos de co-infección de T. cruzi y Leishmania. También distan bastante
de ser ideales para la determinación de la enfermedad en su fase aguda temprana, y en individuos con
bajos títulos de anticuerpos anti T. cruzi. Ante ésta problemática, la búsqueda de nuevos métodos, más
sensibles y confiables, sigue siendo un desafío para la comunidad científica de los países Latinoamericanos.
En los últimos años, la Agencia Internacional de Energía Atómica, mediante un trabajo colaborativo
entre seis países de América Latina ha desarrollado un ELISA que utiliza una mezcla de antígenos
recombinantes de T. cruzi (JL8, MAP, y TcPo) que mostró ser más confiable y sensible que los
utilizados hasta el momento. Los antígenos JL8 y MAP están constituídos por repeticiones de 14 y 38
residuos de aminoacidos respectivamente, y están fuertemente conservados en diferentes cepas y
aislamientos de T. cruzi. Los resultados obtenidos con éstos antígenos son similares a los reportados
para el antígeno SAPA (shed acute-phase antigen) que se ha empleado en la deteccción de Chagas
agudo [Frasch, 1994 ] [Breniere y col; 1997], sin embargo, la combinación de JL8 y MAP [Levin y col;
1991]; ha demostrado tener alta sensibilidad, (99.4%) y especificidad (99.3%) en la etapa crónica de
la enfermedad, y también ha aumentado mucho la sensibilidad del diagnóstico en individuos en la etapa
aguda de la infección (84,2%) [Umezawa y col; 2004]. Actualmente existen también diversas técnicas
en estudio para el diagnóstico de esta enfermedad. Caben citar, por ejemplo, ELISA directo para la
detección de antígenos en la etapa aguda, tanto en sangre como en orina; la búsqueda de enzimas
parasitarias en sangre, y la detección de ADN parasitario mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), ésta última técnica esta comenzando a estar disponible para la realización de diagnósticos de
rutina de la enfermedad de Chagas. [Marcon y col; 2002].
Introducción - 6
Tratamiento de la enfermedad.
El tratamiento etiológico en la enfermedad de Chagas está dirigido a erradicar el parásito, evitar la
aparición o progresión de lesiones viscerales e interferir en la cadena de transmisión.
Dicho tratamiento se indica en: infección aguda, infección congénita, reactivaciones en inmunodeprimidos
e infección crónica indeterminada (exclusivamente en niños y menores de 14 años). Antes de realizar el
tratamiento, la infección debe ser confirmada mediante técnicas de referencia cuantitativas ya que la
disminución de los títulos pos-tratamiento constituyen un indicador de buena respuesta terapéutica en
los casos agudos [Rosa y col; 2001].
La terapia para la enfermedad de Chagas ha dependido de dos drogas nitro-heterocíclicas, el Nifurtimox
y el Benznidazol. El primero es un nitrofurano introducido en la década de 1960 para el tratamiento de
la patología en el estado agudo, es una droga tripanocida, fundamentalmente para los trypomastigotes
circulantes, y es mejor tolerada en pacientes jóvenes. El mecanismo de acción de Nifurtimox involucra
un metabolismo reductivo que lleva a la formación de radicales libres del oxígeno altamente tóxicos
[Packchanian; 1957]. El Benznidazol, por su parte, es un 5’-nitroimidazol que se dió a conocer en la
década del 70, y su efecto se produciría a través de la unión a macromoléculas produciendo daño a nivel
del DNA. Debido a que los tratamientos con ambas drogas son prolongados, a que producen serios
efectos secundarios, y a que su eficacia es parcial, ya que no son efectivos para el tratamiento del
Chagas crónico; la necesidad de desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos se ha convertido en
una problemática de carácter urgente para la comunidad científica [ Barrett y col; 2003].
Perspectivas para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos.
Trypanosoma cruzi posee numerosas características estructurales y metabólicas que lo diferencian de
sus huéspedes mamíferos. La explotación de dichas divergencias para el desarrollo de nuevas drogas
destinadas al tratamiento de la enfermedad es actualmente tema de investigación de numerosos grupos
científicos de América Latina y de otras partes del mundo. Más adelante se hará mención a estos
potenciales blancos de quimioterapia.
Introducción - 7
Control vectorial.
Cabe aclarar que el punto más directo para el manejo de la transmisión de la enfermedad, es el control
del vector. La enfermedad de Chagas, tal como se mencionó anteriormente es una patología
peridomiciliaria, ya que la mayor parte de las personas infectadas fueron picadas por el insecto vector
dentro de su propia vivienda. Los triatominos residen en lugares oscuros, grietas en los muros y techos
de paja de viviendas precarias. Por lo tanto, la reparación de dichas grietas, o el reemplazo de los
muros y techo por planchas de chapa corrugada, madera o cemento, convierte a las estas viviendas en
medios adversos para el hábitat del insecto vector. La adición de insecticidas (piretroides sintéticos) de
liberación lenta en pinturas, la aplicación directa de los mismos por aspersión y la utilización de
formulaciones que generan humo, son también extensamente usados para el control del vector. A esto
también debe sumársele la implementación de planes de educación para la salud para las personas
residentes en lugares endémicos. Los países Latinoamericanos afectados por esta patología han
implementado numerosas campañas, con las características antes mencionadas, para el control del vector.
Esto ha llevado hoy en día a que la transmisión vectorial haya sido eliminada en Uruguay y Chile, y en
numerosas partes de Brasil y Argentina. Informes del año 1999 en los cuales se estima el número de
personas infectadas, sugieren que hay una disminución en la prevalencia de la enfermedad [Dias y col;
2002].
Trypanosoma cruzi
Infección y ciclo de vida.
Los protozoarios de la familia Trypanosomatidae presentan durante su ciclo de vida numerosas formas
que pueden ser facilmente distinguidas por microscopía de campo claro, y que reciben el nombre de
estadíos. A grandes rasgos en T. cruzi pueden detectarse cuatro estadíos, dos en el mamífero hospedador
(amastigote y tripomastigote sanguíneo) y dos en el insecto vector (epimastigotes y trypomastigotes
metacíclicos). Los epimastigotes se encuentran en el estómago e intestino medio de la vinchuca, poseen
forma ahusada, una longitud de 20-40 µm, el núcleo posee forma redondeada y el kinetoplasto (región
Introducción - 8
de la mitocondra que contiene el ADN mitocondrial) se encuentra ubicado anterior al mismo. Son
formas replicativas (se dividen por fisión binaria) no-infectivas y, a diferencia de los demás estadíos,
pueden cultivarse en medio axénico. Esto hace que este sea la forma biológica de elección para la mayor
parte de los experimentos que se llevan a cabo en T. cruzi (Fig.2A). Los tripomastigotes metacíclicos
A
B
K
N
MO
K
N
F
C
CM
K
D
GR
K
N
Fig.2. Estadíos del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. A) Epimastigotes, B) Tripomastigote metacíclico, C)
Amastigotes en el interior de una célula muscular, D) Tripomastigote sanguíneo en sangre periférica. N: núcleo; K:
kinetoplasto; F: flagelo; MO: membrana ondulante; GR: glóbulo rojo; CM: célula muscular.
por su parte, se generan por diferenciación de epimastigotes. Cuando estos últimos llegan al recto del
insecto vector, se adhieren a través de su flagelo mediante interacciones hidrofóbicas a la cutícula de la
pared intestinal; esta adhesión es la que dispara el proceso de transformación que se denomina
metaciclogénesis y que está mediado por AMPc [Tyler y col; 2001]. Este proceso involucra cambios
en el metabolismo del parásito, expresión de nuevos marcadores de superficie, cambios en la
hidrofobicidad que la membrana flagelar (que le permiten despegarse del sustrato al cual se había unido
el epimastigote), y la salida del ciclo celular, ya que esta forma del parásito es infectiva y no replicativa.
Los trypomastigotes metacíclicos así generados se despegan de la pared intestinal y son eliminados en
las heces y la orina de la vinchuca. Poseen forma elongada (aprox. 20 µm de longitud), una membrana
ondulante en uno de sus lados, su núcleo es alargado y el kinetoplasto se encuentra ubicado posterior
al mismo (Fig.2B). El ciclo de vida de Trypanosoma cruzi (Fig. 3) comienza cuando el insecto vector
se alimenta con la sangre del hospedador mamífero y luego defeca sobre la zona afectada. Los
tripomastigotes metacíclicos contenidos en las heces del triatomino penetran a través de la piel lesionada,
pasan al torrente sanguíneo e invaden un amplio rango de células nucleadas. Inicialmente se produce la
Introducción - 9
Fig.3. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.
adhesión del parásito a la membrana plasmática de la célula huésped, mediante un proceso de
reconocimiento célula-célula en el que intervienen residuos de azúcares: galactosa, manosa y Nacetilglucosamina expuestos por la superficie de ambas (Fig.4a). Existen numerosas evidencias que
indican que el ácido siálico está fuertemente involucrado en dicho proceso de reconocimiento, y que una
glicoproteína de superficie del parásito con actividad de trans-sialidasa y neuraminidasa, denominada
trans-sialidasa, cumple un rol primordial en la invasión . Una vez unido a la membrana plasmática de la
célula hospedadora, el trypomastigote envía una serie de señales que producen modificaciones en la
concentación de Ca2+ intracelular de dicha célula, y que conducen a la movilización de microtúbulos de
su citoesqueleto. Esto produce el reclutamiento de lisosomas hacia la zona de contacto con el parásito
(Fig.4b). Se postula que las movilizaciones de Ca2+ serían mediadas por la acción de dos peptidasas
parasitarias: la oligopeptidasa B y la cruzipaína. La primera actuaría de manera indirecta mediante el
clivaje (en el citoplasma del parásito) de un precursor inactivo para generar un agonista de calcio que es
liberado al exterior. Posteriormente, este interactúa con un receptor de la membrana plasmática de la
célula del mamífero que produce la activación de la fosfolipasa C que a su vez genera un aumento en los
niveles intracelulares de inositol tri fosfato (IP3). Dichos aumentos conducen a la movilización del calcio
intracelular [Burleigh y col; 2002]. El mecanismo de movilización de Ca2+ cruzipaína-dependiente,
Introducción - 10
involucra la liberación de la enzima al espacio extracelular a traves del bolsillo flagelar del parásito, el
clivaje por parte de la misma de quininógenos de alto peso molecular provenientes de la célula huésped,
y la concomitante formación de quininas activas (bradiquinina). Estas son reconocidas por un receptor
presente en la membrana plasmática de la célula hospedadora que estimula la liberación del Ca2+ intracelular
IP3 dependiente [Del Nery y col; 1997][Scharfstein y col; 2000].
Diez minutos después de producida la adhesión del parásito a la membrana de la célula, este entra en
ella mediante un proceso de endocitosis constituyéndose así la vacuola parasitófora, que posee los
lisosomas movilizados unidos a su cara externa (Fig.4c). Luego, dichos lisosomas se fusionan con la
membrana de la vacuola y liberan su contenido produciendo de esta manera la acidificación del
compartimiento (Fig.4d). A continuación el parásito secreta una molécula tipo porina denominada TcTox, que produce poros en la membrana de la vacuola parasitófora y permite su salida hacia el citosol
de la célula hospedadora (Fig.4e). La exposición de los tripomastigotes al medio ácido de dicha vacuola
es un pre-requisito para la sobrevida de T. cruzi, ya que la activación de Tc-Tox ocurre solamente en
este entorno. Una vez en el citoplasma de la célula, el tripomastigote comienza a sufrir el proceso de
diferenciación a esferomastigote o amastigote (Fig.4f): su flagelo se acorta y se hace casi inexistente,
su cuerpo celular se redondea y el núcleo vuelve a tomar forma redondeada (Fig.2C). Esta forma del
parásito es replicativa, y ahora es considerada también infectiva, ya que se ha comprobado que
amastigotes liberados al torrente sanguíneo son capaces de propagar la infección. [Ley y col; 1988]
demostraron que los amastigotes son capaces de invadir células, fundamentalmente fagocíticas, por un
mecanismo esencialmente distinto al de los trypomastigotes. Unas 24 a 35 horas después de su salida al
citosol, el amastigote comienza a dividirse activamente por fisión binaria y llega a formar pseudo-quistes
dentro de la célula (Fig.4g). Cuando ya existe una alta densidad de parásitos intracelulares, los amastigotes
se diferencian a tripomastigotes sanguíneos que salen de la célula infectada, pasan a la sangre o linfa del
mamímero y pueden invadir nuevas células [Burleigh y col; 2002] [Tyler y col; 2001]. Los tripomastigotes
sanguíneos (Fig.2D) poseen forma similar a los tripomastigotes metacíclicos, y comparten algunas
propiedades biológicas, sin embargo los primeros poseen la capacidad de transformarse en epimastigotes
a 27ºC en sangre o medio axénico, propiedad que está ausente en los metacíclicos. Además ambas
formas del parásito también poseen antígenos estadío específicos y presentan diferentes modos de
interaccionar con las células hospedadoras. El ciclo de vida del parásito se cierra cuando el insecto
vector se alimenta con la sangre de un mamífero infectado. Dicha sangre contiene trypomastigotes
sanguíneos que, al llegar al intestino del triatominio se diferencian a epimastigotes.
Introducción - 11
Tal como se mencionó al principio de este apartado la subdivisión de T. cruzi en tan sólo cuatro formas
biológicas es tan solo una simplificación, ya que se han detectado numerosas formas intermedias del
parásito con características morfológicas, de antigenicidad e infectividad diferentes [Tyler y col; 2001]
[Navarro y col; 2003], sin embargo la descripción de las mismas supera los objetivos de esta tesis.
b
a
c
g
e
d
f
Fig.4. Esquema correspondiente al proceso de invasión celular. a) reconocimento célula-célula, b) movilización de
lisosomas hacia la zona de contacto con el parásito, c) endocitosis y formación de la vacuola parasitófora, d) fusión
de los lisosomas con la membrana de dicha vacuola y acidificación de la misma, e) liberación de la molécula Tc-TOX
y formación de poros en la membrana vacuolar, f) salida del parásito hacia el citoplasma celular y diferenciación a
amastigotes, g) replicación activa de los amastigotes dentro de la célula hasta llegar a la formación de pseudoquistes.
Introducción - 12
Características ultraestructurales y metabólicas de Trypanosoma cruzi.
Gli
MP
MM
K
Gol
MI
PM
N
MN
MM
C
K
BF
F
MS
N
Fig.5. Ultraestructura de Tripanosoma cruzi. Microscopía electrónica de transmisión de epimastigotes de
Trypanosoma cruzi. MP: membrana plasmática, MM: membrana mitocondrial, MN: membrana nuclear, MS: microtúbulos
subpeliculares, MI: microtúbulos intranucleares, Gli:Glicosoma, N: núcleo, K: kinetoplasto, C: centríolo, BF: bolsillo
flagelar,F: flagelo, PM: placas mitóticas, Gol: aparato de golgi.
El núcleo.
*Estructura y genoma.
La forma del núcleo depende del estadío del parásito. Tal como se mencionó anteriormente en
trypomastigotes metacíclicos y sanguíneos es alargado y se encuentra ubicado en la parte central de la
célula; en epimastigotes y amastigotes, en cambio, posee forma redondeada. Se encuentra rodeado por
una membrana nuclear típica, y se ha determinado la existencia de continuidad entre la membrana nuclear
externa y el retículo endoplásmico (RE). El nucléolo posee una ubicación algo excéntrica y deja de ser
observado cuando la célula entra en división. El genoma de T. cruzi posee un tamaño aproximado de
Introducción - 13
45-50 Mpb, y una característica particular de este parásito es que el ADN nuclear no se condensa para
formar cromosomas en ninguna de sus formas de vida; solamente es posible observar durante la interfase
ciertos acúmulos de cromatina en la periferia del núcleo, por debajo de la membrana nuclear interna. Sin
embargo, el desarrollo de la técnica de pulsed field gel electrophoresis ha permitido identificar en
epimastigotes de T. cruzi de 30 a 40 “bandas cromosomales”, que poseen un tamaño de entre 0.45 y 4
Mpb [De Souza; 2002].
*Regulación de la expresión de los genes nucleares.
En tripanosomátidos los genes nucleares carecen de intrones y aparecen generalmente dispuestos en
densos grupos que contienen repeticiones de un mismo gen, con marcos abiertos de lectura (ORF) no
relacionados interpuestos. Los sucesivos genes están separados entre si por cortas secuencias
denominadas, secuencias intergénicas, y debido a la existencia de tan solo unos pocos promotores
para la transcripción, son transcriptos por la RNA polimerasa II como largas unidades policistrónicas.
Los transcriptos primarios asi generados son posteriormente procesados, mediante un mecanismo de
cortado y pegado, en los ARNm maduros e individuales correspondientes a cada uno de sus genes
componentes. Este proceso involucra la adición de una cola de adeninas en el 3’ de los transcriptos
(poli-adenilación) y el agregado de 35 nucleótidos estrictamente conservados, denominados mini exón
o splice leader en el 5’. Este último proceso se denomina capping y ocurre por trans splicing. Tanto
la poli-adenilación como el capping no se llevan a cabo en un lugar fijo de la región intergénica, sinó que
pueden ocurrir en varios lugares dentro de una ventana relativamente estrecha de la misma, y están
influenciados por la presencia de corridas de poli-pirimidinas que interaccionan con aquellas proteínas
involucradas en el procesamiento del ARN. Estas posiciones alternativas para el procesamiento de los
mensajeros primarios hacen que existan distintos ARNm, con diferentes longitudes de regiones no
codificantes, para un mismo gen. Estas variaciones serían potencialmente importantes para la regulación
de la expresión génica en tripanosomátidos, ya que a diferencia de otros organismos, los niveles en la
expresión de proteínas en estos parásitos están controlados post-transcripcionalmente por un
mecanismo que involucra estabilización o desestabilización de los ARNm [ Vanhamme y col; 1995].
La posibilidad de interferir con este proceso es considerada un posible blanco para el desarrollo de
drogas.
Introducción - 14
La superficie celular.
Puede considerarse que la superficie celular de los tripanosomátidos posee dos componentes
estrechamente asociados: la membrana plasmática, y una extensa capa de microtúbulos denominados
microtúbulos subpeliculares asociados a ella. La membrana puede subdividirse en tres subdominios
morfológicamente distintos, cada uno de los cuales posee funciones, composición proteica y lipídica
diferentes: la membrana flagelar, la membrana del bolsillo flagelar y la membrana plasmática del cuerpo
del parásito [Landfear y col; 2001].
*Los microtúbulos.
Los microtúbulos subpeliculares se extienden por debajo de la membrana plasmática a lo largo de todo
el cuerpo del parásito excepto en la región del bolsillo flagelar. Se encuentran unidos entre si y a la
membrana mediante filamentos cortos de naturaleza desconocida que le dan rigidez a la célula; están
regularmente espaciados y su número está relacionado con el diámetro de la misma. De esta manera, en
la parte posterior y anterior del parásito la cantidad de microtúbulos es menor, mientras que en la región
central, entre el núcleo y el kinetoplasto donde se encuentra el aparato de Golgi, existe una gran
acumulación de ellos. Están involucrados en los cambios morfológicos que sufre T. cruzi durante su
ciclo de vida, y cumplen un rol fundamental en la división celular. Debido a esto el desarrollo de drogas
que inhiban el ensamblado de los microtúbolos es un potencial blanco quimioterapéutico. Se ha demostrado
que son resistentes a los inhibidores clásicos de microtúbulos tales como colchicina y benzimidazoles,
sin embargo algunos alcaloides y macrólidos han mostrado ser efectivos [De Souza; 2002].
* Arquitectura de membranas, transportadores y entrada de drogas.
Los tripanosomátidos poseen transportadores de membrana que median la captación de nutrientes del
medio (célula hospedadora), e intervienen en la internalización de drogas. En el primer caso, el diseño
de compuestos que bloqueen específicamente dichos transportadores es considerado de gran importancia
[Hasne y col; 2000], mientras que en el segundo, el conocimiento de la estructura de las moléculas
transportadoras es crucial para el desarrollo de drogas que puedan adaptarse mejor a ellas, y por lo
tanto puedan ser internalizadas con mayor eficacia. Muchas de las proteínas estructurales de superficie
de los tripanosomatidos, incluso las mucinas de T. cruzi, están unidas a la membrana mediante anclas
de glicosil-fosfatidil-inositol (GPI). Las enzimas parasitarias encargadas de la biosíntesis de dichas anclas
Introducción - 15
difieren bastante de sus homólogas de mamíferos, y se ha demostrado que son esenciales para la sobrevida
del parásito mediante la utilización de inhibidores específicos [Ferguson y col; 1999].
Bolsillo flagelar, vía endocítica y secretoria.
El bolsillo flagelar es una invaginación de la membrana plasmática ubicada en la región anterior del
parásito desde donde emerge el flagelo; presenta distinta morfología en los diferentes kinetoplástidos, y
también varía de acuerdo al estadío del ciclo de vida del parásito; sin embargo, en todos los casos su
función es similar. En epimastigotes y amastigotes de T. cruzi es una estructura con forma de tunel
denominada complejo citostomo-citoprandix, constituída por una profunda invaginación de la membrana
plasmática que puede llegar hasta la región nuclear. La apertura del complejo, conocida como citostoma,
posee un diámetro que puede llegar a los 0.3 µm [De Souza; 2002]. En la región del bolsillo flagelar
existe solución de continuidad entre la membrana plasmática y la flagelar. Representa entre el 0.4 y el 3
% de la superficie del parásito, su lumen ha demostrado estar constituído por un material electron denso
que contiene proteínas específicas y debido a que es una región altamente especializada de la membrana,
difiere en composición y distribución de proteínas con respecto al resto y carece de los microtúbulos
subpeliculares. Es el único sitio conocido hasta el momento en tripanosomátidos a través del cual se
llevan a cabo los procesos de endocitosis, secreción de proteínas hacia el espacio extracelular, e
integración de proteínas de membrana de la superficie del parásito. [Landfear y col; 2001].
* Vía endocítica y reservosomas.
Las moléculas a ser endocitadas por el parásito, inicialmente se unen a la región del bolsilo flagelar
(citostomo), y luego son internalizadas en el fondo del citoprandix, apareciendo en el citoplasma
celular como pequeñas vesículas endocíticas que, posteriormente se fusionan entre si y generan estructuras
tubulares que pueden observarse en la zona central del parásito. Más tarde las macromoléculas endocitadas
son concentradas en estructuras denominadas reservosomas. Cada epimastigote presenta varios
reservosomas localizados en la región posterior de la célula, su forma puede variar de acuerdo a las
condiciones de crecimiento del parásito, pero puede decirse que en general presentan forma esférica,
que están rodeados por una única membrana y que poseen un diámetro aproximado de 0.7 µm. Tal
como lo indica su nombre, los reservosomas son organelas de reserva, que contienen lípidos y proteínas
que son utilizados por el parásito cuando se encuentra creciendo en un medio escaso de nutrientes. Una
Introducción - 16
característica importante de los reservosomas es que acumulan grandes cantidades de cruzipaína que es
la cisteina proteinasa principal presente en T. cruzi.
*Vía secretoria.
Los trypanosomátidos poseen un retículo endoplasmico (RE) extenso disperso por todo el citoplasma
celular, que posee solución de continuidad con la membrana nuclear externa. El aparato de Golgi es
una organela situada en el centro de la vía secretoria cuya función es la de agregar carbohidratos complejos
a lípidos de membrana y proteínas sintetizadas de novo en el RE que serán secretadas al medio extracelular
o integradas a membranas. En tripanosomátidos el complejo de Golgi se encuentra ubicado entre el
núcleo y el kinetoplasto, posee de 4 a 6 sacos aplanados con una cara cis, de entrada de vesículas
provenientes del RE y una cara trans de salida de vesículas (conteniendo lipidos y proteínas ya procesados)
hacia el bolsillo flagelar.
El flagelo.
Todos los miembros de la familia Trypanosomatidae poseen un flagelo que emerge del bosillo flagelar, y
le otorga movilidad al parásito. Posee una estructura basica similar a la de otros flagelos, presenta un
axonema con una patrón de microtúbulos de 9+2, y una estructura filamentosa altamente organizada
que lo acompaña en toda su longitud y que se denomina bastón paraflagelar (paraflagellar rod). La
longitud del flagelo varía de acuerdo al estadío del ciclo de vida del parásito, de esta manera, en amastigotes
mide solamente 1µm, mientras que en epimastigotes y trypomastigotes llega a medir 20 µm [De Souza;
2002].
Mitocondria y kinetoplasto.
Trypanosoma cruzi, al igual que el resto de los miembros de la familia trypanosomatidae, posee una
única mitocondria que se extiende a lo largo del cuerpo celular del parásito. A diferencia de lo que
ocurre en las células de mamíferos, la membrana mitocondrial de los tripanosomátidos presenta una alta
cantidad de esteroles. Se ha demostrado que el tratamiento de parásitos con drogas que alteran la
Introducción - 17
síntesis de ergosterol produce graves cambios morfológicos y funcionales en la mitocondria; esta
característica hace que el desarrollo de nuevas drogas que inhiban la biosíntesis de esteroles sea
considerado un blanco de quimioterapia muy promisorio [De Souza; 2002].
Otra característica importante de la mitocondria de los tripanosomátidos es su material genético, el
ADN mitocondrial representa entre el 20 y el 25 % del ADN total del parásito y se encuentra localizado
cerca del cuerpo basal formando una estructura denominada kinetoplasto. Este está constituído por
una intrincada red de mini y maxi círculos de ADN [Shapiro y col; 1995]. Existen aproximadamente de
20.000 a 30.000 minicírculos que poseen una longitud de 0.45 µm (aproximadamente 1440 pb), y
cerca de 30 maxicírculos con un diámetro de 10 µm y un tamaño comparable al ADN mitocondrial de
otras células eucariotas. Estos últimos serían los componentes activos del genoma mitocondrial del
parásito [De Souza; 2002].
* Editado del RNA.
Los productos de la expresión de algunos de los genes codificados en el kinetoplasto participan en el
editado del RNA mitocondrial, que involucra la adición o remoción de residuos de uridina a los
transcriptos primarios, para dar transcriptos maduros que puedan ser traducidos. La especificidad de
este mecanismo esta determinada por la presencia de ARNs complementarios que actúan mayoritariamente
en trans, y solo en algunos casos en cis, y que guían a la maquinaria enzimática a los sitios específicos
donde deben llevarse a cabo las inserciones o deleciones de residuos de uridina [Simpson y col; 2003].
Debido a que este es un proceso único para los tripanosomátidos, aquellas enzimas involucradas en el
mismo son potenciales blancos para el desarrollo de nuevas drogas.
Glicosomas.
*Características generales.
Son organelas relacionadas con los peroxisomas y glioxisomas debido a que poseen características
morfológicas y algunas vías metabólicas en común. Sin embargo, existen diferencias que los convierten
en organelas únicas, y por ello son considerados buenos blancos para el desarrollo de nuevos agentes
quimioterapéuticos. La característica más importante de los glicosomas, que los diferencia de los otros
miembros de su familia, es la presencia de las siete primeras enzimas de la vía glicolítica en la matriz
glicosomal. Esta compartimentalización les otorga a las enzimas características bioquímicas y de regulación
Introducción - 18
particulares, que están siendo ampliamente estudiadas y sobre las cuales se hablará más adelante. En
estas organelas es posible también encontrar enzimas involucradas en el metabolismo de peróxidos, sin
embargo, la catalasa, considerada como marcadora de peroxisomas y glioxisomas, se encuentra ausente
en algunos miembros de la familia Trypanosomatidae como ser T .cruzi, T. brucei y Leishmania. En
otros miembros de la familia, sin embargo, la enzima pudo ser detectada con facilidad; este es el caso de
Crithidia y Leptomonas. Otras de las vías compartidas entre glicosomas y peroxisomas, son la βoxidación de ácidos grasos, la primera parte de la biosíntesis de eteres lipídicos y la hidroxi-metil glutaril
CoA reductasa para la síntesis de isoprenoides. Los glicosomas poseen también enzimas de la vía de las
pentosas fosfato, en concordancia con los peroxisomas de hígado de rata donde se ha detectado la
presencia de las deshidrogenasas de la rama oxidativa de dicha vía [Tabla.1] [Parsons y col; 2001].
Otra característica única de los glicosomas, es la presencia de enzimas correspondientes a las vía de
salvataje de purinas, biosíntesis de pirimidinas y gluconeogénesis.
Peroxisomas
de mamíferos
Peroxisomas
de lavaduras
Glioxisomas
Glicosomas
*ȕ-oxidación de
ácidos grasos
Si
Si
Si
Si
*Catalasa
Si
Si
Si
Especie
dependiente
*Glicólisis
No
No
No
Si
*Ciclo del
glioxilato
No
Si
Si
No
*Biosíntesis de
isoprenoides
Si
No
?
?
*Vía de salvataje
de purinas
No
No
No
Si
*Síntesis de éteres
lipídicos
Si
No
No
Si
Especie
dependiente
?
?
Si
*Vía de la
pentosas fosfato
Tabla.1. Comparación de vías metabólicas presentes en peroxisomas, glioxisomas y glicosomas.
*Características ultraestructurales y funcionales.
Los glicosomas son microcuerpos esféricos, poseen un tamaño de entre 0.1-0.3 µm, se encuentran
distribuídos al azar por todo el citoplasma del parásito y están rodeados por una única membrana cuya
Introducción - 19
composición lipídica y proteica difiere de la del resto de la célula. Dicha membrana posee baja
permeabilidad a la mayor parte de los metabolitos incluyendo el NAD(H), de manera tal que el movimiento
de los mismos a través de la membrana se realiza por medio de moléculas transportadoras homólogas
a los transportadores ABC involucrados en el movimiento de ácidos grasos a través de la membrana
peroxisomal de levaduras y células de mamíferos [Hannaert y col; 2003]. Los glicosomas, al igual que
los peroxisomas y glioxisomas carecen de material genético, por lo que se considera que las proteínas
lumenales de dichas organelas están codificadas por genes nucleares, son sintetizadas en ribosomas
libres en el citosol, y transportadas post-traduccionalmente hacia las mismas. Los mecanismos de
internalización de proteínas hacia la matriz glicosomal difieren sustancialmente de aquellos involucrados
en la inserción de proteínas a la membrana de dicha organela, y no involucran ningún tipo de procesamiento
proteolítico de la proteína a ser internalizada. Es un mecanismo en que pueden identificarse tres pasos
fundamentales: 1) reconocimiento de la secuencia señal, presente en la proteína a ser internalizada, por
parte de receptores citoplasmáticos denominados peroxinas; 2) desplazamiento de los complejos enzimareceptor hacia la membrana glicosomal donde se unen a los complejos proteicos de membrana
responsables de la traslocación de las proteínas hacia la matriz; 3) internalización de los complejos
enzima-receptor, en su estado nativo y posterior salida del receptor nuevamente hacia el citosol [Parsons
y col; 2001]. Se han identificado dos tipos de señales denominadas PTS (peroxisomal targeting signal)
presentes en la proteínas a ser internalizadas. Una de ellas, llamada PTS1 es un tripéptido C-terminal
Señal PTS1
Eficiencia de internalización
Tripanosomas
Ninguna
SK L
AK L
CK L
SRL
SSL
SH L
SKM
AR L
+
+
++
++
+
+
+
+
Mamíferos
+
+
+
+
+
+/+
Tabla.2. Polimorfismos en el tripéptido C-terminal correspondiente a la señal de reclutamiento glicosomal de
tipo PTS1. Eficiencia de las variantes del tripeptido canónico SKL, para el reclutamiento de proteínas hacia la matriz
glicosomal (tripanosomátidos) y peroxisomal (mamiferos). Dicha efiencia expresada como ++ (muy buena),+ (buena)
+/- (baja) y – (nula, no dectable), se analizó mediante la construcción de híbridos CAT-PGK (cloramfenicol acetil
transferasa fusionada a 22 residuos de aminoácidos de extremo C-terminal de la fosfoglicerato kinasa glicosomal de
T. brucei), a los cuales se les variaba la secuencia del tripéptido C-terminal. [Blattnery col; 1992]
Introducción - 20
cuya secuencia canónica es Ser, Lys, Leu (SKL); sin embargo existe una relativa plasticidad en su
composición, la que varía sustancialmente entre mamíferos y tripanosomátidos. Mediante experimentos
de fusión de los distintos tripéptidos a secuencias reporteras, se ha podido evaluar su eficiencia como
señales de importación. (Tabla.2). [Blattner y col; 1992].
Estudios posteriores han permitido determinar que en realidad, las señales de tipo PTS1 están constituídas
por 12 residuos de aminoácidos, de manera tal que su eficiencia como secuencia de importación no
solo está influenciada por la composición aminoacídica particular del tripéptido C-terminal, sinó
también por la naturaleza de los 9 residuos de aminoácidos que lo anteceden ver (Fig.6) [Neuberguer y
col; 2003]. Así, estas variaciones estarían influyendo en el reconocimiento de la señal PTS1 por parte de
su molécula receptora, denominada PEX 5, en el citosol. De acuerdo con esto, un único polipéptido,
conteniendo dicha señal puede ser parcialmente internalizado en los glicosomas, presentando una
distribución dual entre dicha organela y el citosol. Este es el caso de la glucosa fosfato isomerasa (PGI)
de Leishmania mexicana y T. brucei, que a pesar de ser codificadas por un único gen y presentar la
señal C-terminal AHL y SHL respectivamente, no poseen una distribución exclusivamente glicosomal.
La enzima de Leishmania se encuentra distribuída fundamentalmente en citosol y tan solo un pequeño
porcentaje en glicosoma. Su homólogo de T. brucei en cambio, sufre variaciones en su localización de
acuerdo al ciclo de vida del parásito. De esta manera, mientras que en la forma sanguínea de T. brucei
la enzima posee una localización casi exclusivamente glicosomal, en procíclicos una fracción considerable
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
X-X-X-X-X-X-X-X-X-S-K-L
Tripéptido C-terminal sujeto a las variaciones
de secuencia expuestas en la Tabla.3.
Región encargada de interaccionar con la superficie de la molécula
Región no estructurada accesible al solvente, que posee funciones
de "linker", entre la proteína a ser internalizada a la matriz
glicosomal y su receptor.
Fig.6. Esquema de la señal de reclutamiento glicosomal de tipo PTS1, tripéptido C-terminal y aminoácidos
acompañantes. En dicho esquema se muestra el tripéptido SKL posición 0 a -2 (que puede estar sujeto a las
variaciones de secuencia expuestas en la tabla 3). Los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones -3 a -6,
participan en la interacción con el receptor PEX5 y por lo tanto existen exigencias en cuanto a la naturaleza de cada
uno de ellos. En la posición -3 hay preferencia por residuos de aminoácidos básicos, en la posicion -4 se requieren
residuos hidrofóbicos y alifáticos (Leu), y en la posición -6 es necesaria la presencia de un residuo flexible para evitar
impedimentos estéricos con el receptor (en muchos casos se encuentra una Lys). Los residuos de aminoácidos de las
posiciones -7 a –11, son generalmente hidrofílicos y flexibles.
Introducción - 21
de la misma se encuentra en el citosol. Hay varias teorías tendientes a explicar estas localizaciones
bipartitas: una de ellas tal como se explicó anteriormente tiene que ver con la naturaleza de la propia
secuencia señal y los residuos de aminoácidos que la flanquean; otras en cambio, proponen la existencia
de modificaciones post traduccionales menores, aún no detectadas, que conducirían a la retención
completa o parcial de dichas proteínas en los glicosomas. Por último, y en un intento de explicar las
diferencias inter-estadío encontradas para la PGI de T. brucei se ha propuesto la teoría de control
cinético para la internalización de proteínas glicosomales. De acuerdo con esto en un determinado
estadío del ciclo de vida del parásito, las velocidades de síntesis de proteínas en el citosol, y la velocidad
de internalización de las mismas en el glicosoma determinan su concentración en el estado estacionario
en ambos compartimientos. Estas concentraciones pueden variar drásticamente si se presentan cambios
tanto en la velocidad de síntesis de proteínas como en su internalización hacia la matriz glicosomal, y esto
puede ocurrir durante la transformación de un estadío celular a otro. Como se puede observar, una
teoría no excluye a la otra de manera tal que la localización bipartita de esta enzima pueden ser de
resultado de una sumatoria de factores aún no demasiado clarificados [Nyame y col; 1994]. El otro tipo
de señal de localización peroxisomal, se denomina PTS2. Se trata de un nonapéptido ubicado en la
región amino terminal de las proteínas, que es reconocido en el citosol por un receptor denominado
PEX 7. Es una secuencia que presenta bastante plasticidad ya que tan solo unos pocos aminoácidos se
encuentran estrictamente conservados ver (Fig.7). En tripanosomatidos se ha detectado esta señal en la
1
MSESVGRTSAM - H R L Q V V L G H L - A G R P .... Tiolasa A de rata
1
M- HRLQVVLGH
1
M- QRLQVVLGH
1
MSQRLQS IKD H
1
MSKRVEV LLT Q
L - A G R S .... Tiolasa B de rata
L - R G P A .... Tiolasa humana
L - - - V L.... Tiolasa de S. cerevisiae
L P A Y N...... Aldolasa de T. brucei
Fig.7. Señal de reclutamiento glicosomal de tipo PTS2. Alineamiento de secuencias que poseen señales de tipo
PTS2. En el caso de la tiolasa A de rata el nonapéptido que constituye esta señal (subrayado), se encuentra en la
región amino terminal de la proteína, mientras que en los otros casos dicho nonapéptido constituye el extremo
amino terminal de las proteínas. Los residuos de aminoácidos estrictamente conservados se encuentran señalados
en letras rojas, mientras que aquellos que se encuentran parcialmente conservados han sido denotados en letras
naranjas.
Introducción - 22
aldolasa de T. brucei [Blattner y col; 1995]. Por último cabe aclarar que está siendo considerada la
posibilidad de la existencia de señales internas de reclutamiento de proteínas hacia la matriz glicosomal.
Acidocalcisomas.
Son vacuolas citoplasmáticas acídicas rodeadas por una única membrana. Poseen una matriz electrón
densa compuesta por altas concentraciones de Ca2+, P, Mg y Zn. El fósforo detectado se encuentra en
la forma de pirofosfato y polifosfatos de cadena corta, el primero es el fosfato de alta energía más
abundante presente en T. cruzi. En menor proporción se detectaron también Cl, K y S (el bajo contenido
de azufre sugiere la presencia de baja concentración de proteinas). En su membrana se detectaron una
Ca2+- H+ ATPasa, una H+-ATPasa (involucrada en la mantención del pH acídico de la organela), una
pirofosfatasa vacuolar (encargada de la traslocación de protones), y dos intercambiadores de Na+-H+
y Ca2+-H+ [Docampo y col; 1999]. Existen diferentes teorías, no mutuamente excluyentes, desarrolladas
por Docampo y col; 1999, referentes a las posibles funciones de esta organela. Una de ellas habla de un
rol fundamental en el almacenamiento de Ca2+ en determinados estadíos del ciclo de vida del parásito,
ya que, tal como se discutió anteriormente, este catión se encuentra involucrado en los proceso de
invasión, señalización, diferenciación, etc. Otra función propuesta para los acidocalcisomas tiene que
ver con el almacenamiento de energía, ya que contiene altas concentraciones de PPi, a su vez, debido a
la presencia de una H+-ATPasa en su membrana, se propuso que podría estar cumpliendo un rol
importante en la regulación del pH citosólico. Por último también se ha propuesto un posible rol en el
control de la osmorregulación.
Vías metabólicas y su posible explotación para el desarrollo de nuevos
agentes quimioterapéuticos.
*Vía glicolítica.
La vía glicolítica es operativa en todos los trypanosomátidos estudiados hasta el momento, y presenta
dos características principales que la distinguen de la de mamíferos:
Introducción - 23
1) Compartamentalización de la vía: a diferencia de las enzimas glicolíticas de mamíferos que
poseen una localización estrictamente citosólica, en tripanosomátidos la vía se encuentra parcialmente
compartimentalizada dentro del glicosoma. Así en Trypanosoma cruzi y procíclicos de T. brucei, las
primeras seis enzimas de la vía (desde la hexoquinasa (HK) hasta la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa
(G3PDH) residen dentro de dicha organela, y las cuatro restantes en el citosol. En la forma sanguínea de
Trypanosoma brucei, en cambio, las siete primeras enzimas de la vía glicolítica residen dentro del
glicosoma (desde la HK hasta la fosfoglicerato quinasa (PGK)). Esto hace que en dicho estadío exista
un balance dentro del glicosoma entre el ATP consumido por la HK y la fosfofructoquinasa (PFK), y
el producido por la PGK. Estos parásitos también poseen la característica particular de carecer del
ciclo del ácido tri-carboxílico y de citocromos. Debido a esto, en aerobiosis la reoxidación del NADH
producido por la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa se lleva a cabo dentro del glicosoma mediante
la transferencia de los electrones a una glicerol 3- fosfato oxidasa mitocondrial. Esto ocurre a través de
una lanzadera redox que posee tres componentes: una glicerol 3-fosfato deshidrogenasa NAD
dependiente (glicosomal), un transportador de membrana involucrado en el intercambio de glicerol 3fosfato por fosfato de di-hidroxiacetona (aún no identificado) y la glicerol 3-fosfato oxidasa mitocondrial
antes mencionada (Fig.8). Las membranas glicosomal y peroxisomal son escasamente permeables a la
mayoría de los metabolitos incluyendo adenina nucleótidos y NAD(H), por lo tanto, se postula que la
movilización de metabolitos a través de las mismas debería realizarse a través de transportadores.
Recientemente Hettema y col [2000], informaron la presencia de transportadores homólogos a los
ABC involucrados en el transporte de ácidos grasos a través de la membrana de peroxisomas de
levaduras y células de mamíferos. En condiciones de anaerobiosis, o cuando la glicerol 3-fosfato oxidasa
mitocondrial se encuentra inhibida, la reoxidación del NADH se lleva a cabo mediante la producción de
glicerol (que es acompañada por la síntesis de ATP) por medio de la glicerol quinasa. En otros
tripanosomátidos, incluído T. cruzi y los procíclicos de T. brucei, en aerobiosis, el NADH es reoxidado
(al menos parcialmente), a través de la cadena respiratoria. Este proceso, al igual que en otros organismos,
es una oxidación ligada a fosforilación en la que interviene una ATPasa Mg2+ dependiente. En estas
condiciones es posible detectar también productos fermentativos, como L-lactato, acetato, CO2 y
succinato (este proceso fue denominado fermentación aeróbica por von Brand [1979]). El succinato,
es el producto que se encuentra en mayor cantidad y en T. cruzi y procíclicos de T. brucei, se genera a
través de la fijación de C02 en el C3 del fosfo enol piruvato (PEP) por medio de la fosfo enol piruvato
carboxi quinasa (PEPCK) glicosomal. Por medio de esta reacción se obtiene oxaloacetato que luego
es reducido a L-malato por medio de una isoforma glicosomal de la malato deshidrogenasa. Luego el
Introducción - 24
L-malato se transforma en fumarato por medio de la fumarasa, y este último es reducido a succinato
por acción de la fumarato reductasa. El PEP es producido en el citosol y puede seguir dos vías: a) puede
entrar en el glicosoma y ser carboxilado a oxaloacetato, tal como se mencionó anteriormente, o b)
puede convertirse en piruvato por acción de la piruvato quinasa citosólica. Este último compuesto es
luego transaminado a L-alanina (Fig 8)
Glucosa
ATP
GLICOSOMA
Hexoquinasa
ADP
Glucosa 6-fosfato
Glucosa fosato isomerasa
MITOCONDRIA
L-alanina
Fructosa 6-fosfato
ATP
ADP
MITOCONDRIA
H2O
Alanina amino
transferasa
Fosfo fructo quinasa
NADPH
Enz
málica
NADP
Fructosa 1,6-bis fosfato
Di OH
acetona
fosfato
Di OH
acetona
fosfato
Gliceraldehido 3-fosfato
Triosa fosfato isomerasa
Gliceraldehido 3-P
NADH
desh.
NADH
Oxaloacetato
Cadena respiratoria.
Fum. red.
PEPCK
SUCCINATO
Fosfo enol
piruvato
Gliceroquinasa
ATP
Pi
Succ. desh
ADP
ADP
glicero fosfato
fosfatasa
Citrato
Fumarato
ATP
O2
Fuma
rasa
Citrato
sintasa
Malato desh.
Malato
Malato desh.
Acetil CoA
Oxaloace
tato
NAD
1,3 di-fosfo glicerato
NAD
Malato
Piruvato
CO2
glicerol
1,3 di-fosfo glicerato
Fosfoglicerato
quinasa
CITOSOL
3-fosfo glicerato
L-malato
Fosfoglicerato
mutasa
2-fosfo glicerato
Enolasa
NH3
oxo-glutarato
L-alanina
Alanina amino
transferasa
NADH
NAD
CO2
NADP
NADPH
Fosfo enol
piruvato
L-glutamato Piruvato
Glutamato desh
Enzima málica
kinasa
ADP
ATP
Piruvato
Glutamato desh.
oxo-glutarato
NH3
L-glutamato
NADP
NADPH
Fig.8. Esquema de compartamentalización subcelular de las enzimas involucradas en el catabolismo de la
glucosa en T. cruzi y T. brucei. El 1-3 di fosfo glicerato y el gliceraldeído 3-P se muestran dentro de líneas punteadas
para indicar que la fosfoglicerato quinasa se encuentra dentro de los glicosomas en la forma sanguínea de T. brucei;
y en el citosol tanto en T. cruzi como en los procíclicos de T. brucei. El rectángulo de la izquierda representa a la
mitocondria de la forma sanguínea de T. brucei, mientras el de la derecha representa la mitocondria de epimastigotes
de T. cruzi y procíclicos de T. brucei.
Introducción - 25
2) En la mayor parte de los organismos, las enzimas de la vía glicolítica están altamente reguladas;
en tripanosomátidos, en cambio, la comparimentalización de la vía, sumada a la baja permeabilidad de
la membrana glicosomal para la mayor parte de los intermediarios metabólicos, hace que dichas enzimas
estén sujetas a poca o ninguna regulación. El ejemplo más claro de esto está dado por las enzimas
hexoquinasa (HK) y fosfofructo quinasa (PFK). En la mayoría de los organismos dichas enzimas
están sujetas a regulación por varios intermediarios glicolíticos y factores alostéricos, sin embargo, las
enzimas del parásito parecen ser insensibles a los mismos. Una de las consecuencias más destacadas de
esta falta de regulación es la carencia del “efecto Pasteur” que puede observarse en tripanosomátidos.
En la mayor parte de los organismos, la transición de anaerobiosis a aerobiosis produce una considerable
disminución en la velocidad de utilización de la glucosa. Los tripanosomátidos en cambio, son capaces
de fermentar la glucosa aeróbicamente a una velocidad igual, y en algunos casos aún mayor que en
anaerobiosis. [Cazzulo ; 1992].
Estas características, sumadas al hecho de que varias de las enzimas de la vía glicolítica poseen diferencias
estructurales con sus homólogas de mamíferos, las convierte en buenos blancos para el desarrollo de
nuevas drogas. Un ejemplo de ello ha sido el desarrollo de inhibidores para la gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa de tripanosomátidos que poseen relativamente alta especificidad y selectividad para la
enzima. Esto se llevó a cabo mediante la comparación del sitio activo de la enzima de mamíferos y con
su homólogo de parásitos. Mas allá de este ejemplo en particular, son numerosos los inhibidores que se
han desarrollado y han demostrado ser específicos para las enzimas parasitarias y efectivos como
potenciales agentes quimioterapéuticos, ya que aparte de bloquear la glicólisis en los parásitos producen
retardo en su crecimiento en cultivo sin producir ningún efecto sobre el crecimiento de las células de
mamíferos. Actualmente se está trabajando en la mejora de dichos compuestos como así también en la
búsqueda de nuevos compuestos [Verlinde y col; 2001].
*Proteasas.
Debido a que las proteasas presentes en los tripanosomátidos cumplen un rol importante en la relación
parásito-huésped, diferenciación, evasión de la respuesta inmune y nutrición del parásito, han sido
extensamente estudiadas durante los últimos diez años. La mayor actividad proteolítica encontrada en
tripanosomátidos correponde a cisteina proteasas; la principal de ellas, presente en todos los estadíos
de T. cruzi, pero mayoritaria en epimastigotes, es la cruzipaína, una proteasa de la familia de la papaína
Introducción - 26
que ha demostrado ser fuertemente antigénica. Es una enzima que se encuentra codificada por un alto
número de genes (más de 130 en cepa Tul 2), que se encuentran dispuestos cabeza-cola. Esta enzima
posee una inusual extensión C-terminal que se encuentra ausente en el resto de los miembros de la
familia de la papaína. Dicha extensión presenta numerosas modificaciones post-traduccionales y es la
responsable de la alta antigenicidad de esta proteasa. Se localiza en los lisosomas-reservosomas y, en
mucha menor cantidad en la superficie del parásito, en un patrón que parecería ser estadío específico.
De esta manera, a parte de cumplir un rol fundamental en la nutrición del parásito, participaría en la
evasión de la respuesta inmune mediante la degradación de inmuno globulinas que se adhieren a la
superficie del mismo, en la penetración de las células del mamífero, y en los procesos de diferenciación
de tripomastigotes a amastigotes luego de la invasión, y de amastigotes a tripomastigotes antes de su
salida de la célula. La enzima es inhibida por compuestos organomercuriados, E64 (trans-epoxi succinyl
amido (4-guanidino) butano), leupeptina, TLCK ( N-α−tosil-lisil-clorometilcetona), y derivados de
peptidil fluoro metano [Cazzulo y col; 2001] [Cazzulo; 2002]. Engel y col [1998] demostraron que el
compuesto MFhFVSPh (morfolinourea-FhF-vinil sulfonico fenil) bloquea efectivamente el crecimiento
de epimastigotes en cultivo, a concentraciones tan bajas como 10 µM, causando la muerte celular en 72
hs (estos efectos fueron paralelos con la acumulación de cruzipaína en aparato de Golgi como así
también la inducción de diversas alteraciones morfológicas en al parásito). Posteriormente este mismo
grupo analizó los efectos de este inhibidor y del N-metil-piperazina-FhF-vinil sufonico fenil (PFhFVSPh),
en ratones infectados con T. cruzi. El tratamiento llevado a cabo con este último compuesto mediante la
administración de 3 dosis diarias de 0.7 mg resultó ser 100 % efectivo (todos los animales fueron
rescatados de infecciones letales con el parásito). Estos resultados han sido muy promisorios ya que los
animales controles (no infectados) a los que se les administró el inhibidor no presentaron signos de
toxicidad [Engel y col; 1998b]. Actualmente se están llevando a cabo estudios en perros con este mismo
inhibidor [McKerrow y col; 1999].
Otro tipo de proteasas detectadas en tripanosomátidos son las serina proteasas. Como miembros de
esta familia pueden mencionarse: la oligopeptidasa B (que parece estar indirectamente involucrada en
los mecanismos de penetración del tripomastigote en la célula del mamífero mediante la activación de
factores que producen aumentos transientes en las concentraciones de Ca2+ intracelular) [Burleigh y col;
1995], la serina carboxipeptidasa de T. cruzi y la prolil endopeptidasa Tc80 (colagenasa). La serina
carboxi peptidasa de T. cruzi es una glicoproteína de alta manossa con localización lisosomal que se
encuentra codificada por cerca de 20 genes dispuestos unos detrás de otros, distribuídos en dos
cromosomas (por genoma haploide del parásito). La enzima nativa ha sido purificada a homogeneneidad
Introducción - 27
a partir de epimastigotes de T. cruzi y la proteína recombinante ha sido expresada y purificada. Esto ha
permitido llevar a cabo una caracterización completa de la enzima, sin embargo, su rol biológico aún no
ha sido develado [Parussini y col; 2003]. La prolil endopeptidasa Tc80 es una enzima con actividad de
colagenasa ya que es capáz de degradar el colágeno humano tipo I y tipo IV, como así también la
fibronectina. Esta enzima se encuentra localizada en un compartimiento vesicular cerca del bolsillo flagelar,
y cumpliría un rol importante en la degradación de la matriz extracelular para permitir la entrada de los
parásitos en los tejidos del huésped [Santana y col; 1997]. Recientemente se han diseñados inhibidores
selectivos para dicha enzima que han demostrado bloquear la entrada del parásito en células de mamíferos
[Vendeville y col; 1999].
Con respecto a las metaloproteinasas, en T. cruzi han sido identificados recientemente homólogos a la
GP63 de Leishmania spp. Dentro del genoma de T. cruzi existen múltiples copias del gen que codifica
para dicha enzima. Estos pudieron ser organizados en dos grupos cuya expresión mostró estar regulada
de manera diferencial durante los procesos de diferenciación del parásito. También se ha determinado
que al menos uno de los genes correspondiente al grupo I de las gp63 de T. cruzi, codifica para una
proteína con actividad de metaloproteinasa que se encuentra unida a la membrana plasmática del parásito
mediante un ancla de GPI [Cuevas y col; 2003].
En la mayoría de las células eucariotas, el recambio de proteínas citoplasmáticas se lleva a cabo en
complejos proteicos compuestos por múltiples subunidades denominados proteasomas. Estos se
encargan de degradar proteínas ubiquitiniladas, participando en la regulación de la proliferación celular
y control del ciclo celular. Su rol en tripanosomátidos ha sido ampliamente estudiado; en T. cruzi la
utilización de lactacystin, un inhibidor específico del proteasoma, ha mostrado ser efectivo en el bloqueo
de los procesos de diferenciación de tripomastigotes a amastigotes y viceversa, además de producir una
disminución en el recambio de las proteínas celulares como así también la acumulación de proteínas
ubiquitiniladas [Klemba y col; 2002].
De esta manera, la mejora y el desarrollo de nuevos inhibidores específicos para las diferentes proteasas
de tripanosomátidos son considerados un frente muy promisorio para el tratamiento de las enfermedades
parasitarias.
Introducción - 28
*Mecanismos de defensa contra estrés oxidativo.
La mayor parte de los protozoarios parásitos son células aeróbicas y viven en medios oxigenados. El
metabolismo aeróbico utiliza oxígeno molecular como aceptor final en diferentes sistemas de transporte
de electrones, como ser aquellos presentes en la mitocondria, donde el oxigeno es reducido por cuatro
electrones a dos moléculas de agua. Sin embargo, también puede ser parcialmente reducido generándose
las denominadas especies reactivas del oxígeno (ROS) que son altamente inestables, y pueden provocar
daño celular. De esta manera mediante la reducción univalente, divalente y trivalente del oxígeno molecular
se generan anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (OH.)
respectivamente. Este último es altamente tóxico, ya que es un oxidante poderoso e inespecífico que
puede atacar y dañar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. El anión superóxido O2-, en cambio, no es
demasiado reactivo per-se, pero es el precursor de oxidantes fuertes como ser el peróxido de hidrógeno
y el peroxinitrito [Docampo; 1995]. En condiciones normales, estas especies son mantenidas en
concentraciones constantes y relativamente bajas dentro de la célula por sistemas enzimáticos y
moléculas antioxidantes de bajo peso molecular. Por lo tanto, un desbalance en este estado estacionario
conduce a daños celulares por estrés oxidativo [Turrens; 2004]. T. cruzi está expuesto a las especies
reactivas del oxígeno provenientes de su propio metabolismo y de la respuesta inmune de las células
infectadas. Relacionado con esto último, puede decirse que el mayor mecanismo de muerte de T. cruzi
en macrófagos activados involucra la producción de oxido nítrico, que tal como se mencionó anteriormente
reacciona con el anión superóxido para generar peroxinitrito, una molécula que produce la muerte de
este parásito en una manera dosis dependiente. La mayoría de los organismos aeróbicos poseen dos
tipos de defensas antioxidantes: las enzimáticas y las no enzimáticas. Dentro de las primeras pueden
distinguirse cuatro enzimas antioxidantes principales: 1) Cu-Zn superóxido dismutasa (Cu-Zn SOD),
se encuentra en el citoplasma y en el espacio intermembrana mitocondrial, encargada de transformar el
anión superóxido en peróxido de hidrógeno; 2) Mn-SOD, que posee la misma función que la anterior
pero se encuentra solamente en la matriz mitocondrial; 3) glutatión peroxidasa, encargada de reducir
el peróxido de hidrógeno e hidroperóxidos mediante la concomitante oxidación del glutatión, en este
sistema también participa la glutatión reductasa encargada de reducir el glutatión en un proceso NADPH
dependiente; y por último la catalasa, encargada de catalizar la dismutación del peróxido de hidrógeno
a oxígeno molecular y agua (Fig.9A) Las defensas antioxidantes no enzimáticas, están representadas
por compuestos de bajo peso molecular tales como: vitamina E, vitamina C, ácido úrico, ubiquinona,
cisteína y glutatión. Los tripanosomátidos poseen algunas variaciones en dichos sistemas de
Introducción - 29
detoxificación de ROS, que las convierte en posibles blancos de quimioterapia. Entre ellas pueden
mencionarse: la presencia de dos isoformas (mitocondrial y citosólica) de SOD que contienen hierro,
usualmente encontradas en bacterias y ausentes en células eucariotas; la ausencia de catalasa y glutatión
peroxidasa Se-dependiente, y lo más llamativo, la presencia de un sistema antioxidante tiol-dependiente
para la detoxificación de peróxido de hidrógeno totalmente distinto al de otros organismos. [Turrens;
2004]. En este sistema, el glutatión, molécula primordial involucrada en los procesos de óxido reducción
que conducen a la detoxificación de ROS en la mayoría de las células, es reemplazado una molécula
denominada tripanotiona (N1-N8 bis-glutationilespermidina, T[SH2]). Este compuesto es un tiol de
bajo peso molecular constituído por dos moléculas de glutatión unidas por una molécula de espermidina
[Fairlamb y col; 1992]. La tripanotiona y el glutatión poseen distinta reactividad, de esta manera la
primera es capaz de reducir el dehidroascorbato a ácido ascórbico mientras que el segundo no; y de
manera similar, posee la capacidad de reducir directamente la triparedoxina oxidada, que es una
tioredoxina encontrada en tripanosomátidos que desempeña rol central en el metabolismo de peróxidos
[Turrens; 2004] (Fig.9B). Debido a que la tripanotiona está ausente en células eucariotas, las enzimas
involucradas en su metabolismo son consideradas buenos blancos para el desarrollo de nuevos agentes
quimioterapéuticos. Un ejemplo de ello es la tripanotiona reductasa [Schmidt y col; 2002], la enzima
encargada de mantener a la tripanotiona en su estado reducido T[SH]2, y hacia la cual converge una
intrincada red de vías metabólicas para la detoxificación de hidroperóxidos, y que depende de los
equivalentes de reducción provenientes del NADPH generado fundamentalmente por la vía de las
pentosas fosfato. Si bien esta enzima y la glutatión reductasa pertenecen a la misma familia de flavo
proteínas-disulfuro oxidorreductasas, sus especificidades son mutuamente exclusivas [Steenkamp; 2002].
Para tratar de establecer la relevancia in vivo de la tripanotiona reductasa, se intentaron obtener mutantes
nulos para la enzima en Leishmania, sin embargo todos los intentos realizados fueron infructuosos, ya
que los parásitos, mediante recombinación homóloga llevaban a cabo la duplicación de dicho gen, de
manera tal que solo fue posible obtener simples mutantes. Estos parásitos no presentaron alteraciones
en su crecimiento ni en su capacidad de diferenciarse a amastigotes, sin embargo mostraron una
disminución dramática en su sobrevida dentro de líneas macrofágicas humanas [Dumas y col; 1997]. Tal
como se mencionó anteriormente, en tripanosomátidos la glutatión peroxidasa Se-dependiente está
ausente, en su lugar se ha encontrado una enzima con actividad de peroxidasa dependiente de tripanotiona
a la que se denominó Triparedoxina peroxidasa (TPx), de la cual existen dos isoformas, una con
localización citosólica y la otra con localización mitocondrial. Adicionalmente a esto, se han detectado
en T. cruzi peroxidasas dependientes de glutatión denominadas TcGPXI y TcGPXII, con localización
Introducción - 30
citosólica y glicosomal la primera [Wilkinson y col; 2002], y en retículo endoplásmico la segunda
[Wilkinson, Taylor y col; 2002]. Estas enzimas son similares a las fosfolípido glutatión peroxidasas de
mamíferos y plantas. Poseen la capacidad de metabolizar hidroperóxidos de fosfolípidos y ácidos grasos
pero no peróxido de hidrógeno. Su rol fundamental sería el de protección de membranas al daño por
estrés oxidativo. Estas moléculas se mantienen en estado reducido mediante la transferencia de electrones
por parte del glutatión, y no actúan con tripanotiona [Wilkinson y col; 2000] (Fig.9B). Por último, otro
tipo de tioles encontrados en tripanosomátidos pero no en células de mamíferos son los ovotioles.
Estos compuestos son mercaptohistidinas, inicialmente detectadas en huevos y ovarios de invertebrados
marinos. Constituyen una familia de tres miembros, ovotiol A, B y C que difieren entre si en el número
A
2 O2- +2 H+
1
H2O2 + O2
2
H2O + 1/2 O2
3
2GSH
NADP
+ 4
GSSG 2 H2O
NADPH +H+
Via de las pentosas fosfato
B
1
2 O2- +2 H+
H 2O 2 + O 2
ROOH
ascorbato
dehydroascorbato
2 H2O
ROH
3
2
Tpx(red)
Tpx(ox)
4
2 H2O
GSSG
GSH
*
tripanotiona (red) T[SH]2
tripanotiona (ox) TS2
tripanotiona reductasa
NADP+
NADPH +H+
Via de las pentosas fosfato
Fig.9. Esquema propuesto para el metabolismo antioxidante en mamíferos (A) y kinetoplástidos (B).
A) reacciones enzimáticas antioxidantes presentes en células de mamíferos: 1) Cu,Zn Superóxido dismutasa y MnSuperóxido dismutasa; 2) catalasa; 3) Glutatión peroxidasa; 4) Glutatión reductasa, GSH: glutatión reducido,
GSSG: glutatión oxidado.
B) metabolismo antioxidante presente en kinetoplástidos: 1) Fe-superóxido dismutasa; 2) Ascorbato peroxidasa; 3)
Triparedoxina peroxidasa, Tpx(red): triparedoxina reducida, Tpx(ox): triparedoxina oxidada; 4) Glutatión peroxidasa
I y Glutatión peroxidasa II, ROOH: hidroperóxidos, ROH: alcohol del hidroperóxido, GSH: glutatión reducido, GSSG:
glutatión oxidado, *: interacción no enzimática entre el GSSG y la tripanotiona reducida T[SH]2.
Introducción - 31
de sustituyentes presentes en el grupo α amino. Actúan como detoxificantes no enzimáticos de peróxido
de hidrógeno y radicales libres. En tripanosomátidos se ha detectado la presencia de ovotiol A (N1metil-4-mercaptohistidina) en todos los estadíos del ciclo de vida del parásito, excepto en las formas
sanguíneas de T. brucei y en los amastigotes de Leishmania [Ariyanayagam y col; 2001]. Debido a que
no se ha detectado actividad de ovotiol reductasa en tripanosomátidos, y a que el ovotiol oxidado no es
sustrato de la tripanotiona reductasa, se ha propuesto que dicho compuesto es reducido no
enzimáticamente por la tripanotiona produciéndose por lo tanto consumo de NADPH [Schmidt y col;
2002].
*Metabolismo de poliaminas.
El metabolismo de poliaminas está directamente relacionado con la síntesis de tripanotiona, ya que ésta
se genera a partir de glutatión y espermidina. En T. brucei , las poliaminas son sintetizadas de novo por
medio de la ornitina decarboxilasa (ODC), esta enzima constituye un blanco importante para el desarrollo
de drogas para el tratamiento de la enfermedad transmitida por este parásito. La esencialidad de la
ODC en T. brucei se ha determinado mediante la obtención de parásitos dobles knock-out para este
gen, que mostraron ser incapaces de crecer en ausencia de putrescina. También se ha desarrollado un
inhibidor para esta enzima denominado α−difluorometilornitina (DFMO) que ha demostrado ser efectivo
para curar la infección por T. brucei en ratones y humanos [Schmidt y col; 2002]. T. cruzi, en cambio,
carece de ODC y se provee de poliaminas mediante su captación del medio; de manera tal que los
transportadores de dichas moléculas representan un potencial blanco para el desarrollo de
quimioterapéuticos en este parásito [Le-Quesne y col; 1996].
*Metabolismo de esteroles y lípidos. Señalización y diferenciación celular.
Debido a que los lípidos poseen un rol central en la estructura de membranas celulares y en la señalización
celular y a que las vías de biosíntesis de esteroles en tripanosomátidos difieren de las de mamíferos y se
asemejan a las de hongos, inhibidores desarrollados para algunas de las enzimas fúngicas están siendo
probados en tripanosomátidos [Urbina; 1997].
Introducción - 32
*Vía de las pentosas fosfato.
Glucosa 6- fosfato
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
6-fosfoglucono lactona
Rama
oxidativa
6-fosfoglucono lactonasa
6-fosfogluconato
6-fosfogluconato deshidrogenasa
Ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa
Ribulosa 5-fosfato
Ribulosa 5-fosfato 3-isomerasa
Ribosa 5-fosfato
Xilulosa 5-fosfato
Transcetolasa
Sedoheptulosa 5-fosfato
Gliceraldehído 3-fosfato
Rama no
oxidativa
Transaldolasa
Eritrosa 4-fosfato
Transcetolasa
Gliceraldehído
3-fosfato
Fructosa 6-fosfato
Fig.10. Esquema de la vía de las pentosas fosfatos.
Fructosa 6-fosfato
Introducción - 33
La vía de las pentosas fosfato, llamada también vía de las hexosas monofosfato, o vía oxidativa del
fosfogluconato, es una vía de catabolismo de glucosa en la que pueden distinguirse dos ramas, una
oxidativa y una no oxidativa. A través de la misma se generan cuatro metabolitos principales: 1) NADPH,
para ser utilizado en biosíntesis reductivas y protección contra el estrés oxidativo, 2) ribosa 5-fosfato
para ser utilizada en la síntesis de ácidos nucleicos, 3) eritrosa 4-fosfato, utilizado como precursor de
aminoácidos aromáticos y vitaminas y 4) sedoheptulosa 7-fosfato, utilizado como componente de la
pared celular de algunas bacterias. (Fig. 10). La rama oxidativa de esta vía comienza con la
deshidrogenación de la glucosa 6-fosfato (G6P) en el C1, para dar 6-fosfoglucono- γlactona (γ6PGL)
mediante una reacción esencialmente irreversible catalizada por la glucosa 6-fosfato dehshidrogenasa
(G6PDH). En esta reacción el aceptor de electrones es el NADP+, de manera tal que por cada mol de
G6P oxidado se genera un mol de NADPH. La velocidad de esta reacción es considerada el paso
limitante de la vía en general. El factor regulatorio más importante en este punto es la relación entre las
concentraciones de NADP+ y NADPH de la célula, ya que la coenzima reducida inhibe a la glucosa 6fosfato deshidrogenasa (G6PDH). La γ6PGL generada se hidroliza para dar 6-fosfogluconato (6PG).
Esta reacción puede ocurrir espontáneamente, pero también existe una 6-fosfoglucono lactonasa
(6PGL) específica que cataliza esta reacción produciendo la apertura del anillo de la lactona sólo
cuando ésta se encuentra en configuración γ. A su vez, la γ6PGL puede transformarse en δ6PGL mediante
rearreglos intramoleculares, esta última es considerada un compuesto sin salida (dead end), ya que es
incapaz de hidrolizarse espontáneamente y no es sustrato de la 6PGL. De esta manera se considera que
el rol fundamental de la 6PGL es acelerar la hidrólisis de la γ lactona para evitar su interconversión a la
forma δ, metabólicamente inerte? (Miclet y col; 2001). La última reacción de la rama oxidativa de la vía
de las pentosas, involucra la oxidación y decarboxilación del 6PG para generar ribulosa 5-fosfato (RU5P) en una reacción irreversible catalizada por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH), donde
G6PDH
6PGL
6PGDH
Fig.11. Reacciones correspondientes a la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato
Introducción - 34
el aceptor final de electrones es también el NADP+. La RU-5P así generada es posteriormente
metabolizada en la rama no oxidativa de la vía. De esta manera, por cada mol de G6P que ingresa en
la rama oxidativa, se genera un mol de CO2 y dos moles de NADPH, ver Fig.11.
La rama no oxidativa o de interconversión de azúcares, involucra una serie de reacciones reversibles.
Puede funcionar completa o no dependiendo del estado metabólico particular de la célula. Aquí se lleva
a cabo el paso final de la síntesis de ribosa 5-fosfato (R-5P) que involucra la isomerización de la (RU5P) mencionada anteriormente, por medio de la ribulosa 5-fosfato isomerasa (RU-5PI) en una reacción
que procede a través de un enediol intermediario. Si la célula se encuentra en un estado metabólico tal
que necesita NADPH pero no R-5P, esta última será convertida en gliceraldehido 3-fosfato (G-3P) y
fructosa 6-fosfato (F-6P), mediante una serie de reacciones enzimáticas acopladas en las que intervienen
la transaldolasa (TAL) y la transcetolasa (TKT). De esta manera se establece un vínculo reversible
entre la glicólisis y la vía de las pentosas fosfato. El primer paso de esta serie de reacciones involucra la
epimerización de la RU-5P a xilulosa-5P (Xi-5P) por medio de la ribulosa 5-fosfato epimerasa (RU5PE). Luego, la Xi-5P le transfiere dos unidades carbonadas a la R-5P en una reacción catalizada por
la TKT generándose así sedoheptulosa-7P (S-7P) y G-3P. Posteriormente ambos compuestos reaccionan
entre si por acción de la transaldolasa que cataliza la transferencia de tres unidades carbonadas del
primero al segundo, generándose de esta manera eritrosa 4-P (E-4P) y F-6P. Por último, en una tercer
reacción la transcetolasa cataliza la transferencia de dos unidades carbonadas de la X-5P a la E-4P para
dar G-3P y F-6P que pueden ingresar en la vía glicolítica (Fig.10). De esta manera, el exceso de ribosa
5-P formado a través de la rama no oxidativa de la vía de las pentosas puede ser completamente
convertido en intermediarios glicolíticos, ya que a través de las reacciones antes mencionadas es posible
generar 2 moles de fructosa 6 fosfato y un mol de gliceraldehido 3-fosfato, a partir de 3 moles de
ribosa-5P. Si la célula necesita mucho más NADPH que R-5P, es el caso de aquellas células que llevan
a cabo una síntesis activa de lípidos, la fructosa-6P (generada tal como se mencionó anteriormente) será
isomerizada a glucosa-6P, por medio de la fosfoglucosa isomerasa, y entrará nuevamente en la rama
oxidativa de la vía. Si en cambio, la célula se encuentra en activa división, necesitará más ribosa-5P que
NADPH. En este caso, la rama no oxidativa de la vía de las pentosas funcionará en forma reversa, la
mayor parte de la glucosa 6-fosfato entrará en la vía glicolítica, generándose F-6P y G-3P, y éstos serán
metabolizados a R-5P, por acción de la transaldolasa y transcetolasa mediante la reversión de las
reacciones descriptas anteriormente. Por último, si las necesidades de NADPH y R-5P en célula están
balanceadas, funcionará la rama oxidativa de la vía para cubrir las necesidades de NADPH, y la RU-5P
generada sera isomerizada a R-5P para su posterior utilización [Stryer; 1999].
Introducción - 35
La vía de las pentosas fosfato se encuentra presente en la mayoría de los protozoarios parásitos y está
intimamente relacionada con la defensa contra el estrés oxidativo y detoxificación de xenobióticos. Si
bien experimentos genéticos llevados a cabo en otras células eucariotas mostraron que la vía es
dispensable, permitieron determinar su relevancia en la protección contra el estrés oxidativo [Barrett;
1997]. Durante los últimos diez años, la vía de las pentosas fosfato ha sido objeto de numerosos estudios
en tripanosomátidos. Todas las enzimas de ambas ramas de la vía han sido detectadas en tripomastigotes
procíclicos de T. brucei [Cronin y col; 1989]. y en promastigotes de Leishmania mexicana, donde
también se ha determinado su funcionalidad in vivo [Maugeri y col; 2003]. En T. cruzi, los primeros
estudios realizados mostraron que las dos deshidrogenasas de la rama oxidativa se encontraban presentes
[Raw; 1959]; sin embargo, se dudaba de la existencia de una vía completamente funcional. Recientemente,
[Maugeri y col; 2004] demostraron la presencia de todas las enzimas de ambas ramas de la vía en los
cuatro estadíos del ciclo de vida de T. cruzi, y mediante estudios de liberación de 14CO2 realizados con
glucosa marcada en C-1 o C-6, pudo demostrase su funcionalidad in vivo, como así también la activación
de la misma en presencia de azul de metileno, un compuesto que mimetiza condiciones de estrés mediante
el consumo de NADPH. Inicialmente se consideraba a la vía de las pentosas fosfato como esencialmente
citosólica; sin embargo, posteriores estudios demostraron su presencia en cloroplastos [Schnarrenberguer
y col; 1995] y peroxisomas [Corpas y col; 1998] de plantas superiores como así también la presencia
de las dos deshidrogenasas de la vía en peroxisomas de intestino de rata [Antonekov; 1989] y en
retículo endoplásmico y Golgi de células de intestino de conejo [Ninfali y col; 2001]. Por medio del
análisis de patrones de extracción proteica con digitonina, y experimentos de fraccionamiento subcelular
(llevados a cabo por centrifugación diferencial en gradientes de sacarosa), en epimastigotes de T.
cruzi, fue posible determinar la localización subcelular de las enzimas de la vía en este parásito. Estos
experimentos indicaron que la mayor parte de dichas enzimas posee un componente esencialmente
citosólico, pero mostraron también la existencia de un pequeño componente particulado correspondiente
a la fracción de gránulos chicos y en algunos casos también a la fracción microsomal. Estas localizaciones
sugieren la presencia de una pequeña fracción de las enzimas en glicosomas, y el sistema retículo
endoplásmico-Golgi respectivamente. La Ribulosa 5-fosfato epimerasa, sin embargo constituye una
excepción a lo antes expuesto debido a que en experimentos de digitonina se libera casi completamente
a concentraciones extremadamente bajas del detergente antes que el marcador citosólico utilizado
(piruvato quinasa); sugiriendo su localización en un compartimento altamente accesible [Maugeri y col;
2004]. Adicionalmente, estudios de localización subcelular llevados a cabo en T. brucei mostraron que
la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, al igual que la 6-fosfoglucono lactonasa, poseen una localización
Introducción - 36
dual en glicosoma y citosol [Heise y col; 1999] [Duffieux y col; 2000]. Una distribución similar se
espera para otros miembros de la vía (Ru-5PE, R-5PI y TKT) de T. brucei y Leishmania, ya que han
sido identificadas en bases de datos varias secuencias correspondientes a dichas enzimas que exhiben
señales de tipo PTS1 [Hannaert y col; 2003]. Tal como se mencionó anteriormente, las primeras siete
enzimas de la vía glicolítica se encuentran dentro del glicosoma, por lo que se han propuesto varias
razones para explicar la presencia de la vía de las pentosas fosfato, o al menos parte de ella dentro de
esta organela [Hannaert y col; 2003]. Una de ellas habla de la necesidad de intercambio de intermediarios
entre ambas vías para ajustar las necesidades de ATP, NADPH y precursores de nucleótidos. Otra,
habla de la necesidad de la vía dentro del glicosoma debido a que la síntesis de purinas y pirimidinas, que
utiliza como sustrato el 5-ribosil-1-pirofosfato generado a partir de R-5P se encuentra dentro de esta
organela. Por último debido a que algunas enzimas involucradas en la detoxificación de ROS (que
forman parte del sistema tripanotiona-tripanotiona reductasa) han sido detectadas tanto en citosol como
en glicosomas [Dey y col; 1994] [Wilkinson y col; 2002], y a que también existen evidencias de la
presencia de ésta última en dicha organela; se hace necesaria la presencia de al menos la rama oxidativa
de la vía de las pentosas dentro de la misma para poder cubrir las necesidades de NADPH de la TR
[Hannaert y col; 2003]. Debido al rol fundamental que posee la vía de las pentosas fosfato en la defensa
contra el estrés oxidativo se la considera un potencial blanco para el desarrollo de agentes
quimioterapéuticos; esto es más promisorio aún teniendo en cuenta que en los tripanosomas muchas de
las enzimas que forman parte de esta vía están más relacionadas con isoformas procedentes de
cianobacterias que con sus homólogos de eucariotas. Estas observaciones han llevado a Hannaert y col;
2003, a proponer que los ancestros de los tripanosomátidos albergaron un endosimbionte que se perdió
en algún momento de su evolución después de transferir genes al genoma nuclear. De esta manera,
algunas de las enzimas de tripanosomátidos pertenecientes a esta vía poseen características bioquímicas
diferentes a las de mamíferos, haciendo más promisorio el desarrollo de inhibidores específicos para las
enzimas del parásito. Un ejemplo de ello es la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de Trypanososma
brucei, una enzima esencial para los tripanosomas y cuyas diferencias estructurales y bioquímicas con
las de mamíferos han sido explotadas para el desarrollo de inhibidores específicos [Barrett y col; 2002].
Introducción - 37
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.
Tal como se mencionó anteriormente, la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), es la primera
enzima de la rama oxidativa de la vía de las pentosas y cataliza la oxidación del 6-fosfogluconato a 6fosfoglucono- γ lactona con la concomitante producción de NADPH [Fig. ]. En humanos la G6PDH es
una enzima ´´housekeeping´´ y se encuentra codificada por un gen ligado al cromosoma X, ubicado en
una región del mismo que posee alta variabilidad genética. De acuerdo con esto, existen mas de 100
mutaciones o mutaciones combinadas que conducen a la presencia de casi 200 variantes de este gen.
La mayor parte de esas alteraciones producen la pérdida parcial de la actividad de la enzima, fenómeno
que se encuentra relacionado con la aparición de una amplia variedad de anemias hemolíticas [Beutler y
col; 1996]. Más de 400 millones de personas en el mundo son G6PDH-deficientes, convirtiéndose en
la enzimopatía más común en humanos. Gracias al modelado molecular de la G6PDH humana en base
a la estructura de su homóloga de Leuconostoc mesenteroides, ha sido posible ubicar espacialmente
las mutaciones antes mencionadas, y se ha llegado a la conclusión de que aquellas que se encuentran
ubicadas en la interfase del dímero conducen a una disminución en la termoestabilidad de la enzima.
Algunas variantes genéticas poseen alta incidencia en determinadas partes del mundo, de esta manera se
ha detectado la presencia de dos mutaciones puntuales V68M y N126D, en la G6PDH de poblaciones
africanas que conducen a la pérdida de más del 90% de la actividad enzimática por desestabilización de
la proteína [Gallego y col; 2000]. Debido a que en los glóbulos rojos la única fuente de NADPH
proviene de la vía de las pentosas fosfato, una deficiencia en alguna de las enzimas de la vía, como es el
caso de la G6PDH, conducirá a hemólisis bajo condiciones de estrés oxidativo como ser la ingesta de
determinados alimentos (por ejemplo habas) o incluso medicamentos. Debido a que, tal como se discutió
anteriormente, la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato posee una estrecha relación con los
mecanismos de detoxificación de ROS, en distintos organismos se ha propuesto que la G6PDH forma
parte de un mecanismo inducible de respuesta celular al estrés oxidativo. De esta manera [Ursini y col;
1997] [Salvemini y col; 1999] al igual que [Filosa y col; 2003] mediante trabajos llevados a cabo con
distintos tipos celulares, han demostrado que en respuesta al aumento en las concentraciones intracelulares
de agentes oxidantes como el anión superóxido (O2.), o a disminución en los niveles intracelulares
normales de glutatión reducido (GSH), se produce un incremento en la expresión de la G6PDH,
tendiente a aumentar la producción de NADPH que posteriormente será utilizado para restablecer las
Introducción - 38
condiciones normales de la célula. Originariamente la G6PDH era considerada una enzima citosólica
[Luzzato y col; 1984], pero en la última década su estudio en distintos organismos ha demostrado su
presencia en diferentes compartimientos celulares. [Corpas y col; 1998] detectaron actividad de G6PDH
en peroxisomas de plantas superiores, mientras que [Wendt y col; 2000] demostraron la presencia de
dos isoformas de la enzima, con distintas propiedades cinéticas, en cloroplastos. Más recientemente
[Ninfali y col; 2001] han detectado la presencia de la enzima en retículo endoplásmico liso y rugoso
como así también en aparato de Golgi de células de intestino de conejo. La G6PDH ha sido también
estudiada en parásitos: en promastigotes de Leishmania trópica se han detectado dos isoformas de la
enzima con propiedades cinéticas idénticas, mientras que en Plasmodium sp, la G6PDH existe como
una enzima bi-funcional, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa-6 fosfoglucono lactonasa que cataliza los
dos primeros pasos de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato [Clarke y col, 2003]. En T.
brucei, la actividad de la G6PDH ha sido detectada tanto en citosol como en glicosomas, pero no se
han encontrado evidencias de la presencia de isoenzimas [Heise y col; 1999]. Dufrieux y col [2000]
avalaron esta observación mediante la detección de un único gen para la G6PDH de T. brucei, pero a
pesar de la propuesta localización glicosomal para la enzima, no se detectó ningún tipo de señal PTS1 o
PTS2 de reclutamiento a dicha organela. En T. cruzi, la información acerca de la G6PDH es muy escasa;
en 1977 Funayama y col; purificaron parcialmente la G6PDH de la cepa Y de T. cruzi, y determinaron
algunas de sus propiedades cinéticas. Unos años después, Lupiañez y col [1987] informaron la presencia
de dos diferentes isoenzimas de G6PDH de T. cruzi, una de ellas presente en epimastigotes, con alta
afinidad por su sustrato y otra, presente en tripomastigotes metacíclicos, con menor afinidad por el
mismo. Recientemente, Maugeri y Cazzulo [2004] mediante experimentos de fraccionamiento subcelular
llevados a cabo con epimastigotes de T. cruzi demostraron que un 65% de la enzima posee una localización
citosólica, mientras que el 35 % restante se distribuye entre la fracción microsomal (retículo endoplásmico
y Golgi), y en menor proporción en la fracción denominada de gránulos chicos (donde sedimentan
mayoritariamente los glicosomas).
Introducción - 39
6-fosfogluconato deshidrogenasa.
Tal como se mencionó anteriormente esta enzima es la tercera de la rama oxidativa da la vía de las
pentosas fosfato y cataliza la oxidación y decarboxilación del 6-fosfogluconato a ribulosa- 5P y CO2
con la concomitante producción de NADPH. Estudios llevados a cabo con la 6PGDH de hígado de
oveja han permitido determinar que el mecanismo general de reacción para la enzima se lleva a cabo en
múltiples pasos. Basándose en la dependencia del pH de los parámetros cinéticos, se ha propuesto un
mecanismo general ácido-base para la reacción que involucra una transferencia de hidruros previa a la
decarboxilación (Fig.12). En dicho mecanismo, una base general acepta un protón del 3-OH del 6PG
concomitantemente con la transferencia del ion hidruro del C3 del 6PG al C4 del NADP, generándose
así un 3-ceto derivado. Este es posteriormente decarboxilado para dar un 1-2 enediol intermediario
O
COOH
Lys183
HO
N:
H
Base general
Glu190
H
C OH
H
C OH
H2 C O
Glu190
HO
C
NH2
H
N+
C H
C
O
O
HO
C OH O
H
O
Acido general
C
Lys183
N-H
H
NADP
H
C OH
O
C
H
C OH
H
C OH
NH2
N
NADPH
PO32-
H2 C O
PO32-
O
3-ceto derivado
6-fosfogluconato
CO2
O
O
C
O-
H
Lys183
NH
H
H
C OH
O
C
H
C OH
H
C OH
H2 C O
C
Glu190
H
Lys183
O
NH2
H
HO
N:
Tautomerización
ceto-enólica
N
PO32-
Glu190
HO
H
C OH
C
H
C OH
H
C OH
H2 C O
NADPH
Ribulosa 5-fosfato
Fig.12. Esquema del mecanismo de reacción propuesto para la 6PGDH.
O
NH2
N
PO32-
3-ceto derivado
NADPH
Introducción - 40
que, mediante una tautomerización ceto-enólica genera Ru-5P. A lo largo de la reacción, el protón es
sucesivamente intercambiado entre la base y el oxígeno del azúcar siendo finalmente aceptado por la
primera cuando la Ru-5P ha sido formada. En este mecanismo el ácido general intervendría solamente
en la reacción de tautomerización cediendo un protón al enediol intermediario [Hanau y col 1992]
[Berdis y col ; 1993]. Se ha propuesto que el Glu 190, conservado en todas las 6PGDH funciona como
el ácido general [Karsten y col; 1998], mientras que la base general propuesta es la Lys 183, que
también se encuentra completamente conservada en los distintos organismos para los cuales existen
secuencias diponibles correspondientes a la enzima [Zhang y col; 1999]. La 6PGDH es considerada en
tripanosomátidos un potencial blanco para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos debido a que se
ha demostrado en otros organismos que la deleción del gen que codifica para dicha enzima es letal. La
esencialidad del gen de la 6PGDH para el crecimiento de la forma sanguínea de T. brucei, ha sido
demostrada mediante la técnica de ARNi (ARN de interferencia) [Barrett y col; 2002]. Este efecto
estaría causado por el bloqueo de la vía de las pentosas fosfato como así también de la vía glicolítica, ya
en ausencia de 6PGDH se produce la acumulación de 6PG que ha mostrado ser un potente inhibidor de
la glucosa fosfato isomerasa. [Barrett; 1997]. De acuerdo con lo expuesto, esta enzima ha sido
ampliamente estudiada en T. brucei con la finalidad de encontrar diferencias cinéticas y estructurales
con respecto a su homólogo de mamíferos que permitan el desarrollo de inhibidores específicos. De
esta manera el gen de la 6PGDH de este parásito ha sido identificado y clonado [Barrett y col; 1993],
se ha expresado la proteína recombinante en un sistema heterólogo y se han determinado los parámetros
cinéticos de la misma [Hanau y col; 1996]. También se ha llevado a cabo la cristalización de la proteína
recombinante [Phillips y col; 1998], lo que ha permitido desarrollar inhibidores específicos para la
enzima muchos de los cuales, debido a su elevada afinidad y especificidad han mostrado ser muy
promisorios como potenciales agentes quimiotepaéuticos [ Dardonville y col; 2003] [Dardonville y col;
2004].
Objetivos.
Objetivos - 41
Objetivos.
Dentro del marco de la explotación de distintas vías metabólicas para el desarrollo de nuevos agentes
quimioterapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, y debido a que la rama oxidativa
de la vía de las pentosas fosfato es considerada un posible blanco para el desarrollo de nuevas drogas
(a causa de su potencial rol en la defensa del parásito contra el estrés oxidativo); el principal objetivo de
este trabajo de Tesis fue la realización de un estudio detallado de ambas deshidrogenasas de la vía de las
pentosas fosfato de T. cruzi a los fines de determinar su relevancia en los mecanismos de defensa frente
al estrés oxidativo, como así también la detección de características diferenciales con respecto a sus
homólogos de mamíferos que pudiesen ser potencialmente explotables en el desarrollo de nuevas drogas.
De acuerdo con esto, en la primer parte de este trabajo de Tesis se presenta el análisis de la organización
genómica de la glucosa-6 fosfato deshidrogenasa de T. cruzi, como así también el clonado, expresión y
caracterización de dos de los genes que codifican para dicha enzima. A su vez se presenta un análisis de
la localización subcelular de la misma a largo de los distintos estadíos del ciclo de vida del parásito
como así también un estudio de la relevancia de la enzima en los mecanismos de defensa del parásito
frente a condiciones de estrés oxidativo.
Teniendo en cuenta que, tal como se mencionó anteriormente, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es
una enzima considerada como posible blanco para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos para el
tratamiento de las distintas tripanosomiasis; y que aquella perteneciente a T.brucei ha sido ampliamente
estudiada habiéndose desarrollado inhibidores específicos para esta enzima que día a día están siendo
mejorados; establecimos como objetivo de la segunda parte de este trabajo de Tesis, el clonado, expresión,
caracterización y localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi. A partir de estos estudios y mediante
la comparación de los parámetros cinéticos de ambas deshidrogenasas, como así también mediante la
prueba de algunos de los inhibidores desarrollados para la 6PGDH de T. brucei, nos propusimos
analizar también la factibilidad de la extrapolación de dichos inhibidores a la 6PGDH de T. cruzi.
Glucosa 6 -fosfato deshidrogenasa (G6PDH)
Resultados G6PDH - 42
Identificación y clonado de la G6PDH de Trypanosoma cruzi.
Al comienzo de este trabajo de Tesis en las distintas bases de datos no existían secuencias disponibles
correspondientes al gen de la G6PDH de Tripanosoma cruzi. Así, para obtener el marco abierto de
lectura (ORF) para dicha enzima, se realizó el alineamiento de la secuencia aminoacídica correspondiente
a distintas G6PDHs con el objetivo de identificar regiones conservadas entre las mismas que pudiesen
ser utilizadas en el diseño de oligonucleótidos para llevar a cabo la amplificación del gen de la G6PDH
de T. cruzi por PCR. De esta manera, se alinearon las secuencias aminoacídicas correspondientes a la
G6PDH humana (NP_000393), la G6PDH de T. brucei (CAC07816), la G6PDH de ratón, Mus
musculus (NP_032088), la G6PDH de E. coli (BAB35985), la G6PDH de Leishmania mexicana
(AA037825) y la G6PDH de levadura, Saccharomyces cerevisiae (NP_014158). A partir de dicho
alineamiento se identificaron dos secuencias estrictamente conservadas: la de unión a cofactor GASGDLA,
y aquella denominada la firma de las G6PDHs RIDHYLGKE. En base a dichas secuencias se diseñaron
dos oligonucleótidos degenerados, con residuos de inosina en la tercer base de alguno de sus codones
Pr-s: 5’-GGIGCGTCIGGIGACTTGGC-3’, y Pr-as: 5’-TCCTTICCIAGGTAGTGGTC-3’ que
permitieron amplificar una secuencia de 519 pb correspondiente a la región central del gen de la G6PDH
de T. cruzi que fue clonada en pGEM®−T Easy (Promega) y completamente secuenciada (Fig1 A). A
partir de la misma se diseñaron tres oligonucleótidos anti sentido denominados Pr-1: 5’TGCGGAATACCTGGCGTTCA-3’, Pr-2: 5’-AAGAGCTGCTCGGAGGTCTC-3’, Pr-3:
CATCGCCCCTTTGCTGAGAC-3’, para obtener el extremo 5’ del gen mediante transcripción reversa
y 5’-RACE (amplificación rápida de extremos 5’ de ADNc). De esta manera, el Pr-1 fue utilizado para
la síntesis de ADNc, de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos, para posteriormente
emplearlo como molde en la siguiente reacción de PCR. En dicha reacción, como oligonucleótido sentido
se utilizó el denominado Pr-SL: 5’-AACGCTATTATTGATACAGTTT-3’, correspondiente a parte de
la secuencia del mini exón o splice leader presente en todos los ARNm de Trypanosoma cruzi, y
como anti sentido el Pr-1. Luego, mediante sucesivas reacciones anidadas de PCR utlizando siempre el
Pr-SL como sentido, y los Pr-2 y Pr-3 como anti sentido, fue posible obtener el extremo 5’-del gen de
la G6PDH de T. cruzi. Luego de la tercera reacción de PCR se obtuvieron dos productos de amplificación
de 902 pb y 662 pb respectivamente que fueron clonados en pGEMT- Easy y completamente
secuenciados resultando ser ambos parte del gen de la G6PDH (Fig.1 B). Ambas secuencias presentaban
dos posibles codones de iniciación separados uno de otro por 111 pb, y la diferencia entre ambas
radicaba en la longitud de la región no codificante del 5’ (5’-UTR), presente entre el extremo 3’ del mini
Resultados G6PDH - 43
exón y el primer ATG. De esta manera, para el producto de amplificación de 902 pb el 5’-UTR poseía
una longitud de 270 pb (Fig.1 B1), mientras que para el fragmento de 662 pb, su longitud era de tan sólo
30 pb (Fig.1 B2). De acuerdo con esto se propuso la existencia de dos posibles codones de iniciación
para la traducción del gen de la G6PDH de T. cruzi. Algo similar fue reportado para la G6PDH de T.
brucei [Duffrieux y col; 2000] donde se detectó también la presencia de dos posibles codones de
iniciación de la traducción separados uno de otro por 111 pb. En este caso, sin embargo, los experimentos
de 5’-RACE llevados a cabo mostraron un único producto de amplificación que poseía un 5’-UTR de
tan sólo 86 pb entre el extremo 3’ del mini exón y el primer ATG. Dicha región no codificante del 5’ fue
considerada como inusualmente corta para ser funcional, de manera que la G6PDH recombinante de T.
brucei fue expresada únicamente a partir del segundo codón de iniciación. En el caso de T. cruzi,
tanto el primer como el segundo ATG podrían ser funcionales ya que, siguiendo el mismo criterio aplicado
para la enzima de T. brucei, el 5’-UTR de 30 pb, mencionado con anterioridad, podría ser considerado
como demasiado corto para ser funcional, dejando en este caso, al segundo codón de iniciación como
A
GASGDLAK
RIDHYLGKE
GGIGCGTCIGGIGACTTGGC
secuencia de proteínas de G6PDHs
TCCTTICCIAGGTAGTGGTC
519 bp
B
111 bp
Pr-3
Pr-2
Pr-1
ATG ATG
270 bp 5’-UTR
1
TAA
T. cruzi G6PDH ORF
ME
30 bp ATG
5’-UTR
2
ME
Pr SL ATG
TAA
T. cruzi G6PDH ORF
Tc GH56
Tc GRQ77
Fig.1. Diagrama correspondiente a los distintos pasos realizados para la obtención del gen de la G6PDH de T.
cruzi. A) Esquema correspondiente a las secuencias estrictamente conservadas (entre las distintas G6PDHs) utilizadas
para el diseño de los oligonucleótidos degenerados que permitieron la amplificación por PCR de un fragmento de 519
pb correspondiente a la región central del gen de la G6PDH de T. cruzi. B) Esquema correspondiente al 5´RACE
llevado a cabo para obtener el extremo 5´del gen de la G6PDH de T. cruzi. En dicho ensayo como oligonucleótido
sentido se utilizó parte de la secuencia correspondiente al splice leader de T. cruzi, y como anti sentido los
oligonucleòtidos nombrados como Pr-1, Pr-2 y Pr-3 en el panel A. Las dos secuencias amplificadas: 1- de 902 pb de
longitud (conteniendo un 5´UTR de 270 pb desde el 3´del splice leader hasta el primer ATG) y 2- de 602 pb de
longitud (que presenta un 5´UTR de tan sólo 30 pb) se encuentran señaladas. En ambos casos, los dos codones de
iniciación de la traducción (separados por 111pb) se encuentran destacados. La ubicación de los dos GSS utlizados
para completar la secuencia correspondiente al 3´del ORF de la G6PDH de T. cruzi, se muestra con líneas punteadas.
Resultados G6PDH - 44
el más probable. Sin embargo, el 5’-UTR de 270 pb de longitud, presente en el producto de amplificación
de 902 pb, ofrece la posibilidad del comienzo de la traducción a partir de cualquiera de los dos ATG.
El extremo 3’ del gen de la G6PDH de T. cruzi se obtuvo finalmente mediante la superposición de dos
GSS (TcGH56 y TcGRQ77) pertenecientes a la base de datos de TIGR (The Institute for Genomic
Reseach) obtenidos posteriormente a partir de una búsqueda realizada en el proyecto genoma de T.
cruzi. Dicha búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa TblAstN [Altschul y col; 1997], y la
secuencia aminoacídica de la G6PDH de T. brucei (CAC07816) como molde. Finalmente, el ORF
correspondiente a la G6PDH de T. cruzi se obtuvo mediante la superposición de la secuencia interna de
519 pb mencionada anteriormente, las secuencias obtenidas por 5’ RACE, y los dos GSS antes
mencionados. A partir de dicha superposición se concluyó que el gen de la G6PDH de T. cruzi podía
poseer una longitud de 1668 pb (a partir del primer codón de iniciación); este gen fue denominado
G6PDHlarga; o 1557 pb (a partir del segundo ATG) al cual denominamos G6PDGcorta.
El ORF correspondiente a la G6PDHcorta se amplificó por PCR a partir de ADN genómico utilizando
dos oligonucleótidos diseñados en base a la secuencia ensamblada mencionada anteriormente a cada
uno de los cuales se le agregó un sitio de corte para enzimas de restricción (para llevar a cabo el clonado
direccional de la enzima en el vector de expresión pET28a (+)). El oligonucleótido sentido, al cual se le
agregó el sitio NheI (subrayado), fue diseñado para hibridizar la región flanqueante del segundo codón
de iniciación G6PDHcfw: 5’-TCCAAGTGCTAGCATGGAGAACGCCAAA-3’ mientras que el
antisentido, al cual se le agregó el sitio XhoI (subrayado), fue diseñado en base a una región de la
secuencia intergénica del 3’, G6PDHcrev:5’-CCGCTCGAGACGTTGTTCGATGTTCA-3’. Por otro
lado, el gen completo correspondiente a la G6PDHlarga se amplificó también a partir de ADN genómico
de T. cruzi clon CL Brener. El oligonucleótido sentido se diseñó para hibridizar la región flanqueante al
primer codón de iniciación y se le adicionó un sitio NheI para (igual que en el caso anterior) permitir el
clonado direccional de dicho gen en el vector de expresión, G6PDH Lfw : 5´CTAGCTAGCATGAGTGGATCGGAGA-3´. El oligonucleótido anti sentido fue el mismo utilizado
para el clonado de la G6PDHcorta. Los productos de PCR así amplificados fueron clonados en pGEMTeasy y completamente secuenciados. El análisis de dichas secuencias mostró la presencia de polimorfismos
entre los genes sobre los cuales se discutirá más adelante.
Resultados G6PDH - 45
Organización genómica de la G6PDH de T. cruzi.
Con la finalidad determinar la organización genómica de la G6PDH de T. cruzi, se llevaron a cabo
experimentos de Southern blot de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos utilizando el
gen de la G6PDHcorta como sonda. De esta manera, cuando el ADN genómico de T. cruzi fue digerido
con enzimas de restricción, cuyos sitios de corte se encontraban ausentes dentro del gen de la G6PDH,
se observaron patrones variados dependiendo de la enzima utilizada. Así, cuando la digestión se llevó a
cabo con (KpnI, NcoI y SacI) se observaron tres bandas reactivas, mientras que al utilizar (XhoI,
SacII y NheI) o (BamHI, HindIII, NdeI y NotI), se observaron dos, o una banda reactiva respectivamente
(Fig.2). A su vez, digestiones llevadas a cabo con enzimas de restricción con un único sitio de corte
dentro del gen de la G6PDH de T. cruzi, mostraron patrones extremadamente complejos. Estos resultados
hicieron pensar en la existencia de más
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
de un gen correspondiente a la enzima.
Para corroborar la presencia de
Kpb
múltiples copias del gen de la G6PDH
10
9
8
7
6
5
4
en el genoma de T. cruzi se analizaron
las secuencias de 70 GSS de T. cruzi
3
aparecidos recientemente en la base de
2
datos de TIGR, y varios clones
1.4
correspondientes a la G6PDHcorta y
G6PDH larga obtenidos mediante
reacciones independientes de PCR. A
partir de dicho análisis pudieron
identificarse dos pseudo genes, uno de
Fig.2. Análisis del número de genes
correspondiente a la G6PDH de T. cruzi.
Autorradiografía correspondiente a un ensayo de
Southern blot llevado a cabo para determinar el
número de genes correspondiente a la G6PDH de T.
cruzi. El gen completo de la G6PDHcorta marcado con
P32 fue utilizado como sonda y el ADN genómico
fue digerido con: línea 1: BamHI, línea 2: KpnI, línea
3: NcoI, línea 4: XhoI, línea 5: SacII, línea 6: SacI,
línea 7: NheI, línea 8: HindIII, línea 9: NdeI y línea 10:
NotI.
ellos con un codón de terminación 321
pb río abajo del primer ATG, que
codifica
para
una
proteína
extremadamente corta que carece del
sitio de unión a sustrato y por lo tanto
es considerada como no-funcional; y
otro con un codón de terminación en la
base 1233. El polipéptido de 411
Resultados G6PDH - 46
residuos de aminoácidos derivado a partir de dicho pseudo gen presenta tanto el sitio de unión a
cofactor como el sitio de unión a sustrato, pero carece del extremo C-terminal de la proteína. Todos los
esfuerzos llevados a cabo para expresar esta enzima en E. coli como una proteína recombinante soluble
fueron infructuosos, independientemente de las condiciones de expresión utilizadas. En todos los casos,
la enzima se presentaba en cuerpos de inclusión como una proteína de masa molecular aparente de 45
kDa, no siendo posible detectar actividad enzimática diferencial entre los cultivos controles e inducidos.
Esto probablemente se deba a un plegamiento incorrecto de la proteína, lo que condujo a clasificar
también a dicho pseudo gen como no-funcional. El resto de las secuencias analizadas pudieron ser
separadas en tres grupos correspondientes a genes completos (no mutados) de la G6PDH de T. cruzi,
que poseen un 99 % de identidad entre si. La mayor parte de los cambios nucleotídicos observados en
dichos genes fueron conservativos y no involucraron residuos importantes para la catálisis, sin embargo
no puede descartarse que dichas divergencias puedan afectar de algún modo la estabilidad de la enzima
como ocurre con la G6PDH humana, donde simples mutaciones pueden conducir a la desestabilización
de la enzima [Gallego y col; 2000]. Las secuencias nucleotídicas correspondientes al gen de la G6PDH
de los tres grupos antes mencionados podían codificar tanto para la G6PDH corta de 518 residuos de
aminoácidos, como para la G6PDHlarga de 555 residuos de aminoácidos de longitud, ya que en dichos
grupos ambos codones de iniciación se encontraban presentes. De esta manera, las secuencias
polipeptídicas traducidas a partir de los genes mencionados presentaban una masa molecular aparente
calculada de 58 kDa en el primer caso, o 63 kDa en el segundo. La divergencia entre las secuencias de
dichos grupos se veía reflejada tan sólo en leves cambios en el punto isoeléctrico calculado para cada
una de ellas, así para la G6PDH larga los pI correspondientes a las secuencias pertenecientes a los tres
grupos eran 8.0, 7.0, y 6.86 ; mientras que para las secuencias correspondientes a la G6PDHcorta los pI
calculados fueron 7.4, 7.6 y 7.3. Por otro lado, las secuencias río arriba y río abajo del gen de la
G6PDH presentaban marcadas divergencias entre los tres grupos antes mencionados e incluso con
aquellas correspondientes a los pseudo genes descriptos más arriba. Todo esto nos permitió confirmar
la presencia de más de un gen para la G6PDH en el genoma de T. cruzi. Adicionalmente, mediante la
introducción de cada una de las secuencias correspondientes a la G6PDH de T. cruzi de los tres grupos
en la base de datos “gene db” (www.genedb.org), fue posible llevar a cabo la identificación de los
genes acompañantes o flanqueantes de cada uno de ellas. Esto también se realizó para la G6PDH de T.
brucei y Leishmania encontrándose cierta correlación entre los genes acompañantes de las mismas y
aquellos pertenecientes al entorno de la G6PDH de T. cruzi. De esta manera, río arriba de uno de los
genes completos de la G6PDH de T. cruzi como así también del pseudo gen que codificaba para la
Resultados G6PDH - 47
proteína de 45 kDa, se detectó una secuencia correspondiente al gen de una peroxidasa ascorbato
dependiente. Este mismo patrón se observó para la G6PDH de L. major. A su vez, río abajo de uno de
los alelos correspondiente al gen completo de la G6PDH de T. cruzi que poseía mayor porcentaje de
identidad con su homólogo de T. brucei, se detectaron varios genes no identificados y un gen
correspondiente a la adenilato kinasa de T. cruzi. Una distribucion genómica similar se observó para la
G6PDH de T. brucei. El resto de los genes correspondientes a la G6PDH de T. cruzi resultaron tener
entornos diferentes no conservados en otros tripanosomátidos. Estas observaciones tienen buena
correlación con los análisis llevados a cabo por Ghedin y col [2004], donde se estudió la conservación
del orden genético (sintenía) en kinetoplástidos. Dichos estudios demostraron la presencia de una fuerte
conservación en el orden de los genes entre los tripanosomátidos probablemente debida a que dichos
organismos tuvieron un ancestro común hace 400 o 600 millones de años. En dicho trabajo se mencionó
el hecho de que la mayor parte de los genes encontrados en posiciones similares eran ortólogos y que en
aquellos casos donde se observaba pérdida en la sintenía, ésta era debida a rearreglos en el genoma
inducidos por la inserción de retrotransposones. Es
Kpb.
A
B
C
2200
1600
1250
1020
825
680
610
importante destacar que en las regiones flanqueantes a
los genes de la G6PDH de T. cruzi pudieron ser
detectadas también numerosas secuencias
correspondientes a estos últimos lo que indicaría que
dichos genes se encuentran en regiones variables del
genoma tal como ocurre con la G6PDH de mamíferos
cuyo gen se encuentra ubicado en una región
hipervariable del cromosoma X (Xq28). Por otro lado,
el hecho de haber detectado entornos genéticos
distintos para cada uno de los genes correspondientes
a la G6PDH de T. cruzi demostró que los mismos no
se encuentran dispuestos unos detrás de otros ( en
buena concordancia con la ausencia de unidades
Fig.3. Electroforesis en campo pulsante de la
G6PDH de T. cruzi. Autorradiografía
correspondiente a una electroforesis en campo
Pulsante llevada a cabo tal como se menciona en
la sección Materiales y Métodos. El gen de
G6PDHcorta (marcado con P32) fue utilizado como
sonda. A-B y C bandas reactivas de 1425 Kpb,
1000 Kpb y 740 Kpb respectivamente.
repetitivas en el experimento de Southern blot).
Posteriormente, y en un intento de determinar la
distribución cromosómica del gen de la G6PDH de T.
cruzi, se llevó a cabo una electroforesis en campo
pulsante (Pulse Field gel electrophoresis), tal como se
Resultados G6PDH - 48
describe en la sección Materiales y Métodos utilizando también en este caso el gen de G6PDHcorta como
sonda. En dicho experimento se detectaron de tres bandas reactivas de 1425 Kpb, 1000 Kpb y 740
Kpb respectivamente, indicando que los genes de la G6PDH de T. cruzi se encuentran distribuidos en
tres de los cromosomas del parásito (Fig.3).
Análisis de la secuencia primaria de la G6PDH.
La única estructura cristalina correspondiente a una G6PDH disponible hasta el momento es la de
Leuconostoc mesenteroides [Rowland y col; 1994]. Dicha enzima ha recibido particular atención debido
a que estas bacterias poseen una vía glicolítica incompleta por lo que llevan a cabo la metabolización de
la glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato. Esta enzima puede utilizar como cofactor tanto
NADP como NAD y es la única G6PDH que carece de cisteínas en su secuencia. La forma activa de la
enzima es un dímero y sus monómeros poseen 485 residuos de aminoácidos. La estructura
correspondiente a dicha proteína ha sido ampliamente utilizada para llevar a cabo el modelado molecular
de sus homólogos de plantas y humanos. En este último caso dichos modelos han sido utilizados para
ubicar espacialmente y analizar la relevancia de las distintas mutaciones puntuales presentes en la enzima
y que causan diversos tipos de anemias hemolíticas. La G6PDH de T. cruzi posee un 35 % de identidad
con la G6PDH de Leuconostoc mesenteroides y el siguiente análisis de su estructura primaria se llevó
a cabo en base a la descripción detallada realizada para su homólogo bacteriano. De esta manera, fue
posible determinar que cada uno de los monómeros correspondientes a la enzima se encuentra constituído
por dos dominios: el dominio N-terminal (de unión a cofactor) que comprende los residuos 63 a 242
(desde el primer codón de iniciación) y contiene la secuencia típica de unión a dinucleótidos “GASGDLA”.
Dentro de dicho dominio pudo ubicarse la Arg109 (Arg72 en la G6PDH humana y Arg46 en las secuencia
correspondientes a la enzima de Leuconostoc respectivamente) responsable de otorgar especificidad a
la enzima por el NADP, ya que es la encargada de unir el 2’ fosfato del cofactor (Fig.4). En la estructura
dimérica de la enzima el dominio de unión a cofactor se encuentra ubicado en los extremos de cada uno
de los monómeros protruyendo hacia el solvente. El segundo dominio (C-terminal) comprende los
residuos de aminoácidos 243 a 556. Dentro del mismo se encuentra el sitio activo de la enzima que
constituye un bolsillo y posee una gran proporción de residuos estrictamente conservados. La secuencia
“RIDHYLGKE” (residuos de aminoácidos 243 a 251), cuya His246 se encarga de unir el sustrato, forma
Resultados G6PDH - 49
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
#
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
* * * * #
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
+
* * * * *
+
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
+
+
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
+
+ ++
++
+
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
+
+
+
+
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
Tc-G6PDH
Tb-G6PDH
L.mex-G6PDH
Human-G6PDH
Fig.4. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas deducidas de distintas G6PDHs. Las secuencias
correspondientes a: G6PDHlarga de T. cruzi (con mayor homología con la G6PDH de T. brucei), G6PDH de T. brucei
(CAC07816) con la extensión amino terminal de 37 residuos de aminoácidos, G6PDH de Leishmania mexicana
(AA037825) y G6PDH humana (NP_000393) fueron alineadas por el método Clustal. La primer y segunda metionina
(en las G6PDHs de T. cruzi y T. brucei) se encuentran señaladas, como así también los dos residuos de cisteína
diferenciales presentes en la extensión amino terminal de la G6PDH de T. cruzi. El sitio de unión a cofactor se
encuentra señalado con una línea horizontal, y la secuencia denominada la firma de las G6PDHs (que forma parte del
sitio de unión a sustrato) se encuentra destacada con asteriscos. Los residuos involucrados en la unión del sustrato
y cofactor se encuentran señalados con #, los residuos de cisteína presentes dentro de la secuencia de la G6PDH de
T. cruzi se encuentran señalados con una estrella, y aquellos sujetos a mutación en las variantes genéticas de la
G6PDH humana y que se encuentran involucrados en la desestabilización de la proteína se presentan señalados con
una cruz.
Resultados G6PDH - 50
parte del sitio activo de la enzima, como así también residuos de aminoácidos circundantes a la misma y
algunos otros que se encuentran mas alejados en la estructura primaria de la enzima (Fig.4).
Cuando las secuencias aminoacídicas de las G6PDH de T. cruzi, T. brucei y Leishmania mexicana
son comparadas con aquellas pertenecientes a sus homólogos de otros organismos, se observa que los
37 residuos de aminoácidos comprendidos entre el primer y el segundo codón de iniciación constituyen
una inusual extensión N-terminal presente en las enzimas de tripanosomátidos, ya que la longitud de la
mayoría de las G6PDHs de distintas especies se correlaciona con los 519 residuos de aminoácidos
correspondientes a la proteína traducida a partir del segundo codón de iniciación, (con la excepción
de la G6PDH de cloroplastos sobre la cual se hablará más adelante). Cabe aclarar que la G6PDH de
Leishmania mexicana (AA037825) también presenta una extensión de 40 residuos de aminoácidos
similar a la presente en T. brucei y T. cruzi, sin embargo en dicha proteína existe un único codón de
iniciación de la traducción (Fig.4). El análisis de la composición aminoacídica de dichas extensiones
mostró la existencia de una gran cantidad de residuos de aminoácidos cargados, tanto positiva como
negativamente manteniéndose de esta manera el balance de cargas. A su vez la comparación de dichas
secuencias mostró la existencia de un 59.2 % de identidad entre la de T. cruzi y la de T. brucei, y un
62.8 % de identidad entre T. cruzi y Leishmania mexicana. Tal como se mencionó con anterioridad la
G6PDH presente en cloroplastos de plantas superiores posee también una extensión N-terminal de 60
residuos de aminoácidos, que constituye un péptido de tránsito a plástidos [Wendt y col; 2000], pero
carece de homología con aquella encontrada en tripanosomátidos. Para determinar si las extensiones
presentes en la G6PDH de dichos parásitos constituían algún tipo de señal de direccionamiento de la
proteína hacia alguna organela en particular, éstas fueron analizadas con los programas computacionales
PsortII (www.psort.org), TargetP (www.cbs.dtu.dk/services/targetP) y SignalP (www.cbs.dtu.dk/
services/signalP) obteniéndose en todos los casos resultados negativos. Ante todo lo expuesto, y
teniendo en cuenta que dicho análisis no fue llevado a cabo con la G6PDH de T. brucei y Leishmania,
consideramos de gran interés la determinación de la posible función de dicha extensión N-terminal en la
G6PDH de T. cruzi (ver más adelante).
Expresión de la G6PDHcorta y G6PDHlarga recombinantes de T. cruzi.
Tal como se mencionó en párrafos anteriores, si bien el gen de la G6PDH de T. brucei, presenta
también los dos codones de iniciación para la traducción se eligió unicamente el segundo de ellos para la
Resultados G6PDH - 51
expresión en E. coli de la enzima recombinante [Duffieux y col; 2000]. De esta manera, la G6PDH de
T. brucei fue expresada como una proteína soluble y activa de 521 residuos de aminoácidos de longitud
(tamaño correspondiente a la mayoría de las G6PDHs citosólicas). A los fines de poder comparar
ambas enzimas parasitarias el gen correspondiente a la G6PDH de T. cruzi que poseía mayor identidad
con su homólogo de T. brucei fue
A
1
2
3
seleccionado inicialmente para expresar la
kDa
proteína recombinante en E. coli a partir
del segundo codón de iniciación. De esta
66
manera, dicho gen, que previamente había
sido clonado en pGEMT-easy, fue
45
liberado del vector mediante digestión con
NheI y XhoI, y posteriormente clonado
24
en el vector de expresión pET28a(+) de
manera tal de obtener la proteína
recombinante con un tracto de 6 residuos
B
kDa
1
2
3
4
de histidinas en su extremo amino terminal.
Posteriormente, la construcción pET28a
(+)-G6PDH corta fue utilizada para
66
45
transformar E. coli de la cepa BL21
codon Plus (DE3) y obtener proteína
recombinante que pudo ser purificada por
24
Fig.5. Indución y purificación de las G6PDHs de T. cruzi. A)
SDS page 10% teñido con Coomasie Brillant Blue correspondiente
a la inducción y purificación de la G6PDHcorta de T. cruzi. En la
primera y segunda calle se presentan extractos totales de E. coli
libres de células correspondientes a: línea 1- BL21 CodonPlus (DE3)
transformadas con pET28a(+)-G6PDHcorta sin inducir; línea 2- BL21
CodonPlus (DE3) transformadas con pET28a(+)-G6PDH corta
inducido; línea 3 G6PDHcorta purificada por IMAC. B) SDS page
10% teñido con Coomasie Brillant Blue correspondiente a la
inducción de la G6PDHlarga de T. cruzi. En todas las calles (excepto
en la última) se presentan resuspenciones de células provenientes
de 100 µl de cultivo correspondientes a: línea 1- E. coli BL21
codonPlus (DE3) transformadas con pET28a (+) inducido, línea 2E. coli BL21 codonPlus (DE3) transformadas con pET28a (+)G6PDHlarga sin inducir , línea 3 E. coli BL21 codonPlus (DE3)
transformadas con pET28a (+)-G6PDHlarga , línea 4 G6PDHcorta ,
cuerpos de inclusión purificados.
IMAC tal como se describe en la sección
Materiales y Métodos. Si bien las mejores
condiciones encontradas para la inducción
de la G6PDHcorta de T. cruzi fueron 3 hs a
28 °C en medio LB, esto no impidió que
buena parte de la proteína recombinante
permaneciera en cuerpos de inclusión. Sin
embargo, la cantidad de proteína presente
en la fracción soluble fue suficiente para la
determinación de los parámetros cinéticos
de la misma (Fig.5). La G6PDHcorta
Resultados G6PDH - 52
recombinante resultó ser bastante afectada por la purificación por columnas de Ni2+ (esto se vio reflejado
en los bajos porcentajes de recuperación de la actividad enzimática observados que resultaron ser
independientes de la concentración de imidazol utilizada). Ante lo expuesto, y teniendo en cuenta la
escasa proporción de la proteína recombinante presente en la fracción soluble, se decidió llevar a cabo
las eluciones en presencia de 300 mM de imidazol, ya que esto permite eluir completamente la proteína
en volúmenes pequeños de solución amortiguadora y obtener por lo tanto una solución más concentrada
de la misma. La purificación llevada a cabo de esta manera tuvo un rendimiento del 35 % y la actividad
específica de la proteína recombinante fue de 1.3 µmol.min-1 .mg-1.
Debido a que tal como se mencionó con anterioridad en T. brucei la G6PDH sólo había sido expresada
a partir de su segundo codón de iniciación y no había sido determinada la relevancia de la extensión Nterminal presente en dicha proteína, nos resultó de interés llevar a cabo dicho análisis para la G6PDHlarga
de T. cruzi. De esta manera el gen correspondiente a la enzima se clonó en el vector de expresión tal
como se mencionó anteriormente y la expresión de la proteína recombinante se realizó de acuerdo al
mismo protocolo utilizado para la G6PDHcorta. En estas condiciones casi la totalidad de la enzima
recombinante se presentó en cuerpos de inclusión (Fig. 5 B) con una masa molecular aparente de 61.7
kDa, sin embargo la fracción soluble correspondiente a los extractos totales inducidos (donde la proteína
recombinante sólo podía ser identificada por western blot) presentó una actividad específica 3 veces
superior a la fracción soluble correspondiente a los extractos controles. La proteína recombinante fue
purificada de acuerdo al mismo protocolo utilizado para la purificación de la G6PDHcorta, obteniéndose
un rendimiento del 48 % (esta enzima también perdió gran parte de su actividad al ser purificada por
columna de Ni2+) y una actividad específica de 7.9 µmol.min-1.mg-1 , marcadamente superior a la registrada
para la G6PDHcorta.
Determinación de masa molecular aparente de subunidad y de la G6PDH activa
de T. cruzi.
La G6PDHcorta recombinante purificada por IMAC mostró una masa molecular aparente de subunidad
determinada por SDS Page [Weber and Osborn; 1969] de 57 kDa (Fig.6 A), en buena correlación con
la masa molecular estimada 60.7 kDa (incluyendo el tracto de 6 residuos de histidina y el sitio de corte
para trombina, presentes en el extremo amino terminal de la proteína recombinante). Por otro lado, con
la finalidad de llevar a cabo la determinación de la masa molecular aparente de la proteína recombinante
activa, se realizaron experimentos de filtración por gel utilizando una columna Bio-Sil SEC 250 (BIO-
Resultados G6PDH - 53
RAD), tal como se describe en la sección Materiales y Métodos. En dichos ensayos la G6PDHcorta
purificada eluyó como un único pico con actividad de G6PDH con una masa molecular aparente de 128
kDa. De acuerdo con estos resultados, la G6PDHcorta de T. cruzi sería una proteína dimérica, en buena
correlación con la mayoría de las G6PDHs (Fig. 6B).
B
A
17 kDa
44 kDa
30.0
158 kDa
kDa
nmoles.seg-1
70
BD
35.0
670 kDa
mAU
60
66
25.0
45
20.0
40
15.0
30
24
10.0
5.0
50
20
10
2.0
4.0
6.0
8.0
10
ml
Fig.6. Determinación de la masa molecular aparente de la G6PDHcorta de T. cruzi. A) SDS Page teñido con nitrato
de plata correspondiente a la G6PDHcorta de T. cruzi purificada por IMAC. Dicha proteína presenta una masa
molecular aparente de subunidad de 58 kDa. B) Determinación de masa molecular aparente de la G6PDHcorta activa por
filtración en gel en una columna BIO-Sil SEC 250. La proteína recombinante activa eluyó en un único pico de una
masa molecular aparente de 128 kDa, que presentó actividad de G6PDH.
Efecto del DTT sobre la actividad de la enzimática de la G6PDH de T. cruzi.
Estudios previos llevados a cabo con extractos totales de epimastigotes de T. cruzi del clon CL Brener,
mostraron que la actividad correspondiente a la G6PDH nativa era afectada de manera dramática por la
presencia de un agente reductor en la muestra (ej. DTT). De esta manera, se determinó que la incubación
de los extractos libres de células en presencia de 4 o 62.5 mM DTT durante 10 min conducía a la
pérdida de un 50% y un 85% de su actividad respectivamente, y a partir de los 20 min de incubación la
actividad de la enzima se hacía indetectable (para ambas concentraciones del agente reductor). El mismo
efecto se observó en extractos totales de tripomastigotes metacíclicos, amastigotes y tripomastigotes de
cultivo debido a que presentaron una marcada disminución en la actividad correspondiente a la enzima
Resultados G6PDH - 54
al ser incubados durante 10 min en presencia de 4 mM DTT. El agregado de un inhibidor de proteasas
como el E64 no previno de manera alguna la inactivación de la enzima sugiriendo que la pérdida de
actividad enzimática registrada no se debía a la degradación de la proteína sino más probablemente a la
reducción de algunos residuos de cisteína que necesariamente deben mantenerse oxidados para preservar
su actividad. El mismo experimento se llevó a cabo con extractos totales de Leishmania mexicana
cepa Costa Rica y Leishmania mexicana MNYC/BZ/62/M379 no detectándose cambios significativos
en la actividad de la enzima. Algo similar ocurre con la G6PDH de T. brucei ya que los protocolos de
purificación de la enzima nativa informados por Heise y col [1999], incluyen el agregado de 1 mM DTT
(concentración final) en todas las soluciones amortiguadoras utilizadas. Teniendo en cuenta que la
inactivación de las G6PDHs por agentes reductores es una característica exclusiva de las G6PDHs
sometidas a regulación redox como ser las isoformas de G6PDH presentes en cloroplastos de plantas
superiores [Wenderoth y col 1997], y G6PDH sujetas a regulación redox de cianobacterias [Summers
y col; 1995] (ver más adelante), y que por otro lado las isoformas citosólicas en general no son afectadas
de manera alguna por la presencia de dichos compuestos; decidimos estudiar el efecto del DTT sobre la
G6PDHcorta recombinante purificada por columna de Ni2+ eluída en presencia de 300 mM imidazol. A
diferencia de lo esperado, al incubar la enzima durante 5 min en presencia de distintas concentraciones
de DTT se observó un aumento en su actividad conforme se aumentaba la concentración del agente
reductor. Así, cuando a la G6PDHcorta purificada se le adicionó DTT hasta una concentración final de 1
mM se detectó un incremento del 11% en la actividad de la enzima, mientras que al incubarla en
presencia de 5 mM DTT el mismo fue del 19 %. A su vez la incubación de la proteína en presencia de
25 mM y 62.5 mM DTT durante 5 min condujo a un incremento en su actividad del 22 y del 24 %
respectivamente. Este fenómeno de activación puede ser explicado si se considera que las enzimas
purificadas por IMAC sufren frecuentemente oxidaciones que conducen a menudo a la pérdida de
actividad enzimática que puede ser revertida mediante el agregado de agentes reductores. Teniendo en
cuenta esta última observación se decidió determinar si la presencia del DTT podía afectar a largo plazo
la actividad de la enzima recombinante. Para ello, se incubó la proteína purificada por IMAC durante
100 min a 4 °C en presencia de distintas concentraciones de DTT (s/DTT, 1, 5, 25 y 62.5 mM), y se
determinó su actividad enzimática a distintos intervalos de tiempo. Tal como se observa en la Fig.7 A, las
muestras incubadas en presencia de 1 y 5 mM DTT presentaron una actividad levemente superior a la
del control a lo largo del todo el experimento. Tal como se discutió con anterioridad, en este caso el
DTT estaría previniendo e incluso revirtiendo la oxidación de la proteína causada por la purificación de
la misma a través de columnas de Ni2+. Por su parte las muestras conteniendo 25 y 62.5 mM DTT
Resultados G6PDH - 55
presentaron inicialmente actividades superiores al control observándose luego una disminución en su
actividad enzimática a partir de los 25 min. De esta manera, la actividad de las muestras conteniendo 25
y 62.5 mM DTT fue 0.75 y 0.48 veces la del control (respectivamente) al final del experimento. Dicha
inactivación, a pesar de ser pronunciada dista mucho de asemejarse a la registrada para la G6PDH
nativa, ya que, tal como se mencionó con anterioridad dicha enzima mostró un 50 y 85 % de inactivación
con una incubación de tan sólo 10 min en presencia de 5 y 62.5 mM DTT respectivamente. Estos
resultados indican que la G6PDHcorta recombinante difiere de la G6PDH nativa presente en los extractos
totales de T. cruzi. Debido a que existirían varias isoformas correspondientes a la misma, cabe la
posibilidad de que la proteína expresada sea un componente minoritario en los extractos totales de T.
cruzi contribuyendo muy poco a la actividad total correspondiente a la enzima. Sin embargo, aunque
dicha suposición fuese cierta, sería bastante difícil poder explicar las diferencias en la respuesta a las
distintas concentraciones del agente reductor ya que entre los distintos genes completos identificados no
existen residuos de cisteína diferenciales que puedan explicar dicho comportamiento (todas las secuencias
aminoacídicas deducidas a partir de los genes de la G6PDH de T. cruzi desde el segundo codón de
iniciación poseen 8 residuos de cisteína, 6 de los cuales se encuentran estrictamente conservados en su
homólogo de Leishmania y 5 en el de T. brucei (Fig.4). La otra posibilidad, y tal vez la más acertada,
sea considerar que la forma mayoritaria de la G6PDH presente en los extractos totales de T. cruzi sea
la que denominamos larga (traducida a partir del primer codón del iniciación) ya que dentro de los 37
residuos de aminoácidos correspondientes a la extensión amino terminal de dicha proteína existen dos
residuos de cisteína en las posiciones 8 y 33 (presentes en todas las secuencias analizadas) que
potencialmente deban estar formando puentes disulfuro para mantener la actividad de la enzima (Fig.4).
Por su parte, las extensiones amino terminales correspondientes a la G6PDH de T. brucei y Leishmania,
no poseen residuos de cisteína (en buena concordancia con la ausencia de inhibición por agentes
reductores registrada para dichas enzimas). Ante esto decidimos analizar el efecto del DTT sobre la
G6PDHlarga purificada por columna de Ni2+. La enzima purificada fue incubada a 4 °C en presencia de
las mismas concentraciones del agente reductor ensayadas para la G6PDHcorta determinándose su actividad
enzimática a distintos intervalos de tiempo durante 85 min. De esta manera, la G6PDHlarga incubada en
presencia de 1 mM DTT, presentó a los 5 min de incubación una leve activación de tan sólo un 3 %
mientras que concentraciones mayores del agente reductor produjeron en cambio una marcada pérdida
de actividad enzimática en el mismo intervalo de tiempo obteniéndose inactivaciónes del 14, 51 y 76 %
para las muestras incubadas en presencia de 5, 25 y 62.5 mM DTT respectivamente. (Fig.7 B). Al igual
que para la G6PDHcorta, la muestra incubada en presencia de 1 mM DTT presentó una mayor estabilidad
Resultados G6PDH - 56
que la enzima control (incubada en ausencia del agente reductor) ya que al final del experimento dicha
muestra poseía una una actividad 1.7 veces mayor que este último. Por su parte, las muestras incubadas
en presencia de concentraciones mayores del agente reductor presentaron una caída dramática de la
actividad enzimática en cortos intervalos de tiempo llegando a obtenerse niveles no-detectables de
actividad al final del experimento. El hecho de que la G6PDHlarga haya presentado un comportamiento
muy similar al de la G6PDH nativa de los distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi frente a la
presencia de agentes reductores, nos condujo a proponer que dicha proteína sería la que potencialmente
se está expresando, al menos de manera mayoritaria en el parásito.
A
1,2
(Act. control/Act. con DTT)
1,13
1,0
0,8
0,75
1 mM DTT
0,6
5 mM DTT
0,48
0,4
25 mM DTT
0,2
62.5 mM DTT
0,0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
(Act. control/Act. con DTT)
B
1,7
1,6
1,2
1 mM DTT
Serie2
0,8
Serie4
25 mM DTT
5 mM DTT
Serie3
Serie5
62.5 mM DTT
0,4
0,2
0,1
0,0
0
15
30
45
Tiempo (min)
60
75
Fig.7. Efecto del DTT sobre la
actividad
ambas
G6PDHs
recombinantes. Efecto de distintas
concentraciones de DTT, sobre la
actividad de la G6PDHcorta y G6PDHlargas
recombinante purificadas por IMAC.
Ambas proteínas purificadas se
incubaron en presencia de distintas
concentraciones de DTT (desde 0
hasta 62.5 mM) y su actividad
enzimática se determinó a lo largo del
tiempo. A) Gráfico correspondiente a
la G6PDH corta
y B) gráfico
correspondiente a la G6PDHlarga. En
ambos casos los datos se expresan
como actividad de la muestra sin DTT/
Act de la muestra con DTT.
Resultados G6PDH - 57
Determinación de los parámetros cinéticos de la G6PDHcorta y G6PDHlarga recombinantes.
De acuerdo con lo expuesto en párrafos anteriores, la G6PDHcorta y G6PDGlarga de T. cruzi presentaron
comportamientos diferenciales que se vieron reflejados no sólo en su respuesta a las distintas
concentraciones de DTT sino también a la marcada diferencia en sus actividades específicas (la
G6PDHlarga resultó ser 6 veces más activa que la isoforma corta). Ante esto decidimos llevar a cabo la
determinación de los parámetros cinéticos de ambas enzimas utilizando las proteínas recombinantes
purificadas por IMAC. La determinación del pH óptimo para la reacción catalizada por la G6PDHcorta
recombinante se realizó de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos. Así la
máxima actividad correspondiente a la enzima se registró a pH 7.5 (Fig.8), un valor marcadamente
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
pH
Fig.8. Determinación de pH óptimo de la G6PDHcorta recombinante.
diferente al informado para las G6PDHs de T. brucei y G6PDH humana que poseen un pH óptimo
alcalino: 9.
La determinación del Km aparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDHcorta se llevó a
cabo en presencia y ausencia de DTT para determinar si el agente reductor producía algún tipo de
modificación en los parámetros cinéticos de la enzima recombinante. Para estas determinaciones la
concentración final de DTT elegida fue 62.5 mM debido a que en dicha condición se observaba la
mayor activación de la enzima con una incubación de 10 min. Las medidas de actividad enzimática se
llevaron a cabo por fluorometría de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos. Estos
Resultados G6PDH - 58
estudios mostraron un incremento muy marcado en la velocidad máxima de reacción para las curvas
correspondientes a la proteína incubada en presencia de DTT con respecto a la Vmax de las curvas
[Enzima]/V (nmol-1.min. mg)
realizadas en ausencia del agente reductor. De esta manera, dicho incremento fue de 3.8 veces para
0,8
0,7
0,6
0,5
y = 10,367x + 0,108
R2 = 0,9977
sin DTT
Serie1
0,4
62.5 mM
Serie2
0,3
y = 2,1564x + 0,0282
R2 = 0,9958
DTT
0,2
0,1
0
-0,02
0
0,02
0,04
[Enzima]/V (nmol-1.min. mg)
1/G6P
-0,25
0,06
-1
1,2
1,0
0,8
sin DTT
Serie1
y = 1,0888x + 0,2015
R2 = 0,9892
0,6
62.5 mM y = 0,1365x + 0,0299
Serie2
0,4
DTT
R2 = 0,9927
0,2
0,0
-0,05
0,15
0,35
0,55
0,75
0,95
Fig.9. Determinación de Km aparente para sustrato y cofactor de la G6PDHcorta recombinante, en presencia y
ausencia de un agente reductor. Las muestran tratadas con el agente reductor fueron incubadas durante 10 min en
hielo en presencia de 62.5 mM DTT (concentración final) previamente a la determinación de actividad enzimática
Resultados G6PDH - 59
aquellas realizadas a [G6P] variable y de 6.9 veces para las realizadas a [NADP] variable. Esta divergencia
en el incremento de la Vmax en presencia de DTT puede deberse a que la determinación del Km
aparente para NADP se llevó a cabo con posterioridad a la determinación del Km aparente para G6P
por lo que al momento de llevar a cabo las mediciones a [NADP] variable la enzima había perdido parte
de su actividad (probablemente por oxidación), hecho que pudo ser revertido mediante el agregado de
un agente reductor. A pesar de dichas diferencias, el valor de Km aparente para NADP no se vió
significativamente afectado (5.4 µM y 4.6 µM para las muestras incubadas en ausencia y en presencia
de DTT respectivamente) mientras que el Km para G6P sufrió una cierta variación: 96 µM sin DTT y 76
µM con DTT (Fig.9). A su vez si se comparan dichos valores con los informados para la G6PDH de T.
brucei 138 µM, y 5.3 µM para G6P y NADP respectivamente [Heise y col; 1999] y la G6PDH
humana 100 µM y 10 µM para G6P y NADP respectivamente [Cohen y col; 1975] se observa que la
enzima de T. cruzi posee mayor afinidad por su sustrato que las antes mencionadas, siendo más
pronunciada la diferencia entre ambas enzimas parasitarias. Por su parte, los valores de Km aparente
para el NADP correspondientes a estas últimas son totalmente comparables entre si, mientras que existe
una pequeña diferencia entre la afinidad de éstas por el cofactor comparada con la enzima de humanos.
La determinación del Km aparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDHlarga recombinante
se llevó a cabo utilizando el mismo rango de sustratos que para la G6PDHcorta con la excepción de que
las determinaciones pudieron ser realizadas por espectrofotometría debido a la mayor actividad específica
de la muestra. Estos experimentos mostraron que dicha proteína posee menor afinidad tanto por su
sustrato como por su cofactor que la G6PDHcorta, siendo más marcada la diferencia para el primero
(Fig.10). De esta manera, mientras el Km para G6P correspondiente a la G6PDHcorta era 76 µM, para la
G6PDHlarga el valor obtenido fue 199 µM. Sin embargo, esta última proteína presentó una constante
catalítica (Kcat) 3 veces superior a la correspondiente a la G6PDHcorta, indicando que la enzima a pesar
de poseer menor afinidad por el sustrato lleva a cabo más rápidamente la reacción. Sin embargo al
comparar la eficiencia catalítica de ambas enzimas (Kcat/Km) se observó que ambos valores eran
idénticos para el caso de la G6P (debido a que el aumento en el valor de Km para dicho compuesto en
la G6PDHlarga balancea el aumento en su constante catalítica ). La eficiencia catalítica de la G6PDHlarga
con respecto al NADP es levemente superior a la determinada para la G6PDHcorta, debido a que no se
registraron cambios significativos en el valor de Km para el cofactor entre ambas enzimas. (Tabla .1).
Teniendo en cuenta las diferencias detectadas entre los valores de Km aparente para el sustrato
correspondiente a ambas isoformas de la enzima nos pareció importante llevar a cabo una estimación
del Km aparente para G6P en un extracto total de epimastigotes de T. cruzi para tratar de discernir cual
[Enzima] /V (umol- 1.min. mg)
Resultados G6PDH - 60
1,4
1,2
1
0,8
0,6
y = 30,327x + 0,1523
R2 = 0,9987
0,4
0,2
0
-0,005
[Enzima] /V (umol- 1 . min.mg)
-0,01
0
0,005
0,01
0,015
0,02
1/G6 P
-1
0,025
0,03
0,035
1,00
0,80
0,60
y = 1,4715x + 0,1687
R2 = 0,9867
0,40
0,20
0,00
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
-1
Fig.10. Determinación de Km aparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDHlarga.
de las dos isoformas se expresa de manera mayoritaria en el parásito. El extracto total utilizado para
estas determinaciones había sufrido dos procesos de congelación y descongelación por lo que la actividad
correspondiente a la 6PGDH era no detectable, la actividad correspondiente a la G6PDH, en cambio,
Resultados G6PDH - 61
Tabla.1
T. cruzi G6PDHcorta (+DTT)
T. cruzi G6PDHcorta (-DTT)
Km ap
G6P
NADP
96
5.4
Kcat
0.56
0.3
Kcat/Km
Km ap
Kcat Kcat/Km
T. brucei
T. cruzi G6PDHlarga (-DTT)
Km ap
Kcat
Kcat/Km
Km ap
Kcat
Kcat/Km
5.8.10 -3
76
2.15
0.03
199
7.1
0.036
138
-
-
0.08
4.6
2.03
0.44
8.7
6.4
0.74
5.3
-
-
no había se había modificado significativamente (en buena concordancia con las enzimas recombinantes
que resultaron no ser afectadas por sucesivos ciclos de congelamiento y descongelamiento). De esta
manera la determinación del Km ap para el sustrato se llevó a cabo por espectrofotometría utilizando el
mismo rango de concentraciones de sustrato utilizado para ambas enzimas recombinantes. Dicho análisis
mostró que los datos se ajustaban a una cinética de tipo Michaeliana , no observándose diferencias en
el tipo de curva con respecto a las enzimas recombinantes indicando que la actividad medida en extracto
total de epimastigotes correspondería a un único componente con un Km aparente para G6P de 288 µM
(Fig.11). Si bien este valor dista mucho de ser exacto debido a que las determinaciones fueron llevadas
a cabo en un extracto total de epimastigotes de T. cruzi, dicho valor se asemeja más al correspondiente
400
350
300
250
200
150
y = 16992x + 59,073
R2 = 0,997
100
50
0
-0,004
0,001
0,006
0,011
0,016
Fig.11. Determinación de Km aparente para G6P en extracto total de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.
Resultados G6PDH - 62
a la G6PDHlarga (199 µM) por lo que podríamos sugerir que esta isoforma es la que se expresa de forma
mayoritaria en el parásito.
Determinación de actividad de G6PDH en extractos totales de los distintos estadíos
del ciclo de vida de T. cruzi clon CL Brener.
La determinación de actividad enzimática correspondiente a la G6PDH en extractos totales de los
distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi clon CL Brener, reveló que las formas del parásito que
usualmente se encuentran sometidas a estrés oxidativo (tripomastigotes metacíclicos y amastigotes)
presentan elevada actividad de G6PDH (0.132µmol.min-1.mg proteína-1 para los primeros y 0.201
µmol.min-1.mg proteína-1 para los segundos), comparadas con la actividad correspondiente a la enzima
detectada en tripomastigotes de cultivo (0.058 µmol.min-1.mg proteína-1) y epimastigotes (0.015 µmol.min.mg proteína-1) (Fig.12 A). Para determinar si existía correlación entre la expresión de la G6PDH y la
1
actividad en los distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi, se llevó a cabo un experimento de
Western blot utilizando anticuerpos desarrollados en conejo contra la G6PDHcorta recombinante de
acuerdo al protocolo descripto en las sección Materiales y Métodos. Dicho ensayo mostró, en buena
correlación con las medidas de actividad enzimática, mayores niveles de expresión de G6PDH en los
estadíos de tripomastigote metacíclico y amastigote que se vieron reflejados con la detección de una
banda reactiva de 63 kDa y 58 kDa en los extractos totales correspondientes a dichos estadíos
respectivamente. Por su parte, los extractos totales de tripomastigotes de cultivo y epimastigotes,
mostraron menores niveles de expresión correspondientes a la enzima ya que la banda detectada (de 58
kDa en ambos casos) presentaba menor intensidad que las antes mencionadas.La presente en el extracto
total de epimastigotes resultó ser casi indetectable a pesar de haber sembrado 200 µg de proteína total,
(el doble que en los casos anteriores) Fig 12.B. Por último, a pesar de que la regulación en la expresión
de los genes de T. cruzi es esencialmente post-transcripcional, nos resultó interesante determinar si
existía algún tipo de correlación entre los niveles de ARNm correspondientes a la G6PDH en los distintos
estadíos del ciclo de vida de T. cruzi y los niveles de expresión de la enzima. Para ello, se llevó a cabo
un ensayo de Northern blot de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos. Los niveles de
ARNm detectados tuvieron buena correlación con los correspondientes a la proteína como así también
con las determinaciones de actividad enzimática debido a que la mayor cantidad de ARNm se detectó en
tripomastigotes metaciclícos y amastigotes. Las bandas detectadas presentaron un tamaño aproximado
Resultados G6PDH - 63
A
0,2000
0,1500
0,1000
C
1
0,0500
E
M
A
T
0,0000
E
M
A
T
B
2
R
E
M
A
T
kDa
Kb
76
66
2.5
2.0
1.5
45
Fig.12. Análisis de la expresión de G6PDH de T. cruzi a lo largo de los distintos estadíos del ciclo de vida
del parásito. A) Actividad específica de G6PDH correspondiente a los distintos estadíos del ciclo de vida de
T. cruzi E: epimastigotes, M: tripomastigotes metacíclicos, A: amastigotes, T: tripomastigotes de cultivo. B)
Western blot correspondiente a la G6PDH de T. cruzi: R G6PDHcorta recombinante, 0.5 µg; E: epimastigotes,
200 µg de proteína total; M: tripomastigotes metacíclicos 100 µg de proteína total; A: amastigotes, 100 µg de
proteína total, T: tripomastigotes de cultivo 100 µg de proteína total. El primer anticuerpo (anti G6PDH
purificado) fue utilizado en una dilución 1/100, mientras que el segundo anticuerpo (anti-conejo-peroxidasa)
se utilizó en dilución 1/10.000. C) Northern blot correspondiente a la G6PDH de los distintos estadíos de T.
cruzi. 1) Autorradiografía del Northern blot. El ARNm correspondiente a la G6PDH se detectó utilizando como
sonda el gen correspondiente a la G6PDHcorta marcado con P32, E: epimastigotes 12 µg ARN total, M:
tripomastigotes metacíclicos, 12 µg ARN total; A:amastigotes, 10 µg ARN total; T: tripomastigotes de cultivo;
10 µg ARN total. 2) Membrana teñida con azul de metileno correspondiente a la autorradiografía que se
muestra en el panel 1. En dicha membrana pueden distinguirse las bandas correspondientes a los ARNr de T.
cruzi.
de 2.6 Kpb, indicando que los mismos poseían una región no codificante del 3‘ de aproximadamente
670pb (Fig.12 C).
Resultados G6PDH - 64
Localización subcelular de la G6PDH en los distintos estadíos del ciclo de vida de T.
cruzi.
A
1
K
2
3
2
3
2
3
2
3
N
B
1
C
1
N
K
D
1
*
*
Fig.13. Inmunofluorescencias indirectas correspondientes a la G6PDH en epimastigotes y tripomastigotes
metacíclicos de T. cruzi. Como primer anticuerpo se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado desarrollado en conejo
en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000 (verde). El núcleo y kinetoplasto
fueron teñidos con DAPI (azul). A y B imágenes correspondientes a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. B y C
imágenes correspondientes a tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi clon CL Brener. En todos los casos el Panel 1
presenta la señal correspondiente a la G6PDH, el panel 2 presenta la ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K)
dentro de la célula y el panel 3 corresponde a la superposición las imágenes anteriores. Con una flecha se señala el
compartimiento de mayor intensidad de fluorescencia detectado en la zona anterior del parásito en epimastigotes y
entre núcleo y kinetoplasto en tripomastigotes metacíclicos. En estos últimos se encuentran también señalados con
asteriscos algunos gránulos de mayor tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas.
Resultados G6PDH - 65
La localización subcelular de la G6PDH de T. cruzi se llevó a cabo por inmunofluorescencia indirecta,
de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos utilizando los anticuerpos antiG6PDHcorta purificados desarrollados en conejo. El patrón observado en epimastigotes del clon CL
Brener, mostró que la G6PDH se encuentra distribuída de manera homogénea en el citoplasma celular,
sin embargo también se observó una señal de mayor intensidad que frecuentemente se presentaba como
un anillo o un bastón (dependiendo de la posición del parásito) ubicado hacia uno de los lados entre el
núcleo y el kinetoplasto (Fig.13 A y B). Los tripomastigotes metacíclicos presentaron un patrón similar
al observado en epimastigotes (aunque algo más particulado), con la excepción de que en este caso, la
señal más intensa observada anteriormente como un anillo, se detectó como una estructura redondeada,
algo más pequeña que la anterior, ubicado entre núcleo y kinetoplasto (Fig.13 C y D).
Con respecto a los amastigotes y tripomastigotes de cultivo, la señal correspondiente a la G6PDH se
detectó esencialmente en el citoplasma de parásito y pudieron observarse algunos gránulos de mayor
tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas (Fig14 A y B). Sin embargo, debido a que los
anticuerpos primarios anti-G6PDH fueron desarrollados en conejo no nos fue posible llevar a cabo
estudios de co-localización con anticuerpos anti PPDK (piruvato fosfato di-kinasa), enzima marcadora
de glicosoma, ya que éstos últimos fueron desarrollados tambien en el mismo animal. Por otro lado,
teniendo en cuenta el patrón observado correspondiente a la enzima en epimastigotes y tripomastigotes
metacíclicos, nos pareció interesante identificar la naturaleza de dicho compartimiento celular inmunoreactivo. De acuerdo a la posición del mismo (entre el núcleo y kinetoplasto) existían diversas posibilidades
en cuanto a su identidad ya que en dicha región de la célula se encuentran varias organelas dentro de las
cuales se incluye el aparato de Golgi (con la mayor parte de las vesículas endocíticas), elementos del
citoesqueleto como ser el cuerpo basal (en la base del flagelo) y el bolsillo flagelar (Field y col; 2000).
De esta manera, inicialmente decidimos llevar a cabo estudios de co-localización de la G6PDH de T.
cruzi, con Concanavalina-A-conjugada a tetrametil rodamina. Este compuesto es utilizado en
tripanosomátidos para la marcación de bolsillo flagelar. Tal como se mencionó en la Introducción dicho
compartimiento es una invaginación de la membrana plasmática ubicada en la base del flagelo que posee
la característica de ser la única zona de la membrana parasitaria a través de la cual se llevan a cabo los
procesos de endo- y exocitosis. De esta manera, la Concanavalina A se une a la superficie del bolsillo
flagelar y es endocitada permitiendo así su marcación específica. El punto más importante de dicha
marcación tiene que ver con el tiempo de incubación de los parásitos con la lectina, ya que con intervalos
de incubación cortos (de tan sólo 15 seg) se consigue marcar esencialmente el bolsillo flagelar, mientras
Resultados G6PDH - 66
A
1
*
2
3
2
3
K
*
N
B
1
K
*
*
*
N
Fig. 14. Inmunofluorescencias indirectas correspondientes a la G6PDH en amastigotes y
tripomastigotes de cultivo de T. cruzi. Como primer anticuerpo se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado
desarrollado en conejo en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000
(verde). El núcleo y kinetoplasto fueron teñidos con DAPI (azul). A- imagen correspondiente a un amastigote
de T. cruzi clon CL Brener. B imagen correspondiente a un tripomastigote de cultivo de T. cruzi clon CL
Brener. En ambos casos el Panel 1 presenta la señal correspondiente a la G6PDH, el panel 2 presenta la
ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K) dentro de la célula y el panel 3 corresponde a la superposición
las imágenes anteriores. Los gránulos de mayor tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas se
encuentran señalados con un asterisco.
que con tiempos de incubación más prolongados (de 2 a 5 min), comienza a detectarse la lectina en
pequeñas vesículas endocíticas (Jeffries y col; 2001). Dicho experimento, llevado a cabo tal como se
describe en la sección Materiales y Métodos mostró que la estructura correspondiente a la G6PDH de
T. cruzi no co-localiza con el bolsillo flagelar ya que la señal correspondiente al mismo (rojo) se observó
como una pequeña estructura en la parte anterior del parásito perpendicular al kinetoplasto, mientras
que la señal correspondiente a la G6PDH (verde) se observó lateralmente a la misma (Fig.15 A). Este
ensayo nos permitió también tener un nuevo punto de referencia para llevar a cabo la ubicación espacial
de la señal correspondiente a la G6PDH dentro del parásito, ya que a partir de este experimento
pudimos situar dicha señal no sólo con respecto al núcleo y kinetoplasto sino también con respecto al
bolsillo flagelar. A partir de esta observación y mediante comparación con fotografías de microscopía
electrónica de transmisión de T. cruzi (Fig.15 B), llegamos a la conclusión de que la localización más
probable de la G6PDH en epimastigotes y potencialmente en tripomastigotes metacíclicos era el aparato
de Golgi. Ante esto, y para confirmar dicha hipótesis, decidimos llevar a cabo experimentos de co-
Resultados G6PDH - 67
A
1
2
3
2
3
K
N
B
1
N
K
C
R
N
R
K
F
Fig.15. Estudio de co-localización de la señal correspondiente a la G6PDH con Concanavalina A-tetrametil
rodamina (marcador del bolsillo flagelar) en epimastigotes de T. cruzi. A y B inmunofluorescencias indirectas
correspondientes a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. Para detectar la G6PDH se utilizó anti G6PDH de T. cruzi
purificado desarrollado en conejo en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000
(verde). La marcación del bolsillo flagelar se llevó a cabo incubando los parásitos con Concanavalina A-tetrametil
rodamina (rojo) tal como se describe en la sección Materiales y Métodos, el núcleo y kinetoplasto fueron teñidos
con DAPI (azul). Panel 1-imagen correspondiente a la G6PDH de T. cruzi, panel 2- señal correspondiente al bolsillo
flagelar (rojo) con respecto a la ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K), panel 3 superposición de las imágenes
anteriores. C- microscopia electrónica de transmisión de un epimastigotes de T. cruzi donde se muestra la localización
de las distintas organelas. En la región anterior del parásito se encuentra el bolsillo flagelar (*) desde donde surge
el flagelo (F), el kinetoplasto (K) que es una zona especializada de la mitocondria (estrella) donde se encuentra
ubicado el ADN mitocondrial y el aparato de Golgi (flecha) presentando de 4 a 8 cisternas. El núcleo (N) es redondeado
y se ubica en el centro de la célula y en la parte posterior de la misma puede distinguirse los reservosomas (R).
Fuente: [Souto-Padrón y col; 2004].
Resultados G6PDH - 68
localización de la señal correspondiente a la G6PDH de T. cruzi con aquella perteneciente a BODIPYC5 -ceramida complejada con BSA y conjugada con Texas-red. La utilización de este compuesto es un
método no inmunológico utilizado frecuentemente para marcar el complejo de Golgi de tripanosomátidos
y otros tipos celulares ya que dicha ceramida se acumula en esta organela después de haber sido
internalizada por las células in vivo. En dichos experimentos pudimos detectar la señal correspondiente
al aparato de Golgi como una estructura redondeada en la parte anterior del parásito ubicada hacia uno
de los lados entre el núcleo y el kinetoplasto (Fig.16 A1 y B1). La señal correspondiente a la G6PDH
mostró el mismo patrón observado anteriormente (Fig.16 A2 y B2), y al superponer ambas imágenes
pudimos corroborar la co-localización de ambas (Fig.16 A3 y B3). Si bien la inmunofluorescencia
indirecta no es un criterio absoluto para la determinación de la localización subcelular de una proteína, el
hecho de haber obtenido co-localización entre la señal correspondiente al marcador de Golgi y aquella
perteneciente a la G6PDH, nos permite inferir con bastante seguridad que una fracción de la G6PDH de
A
1
2
3
2
3
N
K
B
1
N
K
Fig.16. Estudio de co-localización de la señal correspondiente a la G6PDH con BODIPY®TR C5-ceramida
complejada con BSA (marcador de aparato de Golgi) en epimastigotes de T. cruzi. A y B
inmunofluorescencias indirectas correspondientes a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. Para detectar
la G6PDH se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado desarrollado en conejo en dilución 1/50 y como
segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000 (verde). La marcación del aparato de Golgi se llevó
a cabo mediante la incubación de los parásitos con BODIPY®TR C5-ceramida complejada con BSA (rojo) tal
como se describe en la sección Materiales y Métodos, el núcleo y kinetoplasto fueron teñidos con DAPI
(azul). Panel 1-imagen correspondiente a la G6PDH de T. cruzi, panel 2- señal correspondiente al aparato de
Golgi (rojo) con respecto a la ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K), panel 3 superposición de las
imágenes anteriores. La zona donde co-localiza la señal correspondiente a la G6PDH (verde) con aquella
perteneciente al aparato de Golgi (rojo), se observa en amarillo.
Resultados G6PDH - 69
epimastigotes, y potencialmente de tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi se encontraría presente en
dicha organela.
Si bien los anticuerpos utilizados para llevar a cabo estos estudios habían sido purificados por cromatografía
de afinidad resultando ser altamente específicos, el hecho de haber detectado a la proteína en una
localización no demasiado común para una G6PDH (solamente sugerida anteriormente para una isoforma
de G6PDH presente en células de intestino de conejo) [Ishibashi y col; 1999], creímos necesario
corroborar dicha localización mediante otro método. De acuerdo con esto decidimos construir la fusión
G6PDHcorta-Green Fluorescent Protein (pTEX-G6PDHcorta-GFP) para transfectar parásitos y analizar
así la localización de la proteína. Para llevar a cabo dicho experimento la G6PDHcorta clonada en pGEMT Easy, se utilizó como molde para amplificar nuevamente el gen correspondiente a la enzima pero esta
vez utilizando un par de oligonucleótidos que contenían los sitios BamHI (subrayado) en el sentido, Prs: 5’-CGGGATCCATGGAGAACGCCAAAAAG-3´ y SmaI (subrayado) en el anti-sentido, Pr-as:
5‘-TCCCCCGGGCAAATATTCACATAA). Este ultimo se diseñó en base a la secuencia flanqueante
al codón de terminación el cual no se incluyó en dicho oligonucleótido para permitir la expresión de la
G6PDHcorta como una fusión a GFP. De esta manera el gen correspondiente a la enzima se clonó en el
vector pTEX-GFP previamente digerido con las enzimas de restricción antes mencionadas quedando la
GFP fusionada al extremo carboxilo terminal de la G6PDHcorta. El plásmido así generado pTEX-G6PDHcorta
-GFP como así también el pTEX-GFP utilizado como control se purificaron tal como se describe en la
sección Materiales y Métodos y fueron utilizados para transfectar epimastigotes de T. cruzi clon CL
Brener de acuerdo al protocolo descripto en la misma sección de este trabajo de Tesis. De esta manera,
a partir de las tres semanas de realizada la transfección comenzaron a detectarse parásitos verdes
(observados por microscopio de fluorescencia) por lo que se continuó la selección de los mismos
durante una semana más y luego se llevaron a cabo los experimentos de co-localización de las señales
correspondientes a la fusión G6PDH-GFP y GFP con aquella correspondiente al aparato de Golgi
marcado con BODIPY®TR C5-ceramida complejada con BSA tal como se describe en la sección
Materiales y Métodos. Dichas inmunofluorescencias mostraron que la señal correspondiente a los
parásitos controles (transfectados con pTEX-GPF) se encontraba distribuida a lo largo del todo el
cuerpo del parásito detectándose una zona de mayor intensidad de fluorescencia sobre el núcleo
celular y al rededor del kinetoplasto. Dicha señal no-colocalizó de manera alguna con la correspondiente
al aparto de Golgi que se visualizó (como en casos anteriores) como un punto ubicado lateralmente el
núcleo y kinetoplasto Fig.17 A. La señal correspondiente a los parásitos transfectados con pTEXG6PDH-GFP, se distribuyó también de manera homogénea a lo largo de todo el cuerpo del parásito,
Resultados G6PDH - 70
A
1
2
3
K
N
4
B
1
2
3
K
N
4
C
kDa
66
45
1
2
Fig.17. Estudio de localización de la G6PDH corta fusionada a GFP. A) Microscopia de
fluorescencia correspondiente a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener transfectados con
A) pTEX-GFP, B) pTEX-G6PDH corta-GFP. En ambos casos el núcleo y kinetoplasto fueron
teñidos con DAPI y el aparato de Golgi se marcó de acuerdo al protocolo descripto en
Materiales y Métodos. Panel 1- señal correspondiente a la GFP (A1) o G6PDHcorta-GFP (B1),
panel 2: superposición de las señales anteriores con aquellas correspondientes a núcleo y
kinetoplasto, panel 3: ubicación de la señal correspondiente al aparato de Golgi con respecto
al núcleo y kinetoplasto, panel 4: superposición de las imágenes anteriores. En el caso de los
parásitos transfectados con pTEX-G6PDH-GFP, la zona de co-localización entre la señal
correspondiente a la G6PDH corta-GFP (verde) y aquella correspondiente al aparato de Golgi
(rojo) se observa amarilla. C) Western blot correspondiente a la G6PDH de T. cruzi llevado a
cabo en extractos totales libres de células (150 µg de proteína total) de: línea 1- epimastigotes
de T. cruzi transfectados con pTEX-GFP y línea 2- epimastigotes de T. cruzi transfectados
con pTEX-G6PDH-GFP. En ambos casos se observa la banda de 58 kDa correspondiente a la
proteína nativa y en línea 2 se detectó también una banda de aproximadamente 81 kDa de
mayor intesidad correspondiente a la fusión G6PDH corta-GFP. Como primer anticuerpo se
utilizó anti-G6PDH de conejo purificado 1/100, como 2do anticuerpo anti rabbit-peroxidasa y
se reveló por quimioluminiscencia
Resultados G6PDH - 71
con la excepción de una zona bastante delimitada en la parte anterior del mismo que presentó mayor
intensidad de fluorescencia. Dicha señal se asemejaba bastante en cuanto a su ubicación a la detectada
para la G6PDH por inmunofluorescencia indirecta, sin embargo en este caso dicha señal era algo más
difusa (probablemente debido a la sobre-expresión de la enzima). Al superponer dicha señal con la
correspondiente al aparato de Golgi se observó que ambas co-localizaban aunque la perteneciente a la
G6PDH-GFP presentaba un patrón algo más extendido y difuso (Fig.17 B). Para confirmar que dicha
señal correspondía ciertamente a la fusión G6PDHcorta-GFP, se llevó a cabo un experimento de Western
blot (utilizando el anticuerpo anti-G6PDH purificado) en el cual se analizaron extractos totales de
epimastigotes controles (transfectados con pTEX-GFP) así como también de epimastigotes transfectados
con la fusión pTEX-G6PDH-GFP. En ambos casos se detectó la señal correspondiente a la G6PDH
nativa de 58 kDa, y en este último también se observó una banda reactiva de 81 kDa de mayor intensidad
correspondiente a la fusión G6PDHcorta-GFP (Fig.17.C). Ante esto, y de acuerdo con este nuevo
experimento, pudimos confirmar que la señal observada en las inmunofluorescencias indirectas
correspondía ciertamente a la G6PDH de T. cruzi.
Análisis de la expresión de la G6PDH frente a estrés oxidativo en epimastigotes y
tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.
El rol de la G6PDH en la defensa contra el estrés oxidativo es un hecho bien estudiado en eritrocitos
humanos. En estas células (que poseen una escasa maquinaria metabólica y en las cuales la expresión
génica no puede ser regulada a causa de la falta de núcleo) la G6PDH representa la única fuente de
NADPH. Esto conduce a que una producción disminuida del mismo, causada por alteraciones en dicha
enzima afecte directamente la producción de glutatión reducido (GSH), convirtiendo a la célula en más
susceptible al estrés oxidativo y a sufrir lisis. En células nucleadas donde existen otras vías metabólicas
además de la vía de las pentosas fosfato para la producción de NADPH se ha demostrado también,
mediante análisis mutacionales, la importancia de la G6PDH en la detoxificación de ROS. Así mutantes
nulas para G6PDH de Saccharomyces cerevisiae y células embrionarias de ratón presentaron una
marcada sensibilidad a la presencia de agentes oxidantes [Nogae y col; 1990] [Pandolfi y col; 1995].
Se ha determinado también en E. coli que el gen correspondiente a la G6PDH forma parte de un
regulón que se activa en respuesta al estrés oxidativo [Storz y col; 1990]. A su vez, en líneas celulares
humanas originadas a partir de distintos tejidos se demostró un aumento transiente en la actividad
Resultados G6PDH - 72
específica de la G6PDH (de 2.6 veces) como así también en los niveles de ARNm luego de que dichas
células eran expuestas a 200 µM de H2O2 (concentración que no reducía la viabilidad celular) o a 500
µM diamida (compuesto que produce disminución en los niveles de GSH intracelular) [Ursini y col;
1997]. A partir de estos experimentos dichos autores sugirieron que el gen correspondiente a la G6PDH
estaría sujeto a inducción (en condiciones de estrés) aunque también se determinó que en dichas
condiciones moléculas de enzima pre-existentes en forma inactiva podían sufrir activación por la
disminución en la relación NADPH/NADP (factor de regulación de la enzima).
Mediante la incubación de epimastigotes de T. cruzi clon CL. Brener en presencia de azul de metileno
(agente que produce la oxidación del NADPH), Maugeri y Cazzulo [2004] demostraron un aumento en
la actividad de la vía de las pentosas fosfato (determinada por medio del análisis del flujo de glucosa a
través de la rama oxidativa de la vía) con respecto a la correspondiente a parásitos incubados en
ausencia de dicho compuesto, indicando que la actividad de G6PDH en el parásito (al igual que el resto
de las G6PDHs) se encuentra sujeta a regulación por parte de la relación NADPH/NADP. Ante esto
nos pareció relevante determinar si la expresión de dicha enzima podía ser inducida en condiciones de
estrés oxidativo (tal como se describió para su homólogo de humanos, ratones y E. coli). De esta
manera y utilizando como modelo de estrés oxidativo la incubación de los parásitos en presencia de
H2O2, decidimos llevar a cabo dichos experimentos con epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. Tal
como se menciona en la sección Materiales y Métodos las incubaciones se llevaron a cabo en solución
amortiguadora IB [Carnieri y col; 1993] debido a la imposibilidad de utilizar los medios de cultivos
convencionales ya que sus distintos componentes pueden reaccionar con el H2O2 disminuyendo su
concentración en la solución. Así inicialmente se puso a punto la concentración de H2O2 a utilizar mediante
la incubación de los parásitos (en placas multi-well) lavados y resuspendidos en solución amortiguadora
IB a razón de 107 células/ml, en presencia de distintas concentraciones de H2O2 (20 µM a 4 mM). El
efecto de las mismas se analizó mediante la observación al microscopio teniendo en cuenta los patrones
descriptos por Das y col [2001] para Leishmanias incubadas en presencia de distintas concentraciones
de peróxido de hidrógeno. Estos autores describieron que concentraciones altas de dicho compuesto
desencadenaban un proceso de muerte similar a la apoptosis que comenzaba con la pérdida de motilidad
de los parásitos y que finalizaba con la muerte celular tomando los mismos forma redondeada (similar a
la de los amastigotes) pero con el flagelo extendido. Ante esto, y debido a que nuestra intención era
seleccionar una condición de estrés oxidativo que conservase la viabilidad celular decidimos seleccionar
la concentración de H2O2 para la cual la motilidad de los parásitos no se viese significativamente afectada.
De esta manera, los parásitos expuestos a concentraciones superiores a 100 µM presentaron una pérdida
Resultados G6PDH - 73
marcada de la motilidad en cortos intervalos de tiempo para posteriormente tomar la forma redondeada
característica de los parásitos muertos (el porcentaje de células afectadas aumentaba conforme se
aumentaba la concentración del agente oxidante). Aquellos incubados en presencia de 100 µM H2O2 se
mantuvieron sin alteraciones durante los primeros 40 min de incubación pero fueron gradualmente
afectados por el agente oxidante obteniéndose luego de 6 hs de incubación sólo un 50 % de parásitos
viables. Por su parte aquellos incubados en presencia de 20 µM H2O2 no sufrieron alteración alguna en
las 6 hs de incubación del experimento. De acuerdo con esto, esta última concentración fue la seleccionada
inicialmente para llevar a cabo los experimentos de estrés oxidativo. Dicho ensayo se realizó tal como
se describe en la sección Materiales y Métodos. Las muestras para la determinación de la actividad
correspondiente a la G6PDH se tomaron cada 15 min durante 90 min. Dichas medidas en lugar de
mostrar un incremento en la actividad específica de la enzima mostraron una marcada disminución de la
misma obteniéndose sólo un 30 % de la actividad inicial a los 90 min de incubación. De manera coincidente
con las medidas de actividad, el ensayo de western blot realizado para analizar la expresión de la enzima
en los extractos totales correspondientes a los distintos tiempos de incubación mostró una disminución
en la intensidad de la banda correspondiente a enzima conforme se aumentaba el tiempo de incubación
de los parásitos en presencia de H2O2 , llegando a hacerse indetectable a los 90 min. A partir de dicho
experimento pudimos determinar entonces que en epimastigotes la expresión de G6PDH no es inducida
en condiciones de estrés oxidativo, por lo que probablemente en esta forma del parásito la única respuesta
al mismo que involucre a la enzima sea su activación ante la disminución de la relación NADPH/NADP.
De acuerdo con estos resultados, y teniendo en cuenta que las formas biológicas del parásito mayormente
expuestas in vivo al estrés oxidativo son los tripomastigotes metacíclicos y los amastigotes, y debido a
que en dichos estadíos se detectaron mayores niveles basales de expresión de la enzima que en
epimastigotes, decidimos llevar a cabo los experimentos de estrés con H2O2 en tripomastigotes
metacíclicos. Debido a que estos últimos resultaron ser menos afectados por el agente oxidante que los
epimastigotes (la pérdida de motilidad de los mismos se detectó a concentraciones mayores de H2O2)
resultó necesario poner a punto la concentración a ser utilizada en los experimentos subsiguientes. De
acuerdo con esto, se incubaron los parásitos en solución amortiguadora IB a la cual se le adicionó 0, 20,
40, 60 y 80 µM del agente oxidante y se incubó las muestras durante 7 hs a temperatura ambiente luego
de lo cual los parásitos se centrifugaron y se resuspendieron en Tris HCl 50 mM pH 7.6 ,1mM EDTA,
100 µM E64, 0.5 mM TLCK y se llevó a cabo la determinación de actividad de G6PDH. Este análisis
mostró un aumento en la actividad específica de la misma a partir de 40 µM de H2O2. Así a dicha
Resultados G6PDH - 74
concentración se registró un aumento del 29 % en la actividad de la enzima con respecto al control
mientras que la incubación de los parásitos en presencia de 60 y 80 µM H2O2 condujo a un aumento del
86 y 89 % respectivamente (en dichas condiciones no se observó efecto alguno sobre la motilidad de
los parásitos). De acuerdo con lo antes expuesto, la G6PDH presente en metacíclicos parecía inducirse
en respuesta al estrés oxidativo, por lo que para determinar si dicho aumento se debía a un incremento
en la expresión de la proteína y si era posible observar dicho efecto a tiempos de incubación menores a
las 7 hs se llevó a cabo un nuevo experimento de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales
y Métodos. En el mismo los parásitos se incubaron en presencia de 70 µM H2O2 y se tomaron muestras
a T0 (antes del agregado de H2O2) como así también a las 4, 5 y 6 hs después del mismo. Tal como se
observa en la Fig.18. A las medidas de actividad enzimática (expresadas como veces de inducción en
presencia de H2O2 con respecto al control) mostraron un marcado aumento en la actividad específica de
la enzima observándose incrementos de 31, 42 y 46 veces en su actividad a las 4, 5 y 6 hs de incubación
en presencia del agente oxidante respectivamente. Para determinar si dicho aumento en la actividad
específica se debía ciertamente a una inducción en la expresión de la enzima se llevó a cabo un ensayo
de western blot donde se sembraron extractos totales de tripomastigotes metacíclicos correspondientes
a los distintos tiempos de incubación. En dicho experimento se utilizaron nuevamente los anticuerpos
anti-G6PDH purificados en dilución 1/100. Para confirmar que todas las calles tuviesen la misma
cantidad de proteína total, una vez revelada la membrana para la G6PDH se realizó el stripping de la
misma y se la incubó en presencia de anti α tubulina (Sigma) en dilución 1/1000. Dicho experimento
mostró un aumento significativo en los niveles de G6PDH correspondiente a los 3 tiempos de incubación
en presencia de H2O2 con respecto al control (T0) donde se observó tan sólo una banda muy tenue
correspondiente a la enzima. Para descartar que la inducción en la expresión de la G6PDH pudiese ser
causada por alguno de los componentes de la solución amortiguadora IB en lugar de ser una respuesta
el estrés oxidativo, llevamos a cabo un experimento control en el cual los parásitos fueron incubados en
dicha solución amortiguadora sin el agregado de H2O2 durante 6 hs. En dicho ensayo se tomaron
alícuotas del cultivo a T0, 4, 5 y 6 hs después de la resuspensión de los mismos en dicha solución
amortiguadora. En este caso las medidas de actividad específica correspondientes a la enzima se
mantuvieron constantes a lo largo de todo el experimento, descartándose así que la inducción observada
anteriormente para la G6PDH de T. cruzi fuese causada por la propia solución amortiguadora. Por
último y con la intención de determinar si el aumento en la expresión de la G6PDH conducía a algún
cambio en el patrón en las inmuno fluorescencias indirectas correspondientes a la enzima, decidimos
llevar a cabo estas últimas para cada uno de los tiempos de incubación analizados. En dichas
Resultados G6PDH - 75
G6PDH (veces de inducción)
A
Tiempo (hs)
B
TO
1
4
5
6
Tc- G6PDH
2
Tiempo (hs)
C
TO
4
5
6
Fig.18. Análisis de la inducción en la expresión de la G6PDH en tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi por
estrés oxidativo generado por H2O2. En este experimento los parásitos fueron incubados en solución
amortiguadora IB en presencia de 70 µM H2O2 y se tomaron muestras a las 4, 5 y 6 hs posteriores al agregado del
agente oxidante. La muestra inicial (sin H2O2) se denominó T0. A) medidas de actividad correspondientes a la
G6PDH de T. cruzi expresadas como veces de inducción en la actividad específica de las muestras incubadas en
presencia de H2O2 con respecto a la actividad específica del control. B) Western blot correspondiente a extractos
totales libres de células (30µg de proteína total por calle) correspondiente a los distintos tiempos de incubación
antes mencionados. 1- señal correspondiente a la G6PDH de T. cruzi. Como primer anticuerpo se utilizó antiG6PDH de conejo purificado 1/100. 2- señal correspondiente a α-tubulina. Como primer anticuerpo se utilizó anti
α tubulina policlonal de conejo 1/1000 (Sigma). En ambos casos como 2do anticuerpo se utilizó anti rabbitperoxidasa y se reveló por quimioluminiscencia. C) Inmuno fluorescencias indirectas correspondientes a cada
uno de los tiempos de incubación. Para detectar la G6PDH se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado desarrollado
en conejo en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000 (verde). El núcleo y
kineoplasto se tiñeron con DAPI.
Resultados G6PDH - 76
inmunofluorescencias realizadas de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos
se observó un aumento paulatino en la intensidad de fluorescencia conforme se incrementaba el tiempo
de incubación con el agente oxidante. Dicho aumento se observó esencialmente en el citosol del parásito
sin embargo también se detectó un cierto aumento en la intensidad de fluorescencia correspondiente a
aquellos gránulos de mayor tamaño que con anterioridad propusimos como glicosomas como así también
un leve aumento en la señal correspondiente a la estructura que en epimastigotes identificamos como
aparato de Golgi (Fig.18 C).
Discusión G6PDH - 77
Discusión.
Con respecto al análisis genético de la G6PDH de T. cruzi, podemos concluir que la enzima, a diferencia
de lo que ocurre con su homólogo de T. brucei, se encuentra codificada por más de un gen, ya que se
detectaron tres secuencias correspondientes a genes completos y potencialmente funcionales y dos
correspondientes a pseudo genes (inactivos). Determinamos también que dichas secuencias se hallan
distribuídas en tres de los cromosomas del parásito. El análisis de las mismas obtenidas a partir de ADN
genómico, como así también a partir de ADNc (derivadas de los experimentos de 5´-RACE) nos
permitió determinar la presencia de dos posibles codones de iniciación de la traducción separados uno
de otro por 111pb y observados también en la G6PDH de T. brucei. Ambos marcos abiertos de
lectura codificaron para proteínas activas que pudieron se expresadas en E. coli como proteínas
recombinantes (con un tracto de 6 residuos de histidina en su extremo amino terminal) y purificadas por
columna de Ni2+. Los estudios de filtración en gel llevados a cabo con la G6PDHcorta de T. cruzi
demostraron que la forma activa de la enzima es un dímero en buena concordancia con otras G6PDHs,
aunque en algunas especies como en ratones y humanos la enzima se encuentra en un equilibrio rápido
entre dímero y tetrámero. Tal como se mencionó con anterioridad la enzima de Leuconostoc
mesenteroides es la única G6PDH que ha sido cristalizada hasta el momento por lo que ha sido utilizada
ampliamente para llevar a cabo el modelado molecular de sus homólogos de otros organismos. Dicha
proteína también es dimérica y si bien los monómeros poseen una estructura compacta, el dímero resultó
ser bastante extendido con una distancia de más de 100 Å entre la Arg46 (responsable de la unión del 2’
fosfato del NADP) de cada uno de sus monómeros. A partir de dicha estructura ha sido posible establecer
que sólo un 11 % de la superficie de los monómeros queda oculta en la interfase del dímero y que la
misma se encuentra formada por la asociación de hojas-β y helices-α pertenecientes al dominio Cterminal de la enzima.
Muchas de las características observadas para las G6PDH recombinantes de T. cruzi se asemejan a las
determinadas por Wenderoth y col [1997] para sus homólogos de plantas. Tal como se mencionó con
anterioridad, las actividades correspondientes a la G6PDHcorta y G6PDHlarga de T. cruzi resultaron ser
muy afectadas luego de su purificación por columna de Ni2+, hecho que se vió reflejado en la escasa
recuperación de actividad obtenida al final de la purificación (independientemente de la concentración
de imidazol utilizada para la elución). Un efecto similar, aunque más pronunciado se describió para la
Discusión G6PDH - 78
G6PDH de papa (tanto para la isoforma citosólica como la de cloroplastos) para las cuales se estableció
la imposibilidad de utilizar tanto columnas de Ni2+ como de Cu2+ para purificar dichas enzimas
recombinantes debido a la inactivación total de las mismas. Un análisis más detallado de esta inactivación
demostró que la actividad de la G6PDH era fuertemente afectada por la presencia de cationes divalentes
siendo el efecto inhibitorio más pronunciado para Zn2+ > Ni2+ > Co2+ > Cu2+ y que la actividad perdida
no podía ser recuperada mediante la incubación de la proteína en presencia de EDTA o mediante el
desalado de las muestras. Estas observaciones condujeron a postular que las G6PDH de plantas se
inactivarían en los primeros momentos de la purificación al ponerse en contacto las enzimas recombinantes
con la matriz de Ni2+[Wenderoh y col; 1997]. Este último postulado sería potencialmente extrapolable a
la enzima de T. cruzi, aunque no hemos llevado a cabo estudios de la actividad enzimática en presencia
de cationes divalentes como para poder atribuir a los mismos de forma fehaciente la inactivación de
ambas G6PDHs. Otra característica compartida entre la G6PDH nativa y G6PDHlarga recombinante de
T. cruzi con la isoforma de cloroplastos de plantas (sujeta a regulación redox) es su inactivación en
presencia de DTT. Esta enzima posee 6 residuos de cisteína que se encuentran ubicados dentro de una
secuencia de 100 residuos de aminoácidos de longitud situada en el extremo amino terminal de la
proteína, dos de los cuales están estrictamente conservados y han sido involucrados en dicha regulación
redox [Wenderoth y col; 1997]. De esta manera, la enzima es inactivada por reducción (en presencia
de luz) por el sistema ferredoxina/tiorredoxina para evitar interacciones fútiles con el ciclo de Calvin (la
simultánea síntesis de carbohidratos por parte del primero, y su catabolismo por parte de la vía de las
pentosas fosfato) durante la fotosíntesis. Esta inactivación ocurre a través de un intercambio reversible
entre la forma reducida (di-thiol), y oxidada (puente disulfuro) de los dos residuos de cisteína conservados
entre las isoformas plastídicas de distintas plantas superiores (ubicadas en un loop expuesto al solvente
en la estructura tridimensional de la enzima.). De esta manera, en tejidos autotróficos la G6PDH de
cloroplastos solamente es activa en la oscuridad mientras que la isoforma citosólica es insensible a la
presencia de agentes reductores. Estas diferencias condujeron a que el método utilizado de rutina para
distinguir ambas isoformas en extractos totales de plantas sea la determinación de actividad de G6PDH
en presencia y ausencia de DTT. Por su parte, la G6PDH sujeta a regulación redox de cianobacterias
posee un comportamiento similar a la de cloroplastos de plantas superiores ya que es regulada también
por la reducción y oxidación de un par de cisteínas, sin embargo se ha demostrado que no existe
conservación alguna entre la ubicación (dentro de la secuencia) de dichas cisteínas y aquellas propuestas
como regulatorias en su homólogo de cloroplastos.
Discusión G6PDH - 79
Ante lo expuesto, y habiendo determinado que la G6PDHlarga de T. cruzi es la isoforma sensible al DTT
y que los únicos residuos de cisteína diferenciales que posee con respecto a la G6PDHcorta son aquellos
presentes en la extensión amino terminal de la primera, llegamos a la conclusión de que dichas cisteínas
podrían estar formando un puente disulfuro que estabilice de alguna manera la estructura de la enzima
preservando su actividad. El hecho de que la G6PDHlarga de T. cruzi al igual que la enzima de T. brucei
y Leishmania, posean una inusual extensión N-terminal (que recuerda a aquella presente en las isoformas
de G6PDH de cloroplastos) sumado a la inhibición en presencia de DTT observada para la enzima de
T. cruzi, conduce nuevamente a la hipótesis del endosimbionte algal de los tripanosomátidos, a partir del
cual se piensa que hubo transferencia de genes cuyas características iniciales se fueron suavizando a
través de la evolución sin llegar a perderse completamente. Existen varias posibilidades con respecto a
cuál de las isoformas se expresa mayoritariamente en el parásito, si nos basamos en las medidas de
actividad enzimática llevadas a cabo en los extractos totales de los distintos estadíos de T. cruzi y su
respuesta al DTT podríamos concluir que, tal como se mencionó anteriormente, la enzima que se expresa
(al menos de manera mayoritaria) en el parásito es la G6PDHlarga. Este punto se ve reforzado por el
valor de Km aparente para G6P determinado en extractos totales de epimastigotes de T. cruzi que es del
orden del obtenido para dicha enzima. Sin embargo, el análisis del western blot llevado a cabo en
extractos totales correspondientes a las cuatro formas del parásito, mostró que la única banda detectada
en epimasigotes, tripomastigotes de cultivo y amastigotes poseía una masa molecular aparente de 58
kDa (peso molecular correspondiente a la G6PDHcorta) y que únicamente en tripomastigotes metacíclicos
se observaba una proteína de mayor peso molecular (62 kDa). Ante esto surgen varias opciones: 1) si
nos basamos estrictamente en el patrón obtenido en el ensayo de western blot podría decirse que la
G6PDHcorta se expresa en epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes de cultivo y que la forma larga
de la enzima se expresa únicamente en tripomastigotes metacílicos. Esta opción, sin embargo, es bastante
poco probable debido a que no puede ser correlacionada en absoluto con las medidas de actividad
enzimática mencionadas anteriormente. 2) otra hipótesis sería que ambas enzimas se estén expresando
en el parásito siendo mayoritaria la G6PDHcorta (detectada en los western blot) pero que debido a su
baja actividad específica contribuya muy poco a la actividad total de la enzima. En estas condiciones la
G6PDHlarga podría estar expresándose en menor proporción (siendo no detectable en los western blots)
pero contribuyendo a la actividad detectada en extractos totales (en este caso deberíamos considerar
que el desplazamiento hacia arriba de la banda reactiva observada en metacíclicos se deba a un artefacto
de la corrida). 3) Por último podemos proponer también que la enzima que se expresa mayoritariamente
es la G6PDHlarga que en geles de poliacrilamida corre con una masa molecular aparente menor a la
Discusión G6PDH - 80
calculada y nuevamente que el mayor peso molecular de la banda detectada en tripomastigotes
metacíclicos sea un artefacto de la técnica. Esta hipótesis se ve reforzada por el hecho de que tanto la
G6PDHcorta como la G6PDHlarga recombinantes (con el tracto de 6 histidinas y residuos de aminoácidos
correspondientes al sitio de corte para trombina en su extremo amino terminal) presentaron en geles de
poliacrilamida una masa molecular aparente menor a la calculada (57 kDa en lugar de 60.7 kda para
primera y 61.6 kDa en lugar de 65.7 kDa para la segunda). En estas condiciones la presencia de un
componente minoritario correspondiente a la G6PDHcorta tampoco puede ser descartado.
Tal como se mencionó con anterioridad los valores de Km aparentes tanto para sustrato como para
cofactor correspondientes a ambas isoformas de T. cruzi son del orden de los obtenidos para sus
homólogos de T. brucei y humanos; sin embargo los valores correspondientes a la constante catalítica
difieren sustancialmente con los informados por Cohen y col [1975] para esta última. Dichos autores
presentaron una Kcat para la G6PDH de eritrocitos humanos de 190seg-1 mientras que el valor más
elevado que obtuvimos (para la G6PDHlarga) fue de tan sólo 7.1 seg-1. Estas diferencias tan marcadas
probablemente se relacionen (en parte) con la inactivación parcial que sufren ambas proteínas al ser
purificadas por columna de Ni2+. Dicha inactivación conduce a que parte de las moléculas presentes en
la solución (que aportan a la masa de proteína total y por lo tanto afectan el valor de µmoles de enzima
presentes en la solución) se encuentren inactivas o parcialmente inactivas de manera tal que afecten la
velocidad máxima de la reacción y por lo tanto el valor de la Kcat calculada. Por otro lado, se debe tener
en cuenta que la G6PDH de T. cruzi posee tan sólo un 33 % de identidad con su homólogo de humanos
por lo que pueden existir variaciones entre ambas enzimas que conduzcan a dichas divergencias. Un
ejemplo de ello es la falta de conservación en la G6PDH de T. cruzi en algunos residuos descriptos
como relevantes en la conservación de la estabilidad de la enzima humana y que forman parte de algunas
de las variantes genéticas de la misma que conducen a diversos tipos de anemias hemolíticas. Dicho
análisis lo llevamos a cabo en base al estudio realizado por Naylor y col [1996] sobre la distribución
espacial de dichas mutaciones en un modelo molecular de la enzima humana llevado a cabo utilizando la
estructura tridimensional de la G6PDH de Leuconostoc mesenteroides como molde. En dicho estudio
los autores establecieron que la mayor parte de los contactos entre los monómeros de la enzima ocurren
a través de interacciones hidrofóbicas, aunque para la enzima de Leuconostoc se ha propuesto también
la presencia de tres puentes salinos inter-subunidad (cuyos residuos de aminoácidos no se encuentran
conservados en la mayoría de las G6PDHs) que se encontrarían estabilizando el dímero. De esta manera,
se determinó que en la G6PDH humana la mutación Glu274-Lys, presente en una de las variantes genéticas
para la enzima, conduce a la pérdida del puente salino inter-subunidad Glu274-Arg348 conduciendo a
Discusión G6PDH - 81
tener una proteína con una marcada inestabilidad térmica. Por su parte, algunas variantes como Phe216Leu, Val213-Leu y Met405-Ile poseen interacciones hidrofóbicas disminuídas conduciendo también a la
pérdida de estabilidad del dímero [Naylor y col; 1996]. Mediante la comparación de la secuencia de la
G6PDH de T. cruzi y la humana y la localización dentro de las mismas de todos aquellos residuos de
aminoácidos para los cuales se observaron mutaciones en esta última (Fig.5) nos fue posible detectar, tal
como se mencionó con anterioridad, algunas divergencias entre ambas. Así 8 de los 15 residuos variables
en la enzima humana Val213, Phe216, Glu274, Ser278, Arg393, Pro396, Arg387 y Gly410, resultaron estar
estrictamente conservados en la G6PDH de T. cruzi mientras que los 7 restantes presentaban variaciones
con respecto a los presentes en la enzima humana no mutada y tampoco se correlacionaron con aquellos
presentes en las mutantes de la enzima. De acuerdo con esto la Val394 que es reemplazada por Lys en
una de las variantes humanas (Val394-Lys) apareció como Ala en tripanosomátidos, lo mismo ocurrió
con la Met405-Ile que resultó ser Treo en T. cruzi. Algo similar ocurrió con Lys386-Glu, Gln en
tripanosomátidos, Cys385-Arg, Thr en T. cruzi, Asn365-Lys, Glu y Arg439-Pro, Ser en tripanosomátidos
(Fig.5). Ante esto, y habiendo detectado variaciones en 7 residuos involucrados en la desestabilizacion
de la G6PDH humana podemos inferir (suponiendo que ambas enzimas poseean un plegamiento similar)
que la enzima de T. cruzi es más inestable que su homólogo de humanos. Este último hecho se vio
directamente reflejado en la imposibilidad de llevar a cabo la purificación de la enzima nativa del parásito
debido a las marcadas pérdidas de actividad enzimática registradas en los distintos pasos de purificación
que hicieron imposible el seguimiento de la misma.
Con respecto a la localización subcelular de la G6PDH de T. cruzi, los experimentos de
inmunofluorescencia indirecta llevados a cabo utilizando los anticuerpos anti-G6PDH purificados
mostraron que la enzima posee una localización esencialmente citosólica en los cuatro estadíos del
parásito. Sin embargo, en tripomastigotes metacíclicos, amastigotes y tripomastigotes del cultivo se
observó también señal en unas estructuras granulares distribuidas al azar dentro del cuerpo del parásito
que por su morfología podrían ser glicosomas [Quiñones y col; 2004]. Sin embargo, dicha localización
no pudo ser comprobada debido a la imposibilidad de llevar a cabo estudios de co-localización con la
piruvato fosfato di-kinasa (PPDK), una enzima considerada como marcadora de esta organela [Bringaud
y col; 1998] debido a que, tal como se mencionó con anterioridad, ambos anticuerpos fueron desarrollados
en conejo. Si bien no pudimos detectar dentro de las secuencias correspondientes a la G6PDH de T.
cruzi ninguna señal de reclutamiento glicosomal tipo PTS1 o PTS2, la presencia de una pequeña fracción
correspondiente a la enzima en dicha organela estaría de acuerdo con los experimentos de fraccionamiento
subcelular llevados a cabo por Maugeri y col [2004] donde, si bien la mayor parte de la actividad
Discusión G6PDH - 82
correspondiente a la enzima fue detectada en la fracción citosólica, también se detectó un pequeño
componente particulado para la misma que se distribuyó entre la fracción microsomal (donde sedimenta
el retículo endoplásmico y Golgi) y en mucha menor proporción en la fracción de gránulos chicos
(donde se encuentran principalmente los glicosomas). Se debe tener en cuenta que dichos experimentos
fueron realizados con epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener estadío en el cual no nos fue posible
detectar un patrón glicosomal para la enzima probablemente por la escasa proporción de la misma
distribuida en esta organela con respecto a la fracción citosólica. Ante lo expuesto, si fuese posible
realizar un experimento de fraccionamiento subcelular con los demás estadíos del parásito probablemente
la proporción de la actividad correspondiente a la proteína presente en la fracción de gránulos chicos
sea bastante mayor que la detectada en epimastigotes. Para la G6PDH de T. brucei se postula también
que parte de la actividad correspondiente a la enzima se encuentra localizada en glicosomas aunque
para dicha proteína no se han encontrado tampoco señales de reclutamiento glicosomal (PTS1 o PTS2)
dentro de la secuencia que justifiquen dicha localización [Duffieux y col; 2000]. Este supuesto se estableció
en base a estudios de fraccionamiento subcelular (llevados a cabo por los mismos autores) quienes
detectaron un 40 % de la actividad total correspondiente a la enzima asociada con a un material
particulado que sedimentaba en gradientes de sacarosa a la misma densidad que el marcador glicosomal.
Sin embargo dicha localización no fue comprobada mediante inmunofluorescencias indirectas. Para
explicar la presencia de la proteína en dicha organela aún en ausencia de las señales de reclutamiento
antes mencionadas, Druffrieux y col [2000] propusieron que la enzima podría entrar a los glicosomas
por medio de la interacción con otra proteína que presentara alguna de dichas señales, y particularmente
propusieron su interacción con la 6-fosfoglucono lactonasa que posee una señal de tipo PTS1 en su
extremo carboxilo terminal.
Mediante la co-localización de la señal de mayor intensidad de fluorescencia observada en epimastigotes
(en la parte anterior del parásito) con BODIPY®TR C5-ceramida pudimos inferir que parte de la G6PDH
de T. cruzi presente en epimastigotes y potencialmente en tripomastigotes metacíclicos se encuentra
asociada al aparato de Golgi. Para confirmar dicha localización llevamos a cabo la fusión pTEXG6PDHcorta–GFP. Los parásitos transfectados con dicha fusión presentaron fluorescencia homogénea
en todo el citosol excepto por una región de mayor intensidad ubicada en la zona anterior del parásito
con un patrón similar, aunque más difuso, que el observado por inmunofluorescencia indirecta. Al llevar
a cabo la co-localización de dicha señal con aquella correspondiente a la BODIPY®TR C5-ceramida,
observamos que ambas señales eran superponibles aunque aquella correspondiente a la G6PDHcortaGFP se presentaba como más extendida que la primera probablemente debido a la sobreexpresión.
Discusión G6PDH - 83
Estos experimentos nos permitieron por lo tanto confirmar que parte de la G6PDH se encuentra localizada
en el aparato de Golgi. Hasta el momento no existen evidencias de la presencia de proteínas solubles en
el lumen de dicha organela ya que todas aquellas que han sido detectadas son proteínas integrales de
membrana o proteínas asociadas a la cara citosólica de la misma [Munro; 1998] y la mayor parte de
estas últimas se encuentran involucradas en la conservación de la estructura de la organela. Con respecto
a este último punto se ha comprobado que existe más de una manera de interacción de dichas proteínas
con la cara externa del aparato de Golgi ya que se han detectado polipéptidos asociados (mediante
interacciones proteína-proteína) a la cola citosólica de aquellas que poseen dominios trans-membrana,
y también se han detectado polipéptidos asociados directamente a la membrana de la organela. De
acuerdo con esto aún no ha sido posible determinar cual es la característica particular de la membrana
del Golgi que es reconocida por dichas proteínas y que permite su asociación a la misma y no a la de
otras organelas. Para algunas proteínas periféricas de Golgi de mamíferos como la glutatión decarboxilasa,
la sCG10 y oxido nítrico sintasa endotelial, ha sido posible determinar la secuencia necesaria y suficiente
para su asociación a la cara externa de dicha organela [Solimena y col; 1994]. En estas proteínas dicha
señal se localiza dentro de los 30-35 residuos de aminoácidos pertenecientes al extremo N-terminal de
su secuencia polipeptídica, sin embargo se comprobó que no existe conservación alguna entre las mismas.
Sólo fue posible determinar que esas regiones se encuentran aciladas y que dicha acilación parecería
contribuir a su asociación a la membrana. Sin embargo, la acilación no es un fenómeno exclusivo de las
proteínas asociadas a la membrana del Golgi sino que también se ha detectado en proteínas asociadas
a otras membranas por lo que, tal como se mencionó con anterioridad, el factor que otorga la especificidad
a estas asociaciones aún no ha sido determinado [Munro; 1998]. Otras proteínas, como la GCP60 de
levadura (Golgi complex associated protein of 60 kDa) se encuentra asociada al aparato del Golgi por
medio de interacciones proteína-proteína a Giantina (una proteína que se encuentra anclada a la membrana
del mismo a través de su extremo C-terminal y que posee la mayor parte de su cadena polipeptídica
protruyendo hacia el citoplasma). La naturaleza de la interacción GCP60-Giantina aún es desconocida,
sin embargo se ha identificado la región necesaria y suficiente para esta interacción. Dicha región posee
152 residuos de aminoácidos, se ubica en el extremo C-terminal de la proteína y carece de los motivos
típicos de interacción proteína-proteína [Sohda y col; 2001]. Debido a que la G6PDH de T. cruzi no
posee dominios hidrofóbicos que puedan funcionar como secuencia transmembrana, se piensa que
dicha enzima se encuentra asociada a la cara externa del aparato de Golgi tal vez mediante asociación a
otras proteínas. Ya que, tal como se expuso anteriormente, existen grandes variaciones entre las secuencias
propuestas como responsables de la asociación de proteínas a la cara externa de esta organela no nos
Discusión G6PDH - 84
ha resultado posible determinar qué parte de la secuencia correspondiente a la G6PDH de T. cruzi se
encuentra involucrada en dicha interacción. El hecho de que la fusión G6PDHcorta-GFP se haya localizado
en parte en el aparato de Golgi indica que la secuencia responsable de la interacción no se encuentra
entre los 37 residuos de aminoácidos pertenecientes en la extensión N-terminal de la G6PDHlarga y si
bien no llevamos a cabo la fusión de esta última a GFP para analizar su localización pensamos que
potencialmente podría distribuirse de igual manera que la G6PDHcorta ya que ambas proteínas se diferencian
solamente en la extensión amino terminal. La única excepción a lo antes expuesto y que conduciría a
tener una localización diferente para la G6PDHlarga sería que dicha extensión N-terminal interfiera con la
asociación proteína-proteína propuesta por impedimentos estéricos. Otra conclusión que nos fue posible
obtener a través de los experimentos de localización llevados a cabo con los parásitos transfectados fue
que dicha asociación no requiere que la proteína se encuentre en su estado nativo (dímero), ya que se
comprobó mediante la comparación de medidas de actividad enzimática de extractos controles
(correspondientes a parásitos transfectados con pTEX-GFP) y aquellos correspondientes a parásitos
transfectados con pTEX-G6PDH-GFP que la proteína de fusión carece de actividad enzimática,
probablemente debida a la imposibilidad de formar la estructura dimérica necesaria para su actividad.
De estos experimentos pudimos concluir también que dicha interacción no requiere que el extremo
carboxilo terminal de la proteína se encuentre libre ya que la GFP había sido fusionada al C-terminal de
la G6PDHcorta . En cuanto a la relevancia fisiológica de la presencia de la G6PDH en el aparato de Golgi
pudimos establecer dos hipótesis: una de ellas tiene que ver con el posible rol establecido para la 6fosfoglucono lactona como agente capaz de causar reacciones de modificación covalente in vivo como
ser glicosilaciones y carbamilaciones debido a que es un compuesto altamente electrofílico [Rakitzis y
col; 1998]. Debido a que la 6-fosfogluconolactona se genera únicamente a través de la G6PDH, el
hecho de haber encontrado una fracción de dicha enzima en aparato de Golgi indicaría que potencialmente
podría estar involucrada de manera indirecta en reacciones de glicosilación. Sin embargo, este último
punto es algo controvertido si se tiene en cuenta que anteriormente postulamos que la enzima se encontraría
asociada a la cara externa del aparato de Golgi. La segunda hipótesis y tal vez la más acertada sería
que fracción correspondiente a la G6PDH ubicada en aparato de Golgi y glicosomas se encuentre
involucrada en la protección de membranas frente al estrés oxidativo mediante la generación de NADPH.
Llegamos a esta conclusión debido a que en T. cruzi ha sido identificado un grupo de peroxidasas
dependientes de glutatión cuya función principal es la de metabolizar hidroperóxidos de ácidos grasos y
fosfolípidos localizadas en glicosoma (TcGPXI) y fracción microsomal (TcGPXII) [Wilkinson y col;
2000]. Estas enzimas estarían involucradas por lo tanto, en la prevención de peroxidación de lípidos y
Discusión G6PDH - 85
lípidos de membrana dentro del REG y Golgi, y debido a que forman parte del sistema tripanotionatripanotiona reductasa dependen del NADPH provisto por la rama oxidativa de la vía de las pentosas.
Con respecto a los experimentos de estrés oxidativo podemos concluir que el hecho de haber detectado
una disminución en la actividad específica de la enzima en lugar de inducción en la expresión de la
misma en epimastigotes podría explicarse de acuerdo a lo siguiente: si se tiene en cuenta que los
epimastigotes de T. cruzi usualmente no se enfrentan a estrés oxidativo es posible inferir que
probablemente dichos parásitos posean una resistencia intrínseca menor al estrés que las formas del
parásito que si se encuentran usualmente sometidas al mismo (amastigotes y tripomastigotes metacíclicos).
Esto se vió reflejado en la mayor sensibilidad a distintas concentraciones de H2O2 detectada en
epimastigotes con respecto a los tripomastigotes metacíclicos. El hecho de no haber detectado inducción
de la G6PDH sinó disminución de la actividad específica de la misma en epimastigotes podría deberse
a la activación de proteasas dentro de la célula, en respuesta a los daños celulares causados por el
estrés, que lleven a degradación de proteínas intracelulares. Ante esto, podemos proponer que en
epimastigotes, la respuesta de la G6PDH al estrés oxidativo está relacionada únicamente con un aumento
en la velocidad de la enzima al disminuir la relación NADPH/NADP por consumo del primero siendo las
cantidades de NADPH así generadas suficientes para cubrir las necesidades del sistema tripanotionatripanotiona reductasa de dicha forma del parásito. Tal como se mencionó con anterioridad, los
tripomastigotes metacíclicos presentaron mayor actividad específica correspondiente a la enzima que
los epimastigotes, y al ser sometidos a estrés oxidativo se observó una sustancial inducción en dicha
actividad con respecto al control. No nos fue posible establecer a partir de que momento comienza a
detectarse la inducción en la expresión de la enzima ni cuanto tarda en volver a los niveles basales
debido a la escasa cantidad de muestra (tripomastigotes metacíclicos) disponibles para cada uno de los
experimentos. Los analisis llevados a cabo por Salvemini y col [1999] donde se analiza la inducción de
la G6PDH en células Hela causada por estrés oxidativo generado por diamida, mostraron que la
inducción en la expresión de la enzima comienza a observarse a tiempos tan cortos como 10 min (donde
los niveles de GSH se encuentran marcadamente disminuidos) para volver a sus niveles normales a las 8
hs después de iniciado el experimento donde los concentración de GSH se encuentran restablecida.
Nuestros experimentos mostraron que los tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi son capaces de
inducir la expresión de la G6PDH frente a condiciones de estrés oxidativo probablemente para suplir a
la célula de mayor poder reductor conferido por el NADPH utilizado en las reacciones de detoxificación
de ROS. Pensamos también que dicha respuesta probablemente sea extrapolable a los amastigotes de
T. cruzi
Discusión G6PDH - 86
De esta manera nos ha resultado posible confirmar que la G6PDH de T. cruzi juega un rol importante
en la protección del parásito frente al estrés oxidativo, al menos en aquellos estadíos del parásito que se
encuentran naturalmente sometidos a estrés.
6 -fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH)
Resultados 6PGDH - 87
Resultados
Identificación, clonado y análisis del número de genes de la 6PGDH de
Trypanosoma cruzi.
Con la finalidad de llevar a cabo el clonado del gen de la 6PGDH de T. cruzi, se realizaron sucesivas
búsquedas en distintas bases de datos utilizando el programa TblAstN y la secuencia aminoacídica de la
6PGDH de Trypanosoma brucei (P31072) como molde. A partir de dichas búsquedas se obtuvo un
único resultado positivo, un EST (AI057839) de T. cruzi de 840 pb de longitud que presentaba un
codón de terminación en la base 377 y pertenecía a la división de ESTs (expressed sequence tags) de
GenBank. El análisis de esta secuencia permitió determinar que las primeras 377 pb poseían un 69 % de
identidad con el 3´ del gen de la 6PGDH de T. brucei. Para completar la secuencia del marco abierto de
lectura (ORF) de su homólogo de T. cruzi se llevó a cabo la técnica de amplificación rápida de los
extremos 5’ de ADN c (5´-RACE) utilizando tres oligonucleótidos anti sentido: Pr 1-5’CTTGTCTAGCCGCTCGTA-3’,
Pr 2 -5’-GAGCACGGGAGCGTCAA-3’,
Pr 3 -5’-
GGCACAGAGCAGGTTACTTA-3’ diseñados en base a la secuencia del EST antes mencionado. De
esta manera, el Pr1 fue utilizado para la síntesis de ADNc, de acuerdo al protocolo descripto en Materiales
y Métodos, para posteriormente emplearlo como molde en la siguiente reacción de PCR. En dicha
reacción, como oligonucleótido sentido se utilizó parte de la secuencia del splice leader de T. cruzi Pr-
T. cruzi EST (AI057839)
132 bp
5’ UTR
SacI
3’ UTR
T. cruzi 6PGDH gene (1434 bp)
SL
Pr SL
NdeI
ATG
TGA
Pr-1
Pr-2
Pr-3
Fig.1. Esquema correspondiente al ORF de la 6PGDH de T. cruzi y secuencias flanqueantes. En dicho esquema
se representa el EST de T. cruzi (AI057839) (cuyas primeras 840 pb correponden al gen de la 6PGDH) como así
también la posición de los oligonucleóticos anti sentido diseñados en base su secuencia del (Pr-1, Pr-2 y Pr-3) para
obtener el extremo amino terminal del ORF mediante la técnica de 5’-RACE. También se encuentran señalados la
región no codificante del 5’ de 132 pb y el oligonucleótido sentido diseñado en base a la secuencia del splice leader
de T. cruzi (Pr-SL).
Resultados 6PGDH - 88
SL-5’-AACGCTATTATTGATACAGTTT-3’., y como anti sentido el Pr1. Luego, mediante sucesivas
reacciones anidadas de PCR utlizando siempre el Pr-SL como sentido, y los Pr2 y Pr3 como anti
sentido (Fig.1), fue posible obtener el extremo 5’-del gen de la 6PGDH de T. cruzi. Las reacciones de
PCR se llevaron a cabo utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización: 94 ºC, 45 seg.; pegado
del oligonucleótido: 54 ºC, 45 seg y elongación 72 ºC, 90 seg. De esta manera, luego de la tercera
reacción de PCR se logró amplificar un producto específico de 1325 pb, que fue purificado a partir de
geles de agarosa, clonado en el vector pGEM-T Easy (Promega) y totalmente secuenciado. Así, la
secuencia completa de 1434 pb correspondiente al marco abierto de lectura (ORF) de la 6PGDH de T.
cruzi, se obtuvo mediante la superposición de la secuencia del EST (AI057839) con la del fragmento
de 1325 pb mencionado anteriormente.
Para determinar la organización genómica de la 6PGDH de T. cruzi, se llevaron a cabo experimentos de
Southern blot donde se utilizaron como sonda, tanto el gen completo de la 6PGDH de T. cruzi, como la
secuencia correspondiente al EST (AI057839), (ambos marcados con P32). De esta manera, cuando el
ADN genómico fue digerido con enzimas de restricción cuyos sitios de corte se encontraban ausentes
dentro del ORF, se obtuvieron bandas únicas (NotI, XhoI, NheI, NcoI y BamHI) o dobles bandas
(XbaI y HindIII), independientemente de la sonda utilizada (Fig.2). A su vez, cuando la digestión se
llevó a cabo con NdeI (enzima que corta una vez dentro del gen de la 6PGDH de T. cruzi), se obtuvieron
tres bandas reactivas cuando el ORF correspondiente a la enzima fue utilizado como sonda, y tan sólo
una de ellas cuando la membrana fue hibridizada con el EST (Fig.2, flechas en la calle 8). Por su parte,
cuando el ADN fue digerido con SacI (enzima que también posee un único sitio de corte dentro del
ORF), se obtuvieron tres bandas reactivas cuando el gen completo fue utilizado como sonda, mientras
que una de ellas se perdió al hibridizar la membrana con el EST (Fig.2, flecha en la calle 9). El análisis
de los resultados obtenidos permitió sugerir la presencia de un único gen correspondiente a la 6PGDH
por genoma haploide de T. cruzi clon CL Brener. A su vez, los patrones correspondientes a las enzimas
NheI y SacI, sugirieron la existencia de variaciones entre los alelos, río arriba y río debajo del ORF de
la 6PGDH, respectivamente. Esto fue confirmado por el análisis de 13 GSS (genomic sequence survey),
aparecidos con posterioridad en la base de datos de T. cruzi de TIGR y varias secuencias obtenidas
mediante reacciones independientes de PCR. A partir de dicho análisis fue posible formar dos grupos
bien definidos de secuencias correspondientes al gen completo de la 6PGDH. Ambos grupos diferían en
tan sólo 9 nucleótidos dentro del ORF, que conducían a la variación en 5 residuos de aminoácidos
N59K, I204V, N390K, M395L, y T403R (que no comprometían residuos involucrados en la catálisis
o en la unión del sustrato). A su vez, tal como se había sugerido a partir de los resultados del análisis de
Resultados 6PGDH - 89
Southern blot, las secuencias presentes río arriba y río abajo del ORF correspondiente a la enzima
diferían considerablemente entre ambos grupos.
A
NdeI
SacI
6PGDH
Sonda 2
Sonda 1
B
Sonda 1
Kb
1
2
3
4
5
6
Sonda 2
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
Fig.2. Análisis del número de genes correspondiente a la 6PGDH de T. cruzi por Southern blot. A) Esquema del
gen de la 6PGDH de T. cruzi donde se señala la posición de las enzimas de restricción de corte único utilizadas. Sonda
1: gen completo de la 6PGDH de T. cruzi. Sonda 2: EST AI057839. B) Autorradiografía correspondiente al ensayo de
Southern blot utilizando sonda 1 (izquierda) y sonda 2 (derecha). El ADN genómico fue digerido con, Línea 1: NotI,
línea 2: XhoI, línea 3: NheI, línea 4: NcoI, línea 5: BamHI, línea 6: XbaI, línea 7: HindIII, línea 8: NdeI y línea 9: SacI.
Clonado del gen de 6PGDH de T. cruzi en el vector de expresión pET 28 a(+).
Tal como se mencionó con anterioridad, mediante la superposición de la secuencia del EST (AI057839),
con la del fragmento de 1325 pb amplificado por PCR, fue posible obtener la secuencia correspondiente
al ORF de la 6PGDH de T. cruzi. Con la finalidad de amplificar dicho gen por PCR a partir de ADN
genómico de epimastigotes del clon CL Brener y posteriormente clonarlo en el vector de expresión
pET28a (+), se diseñaron dos oligonucleótidos flanqueantes a los codones de iniciación y terminación
de
la
traducción
de
dicho
gen. Al
oligonucleótido
sentido
6PGDH s -5’-
AACTTTAAGTGCTAGCATGGACGTTGGCATT-3’ se le agregó un sitio de corte para la enzima de
restricción
NheI
(itálica),
mientras
que
al
anti
sentido
6PGDH as -5’-
AAATTCCCGAGTCGACTCACTGTAGCTCCGGCC-3’ se le adicionó un sitio SalI para permitir
Resultados 6PGDH - 90
el clonado direccional del gen en el vector de expresión (también itálica). La reacción de PCR se llevó
a cabo tal como se describe en la sección Materiales y Métodos, realizando el pegado de los
oligonucleótidos a 65 ºC y las extensiones a 72 ºC durante 2 min. Una vez finalizada dicha reacción el
producto de amplificación de 1466 pb, se purificó a partir de geles de agarosa, se ligó a pGEM-T Easy,
y se secuenció completamente. Aquí fue posible nuevamente identificar los dos grupos de secuencias
correspondientes al gen de la 6PGDH antes mencionados que se registraron bajo los siguientes números
de acceso de GenBankTM: AY300924 y AY300925. Posteriormente, se liberaron dichas secuencias del
pGEM-T Easy mediante digestión con NheI y SalI, y se clonaron en pET28a (+) (vector que dirige la
expresión de la proteína recombinante con una corrida de 6 residuos de histidina en su extremo amino
terminal, bajo el control del promotor T7Lac).
Análisis de la secuencia primaria de la 6PGDH de T. cruzi.
La secuencia aminoacídica de la 6PGDH de T. cruzi derivada a partir del gen se comparó con aquellas
correspondientes a sus homólogos de T. brucei (P31072), Leishmania major (AAF64172), eritrocitos
humanos (P52209), y E. coli (AAA23918) (Fig.3). La mayor identidad se obtuvo con la 6PGDH de T.
brucei (78.6 %), seguida por Leishmania major (73.2 %). Una mayor divergencia se detectó con
aquellas pertenecientes a E. coli y eritrocitos humanos que presentaron un 35 % y 32.1 % de identidad
con respecto a la enzima de T. cruzi, respectivamente.
La 6PGDH de T. brucei, al igual que el resto de las 6PGDHs, es una enzima dimérica. Cada monómero
posee tres dominios: el dominio amino terminal o de unión a coenzima, que involucra los residuos de
aminoácidos 1 a 178; el dominio central (todo hélice) que comprende los residuos 179 a 441; y por
último los 37 residuos de aminoácidos correspondientes al extremo C-terminal de la proteína, esenciales
para la dimerización [Phillips y col; 1998]. La enzima dimérica posee dos sitios de unión a cofactor
como así también dos de unión a sustrato. Dichos sitios son idénticos e independientes y los últimos se
encuentran constituídos por residuos pertenecientes a ambas subunidades. La 6PGDH de T. cruzi
comparte con su homóloga de T. brucei la misma secuencia de unión a dinucleótidos (7GLGVMG12)
que se diferencia de la informada para las 6PGDHs de mamíferos por poseer una Gly en la tercera
posición en lugar de la canónica Ala (GXAXXG). El cambio de A por G permitiría un acercamiento
mayor del NADP a la enzima. A su vez, la 6PGDH de humanos y ovejas posee una Phe en la posición
83 que protruye dentro del bolsillo de unión a coenzima disminuyendo su tamaño. En tripanosomátidos,
Resultados 6PGDH - 91
* * * * * *
* * *
*
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
T.cruzi
T.brucei
L.major
E.coli
Human
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
6PGDH
Fig.3. Alineamiento de 6PGDH pertenecientes a distintas especies. Las secuencias de aminoácidos derivadas a
partir de los genes de 6PGDH de T. cruzi (AY300924), 6PGDH de Trypanosoma brucei (P31072), 6PGDH de Leishmania
major ( AAF64172), 6PGDH de E. coli (AAA23918), y 6PGDH humana (P52209) fueron alineadas por el método de
Clustal. Con asteriscos se señalan los residuos de aminoácidos que comprenden el sitio de unión a coenzima, y con
líneas horizontales se marca el sitio de unión a sustrato.
en cambio, dicha Phe se encuentra ausente siendo reemplazada por una Thr. El cambio en los residuos
de aminoácidos antes mencionados probablemente contribuya también a un mayor acercamiento del
NADP, viéndose esto reflejado en una mayor afinidad (por parte de las enzimas de tripanosomátidos)
Resultados 6PGDH - 92
por el cofactor (ver más adelante) [Barrett y col; 1994]. En la secuencia correspondiente a la 6PGDH
de T. cruzi, fue posible también identificar el residuo más importante involucrado en la especificidad de
las 6PGDHs por el NADP, la Arg 31, que une el grupo 2’ fosfato de la coenzima. Todos los residuos
que componen el sitio de unión a sustrato se encuentran también conservados, siendo la Arg 452 (en la
secuencia de T. cruzi) uno de los residuos de mayor importancia. Dicho aminoácido se encuentra
estrictamente conservado en todas las 6PGDHs, se ubica dentro del bolsillo de unión a sustrato, y ha
demostrado ser crucial para la actividad de la enzima ya que jugaría un rol fundamental en el anclado del
6PG mientras este es decarboxilado a Ru-5P [Tetaud y col; 1999] (Fig.3). Usualmente las 6PGDHs
son enzimas diméricas, y el modo de dimerización, con el dominio C-terminal de una subunidad cruzando
por sobre la otra se encuentra conservado entre las distintas especies. Las 6PGDHs de la mayoría de
los eucariotas poseen un dominio C-terminal desestructurado, de 48 residuos de aminoácidos de longitud
rico en glicinas y serinas que se extiende más allá del dímero protruyendo hacia el solvente. Las 6PGDHs
de T. cruzi, T. brucei y Leishmania en cambio, poseen un dominio C-terminal más corto (de 37
residuos de aminoácidos de longitud) altamente cargado. Estos residuos se encuentran conservados en
los tres parásitos y juegan un rol fundamental en la dimerización de la enzima (Fig.3). En la 6PGDH de
T. brucei, 13 de los 37 residuos de aminoácidos son Asp, Glu, His o Arg y 5 de los mismos se
encuentran formando puentes salinos inter-subunidad que hacen más estrecha la unión entre los monómeros
y por lo tanto la estabilizan. Dos de los mencionados grupos cargados (pertenecientes al dominio C-
E134
R459
E463
R464
D466
R259
K139
E477
D246
H253
Fig.4. Estructura tridimensional de la 6PGDH de T. brucei, forma dimérica. Los residuos de aminoácidos que se
encuentran formando los puentes salinos inter-subunidad se encuentran señalados.
Resultados 6PGDH - 93
terminal) forman dichos puentes con dos residuos de aminoácidos pertenecientes al dominio de unión a
coenzima Arg459 →Glu134 , y Glu477 →Lys139, mientras que el resto se encuentra formando puentes
salinos con residuos pertenecientes al dominio central “todo hélice”: Glu463 →Arg 259, Arg464
→Asp246, Asp466 →His255 [Phillips y col; 1998] (Fig.4). En la 6PGDH de T. cruzi, en cambio, sólo
tres de los cinco puentes salinos mencionados anteriormente podrían estar presentes Arg457 →Glu132,
Glu475 →Lys137 y Asp464 →Asp246, debido a sustituciones en el dominio todo hélice de la enzima
E477
R459
E463
R464
D466
H255
R259
D246
K139
E134
(Fig.5).
6PGDH T.brucei
E475
R457
E461
R462
D464
H253
K137
E132
6PGDH T.cruzi
Fig.5. Esquema de las secuencias aminoacídicas de la 6PGDH de T. brucei y T. cruzi. Los residuos involucrados
en la formación de los puentes salinos se hallan señalados (los residuos de aminoácidos D244 y R257 se encuentran
ausentes en la enzima de T. cruzi siendo reemplazados por residuos no cargados).
Expresión de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.
1
2
3
4
kDa
La 6PGDH de T. cruzi se expresó en E.coli
como una proteína recombinante con una corrida
66 -
de 6 residuos de histidina en su extremo amino
45 -
terminal tal como se describe en Materiales y
Métodos. Las condiciones de inducción se
29 -
pusieron a punto variando la temperatura como
así también el medio de cultivo utilizado. De esta
Fig.6. Análisis de la expresión y purificación de la
6PGDH recombinante de T. cruzi. SDS PAGE 10 % teñido
con Nitrato de Plata. Línea 1: extracto total libre de células
de E. coli BL21 codón Plus (DE 3) transformadas con pET
28 a (+) sin inserto inducido, línea 2: extracto total libre de
células de E. coli BL21 codón Plus (DE 3) transformadas
con pET 28 a (+)-6PGDH no inducido, línea 3: extracto
total libre de células de E. coli BL21 codón Plus (DE 3)
transformadas con pET 28 a (+)-6PGDH inducido, línea 4:
6PGDH recombinante de T. cruzi purificada por IMAC.
manera, la utilización del medio mínimo M9 a
una temperatura de 18 ºC, fueron las mejores
condiciones encontradas para disminuir la
formación de cuerpos de inclusión (que dificultan
de manera pronunciada la ruptura de la células)
y favorecer la aparición de proteína
Resultados 6PGDH - 94
recombinante en la fracción soluble. Utilizando las condiciones de inducción antes mencionadas, fue
posible obtener buenas cantidades de la proteína recombinante que fue posteriormente purificada por
IMAC de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos. La proteína recombinante purificada
presentó una masa molecular aparente de subunidad (determinada por SDS PAGE) de 51,8 kDa (Fig.
6) en buena correlación con la masa molecular calculada 53,8 kDa. El rendimiento de dicha purificación
fue del 97%, y la actividad específica de la enzima purificada fue de 32 unidades.mg-1. Para corroborar
la identidad de la proteína purificada y descartar una posible contaminación con la 6PGDH de E. coli se
2002.1
100
3135.53
1602.3
20
2870.68
30
1008.41
1063.52
821.4
60
2569.3
50
1838.1
70
2256.04
2289.9
2367.053
1380.6
80
% Intensidad
2743.4
1591.8
90
40
2565.43
A
10
0
800.0
1440.4
2721.2
2080.8
3361.6
4002.0
Masa (m/Z)
B
0DVDGHWHUPLQDGD
0DVDFDOFXODGD
3RVLFLyQGHOSpSWLGR 6HFXHQFLDGHOSpSWLGR
7/3)9/.
<*4/96/45
)/*0*,6**((*$5
++++++66*/935
,),/94$*$$7 '$7,(4/.
7$/7/39/6$6/9<91*0)737/5
0<+1$*(<$9/49:*($)'9/5
Fig.7. Análisis por espectrometría de masas de los péptidos obtenidos mediante de la digestión tríptica en gel de
la 6PGDH recombinante de T. cruzi. A: Espectro de la relación masa/carga correspondiente a dichos péptidos
(aquellos que pudieron ser identificados como correspondientes a la 6PGDH de T. cruzi se encuentran señalados en
rojo). B: Tabla donde se muestran las masas determinadas y calculadas de los péptidos antes mencionados, como así
también su posición dentro de la secuencia de la proteína y composición aminoacídica de cada uno de ellos. La
digestíon tríptica in silico se llevó a cabo con la secuencia correspondiente a la G6PDH recombinante de T. cruzi
(incluído el tracto de 6 residuos de His y los residuos de aminoácidos pertenecientes al sitio de corte para trombina),
por lo tanto, la posición de los péptidos mencionados en la tabla se encuentra incrementada en 16 aminoácidos con
respecto a su posición en la Fig.3.
Resultados 6PGDH - 95
realizó digestión tríptica en gel (tal como se describe en Materiales y Métodos), y análisis de los péptidos
obtenidos por espectrometría de masas. Las masas moleculares de los péptidos detectados fueron
comparadas con aquellas obtenidas mediante la digestión in silico de la 6PGDH de T. cruzi y de E. coli
(esto se llevó cabo por medio del programa Peptide Mass disponible en www.expasy.org). Siete de los
péptidos obtenidos experimentalmente pudieron ser identificados como pertenecientes a la 6PGDH de
T. cruzi (Fig.7), confirmándose así la identidad de la proteína.
La 6PGDH recombinante purificada mostró una marcada pérdida de actividad enzimática en cortos
intervalos de tiempo presentando una notable dependencia por la presencia de agentes reductores,
como así también una notoria inactivación a concentraciones de imidazol superiores a 100 mM. Dicha
inactivación pudo ser subsanada sólo parcialmente mediante el agregado de un agente reductor (DTT)
4 mM concentración final, inmediatamente después de la purificación y manteniendo la concentración
de imidazol en niveles que no superasen los 100 mM. Sin embargo, aún utilizando las condiciones antes
mencionadas, la necesidad de llevar a cabo sucesivas diluciones de la enzima para la determinación de
sus parámetros cinéticos, incrementó de manera muy pronunciada la pérdida de actividad enzimática,
sugiriendo que dicha inactivación pudiera deberse a fenómenos de disociación (ver más adelante). Estas
observaciones tuvieron buena correlación con la marcada inactivación registrada previamente al intentar
llevar cabo la purificación de la 6PGDH “nativa” de T. cruzi (a partir de extractos totales de epimastigotes
de Cl Brener) que hicieron imposible su purificación a homogeneidad. Otra característica importante
observada tanto para la 6PGDH nativa como recombinante fue la imposibilidad de congelar aquellas
muestras que contuviesen la enzima, ya que un único ciclo de congelamiento-descongelamiento conducía
a la pérdida de más del 90 % de la actividad enzimática. De acuerdo con esto, las muestras sólo podían
ser conservadas a 4 ºC por cortos períodos de tiempo.
Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa.
La determinación del peso molecular de la 6PGDH recombinante activa, se llevó a cabo mediante
experimentos de filtración en gel en Superdex G200, tal como se describe en la sección Materiales y
Métodos. Así cuando la enzima recombinante era cromatografiada inmediatamente después de la
purificación, la proteína era eluída de la columna en un único pico (con actividad de 6PGDH) con una
Resultados 6PGDH - 96
masa molecular aparente de 93 kDa. Esto demostró que en su forma activa, la 6PGDH de T. cruzi al
igual que el resto de las 6PGDHs es un homodímero (Fig 8).
2.5
Absorbancia (mU).
40
30
Log PM
2.0
1.5
1.0
y=-1.7195x+4.7104
R2=0.9919
0.5
0
1.3
1.5
20
1.7
Ve/Vo
1.9
0.8
93 kDa.
0.6
2.1
0.4
0.2
10
10
20
30
40
ml
Fig.8. Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa por filtración en gel. Perfil de elución
de la 6PGDH recombinante de T. cruzi en Superdex-G200. Al ser cromatografiada inmediatamente después de su
purificación la proteína eluye en un único pico que presenta actividad de 6PGDH y que posee una masa molecular
aparente de 93 kDa.
Modelado molecular y mutaciones sitio dirigidas de la 6PGDH de T. cruzi.
Se ha demostrado que la dimerización es esencial para la actividad de las 6PGDHs debido a que, tal
como se mencionó anteriormente, cada sitio activo de la enzima se encuentra constituído por residuos
de aminoácidos correspondientes a ambas subunidades. Ante esto hemos propuesto que las marcadas
pérdidas de actividad enzimática registradas para la 6PGDH de T. cruzi, sobre las cuales se habló con
anterioridad, podrían deberse a la disociación de la estructura dimérica de la enzima (causada por
interacciones débiles entre los monómeros). Esto podría deberse a la falta de 2 de los 5 puentes salinos
que se encuentran estabilizando el dímero de la enzima de T. brucei y estaría provocado (tal como se
mencionó con anterioridad) por el reemplazo de dos residuos de aminoácidos en el dominio todo hélice
de la 6PGDH de T. cruzi. La ausencia de dichos puentes conduciría a una mayor propensión al
desensamblaje de la estructura dimérica de la enzima, y por lo tanto a la pérdida de su actividad. Con la
intención de llevar a cabo la estabilización de la proteína se pensó en realizar mutaciones puntuales en el
dominio todo hélice de la 6PGDH de T. cruzi (específicamente en las posiciones 244 y 257), para
introducir los residuos de aminoácidos cargados necesarios para la formación de los puentes faltantes.
Debido a que dicha aproximación sólo podría resultar potencialmente exitosa si la 6PGDH de T. cruzi
y T. brucei poseían un plegamiento similar que asegurase una conservación en las distancias entre los
Resultados 6PGDH - 97
residuos involucrados en la formación de dichos puentes, se llevó a cabo el modelado molecular de la
6PGDH de T. cruzi, en base a la estructura tridimensional de los monómeros de su homólogo de T.
brucei (ver Materiales y Métodos). Ambas deshidrogenasas mostraron un plegamiento muy similar
haciendo de esta manera más promisorio el intento de estabilización de la enzima de T. cruzi por medio
de las mutaciones antes mencionadas (Fig.9). Así y de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y
Fig.9. Modelado molecular de la 6PGDH de T. cruzi en base a la estructura tridimensional de su homólogo de T.
brucei. En azul se presenta el monómero modelado de la enzima de T.cruzi y en rojo la estructura correspondiente a
uno de los monómeros de la 6PGDH de T. brucei (1PGJA).
Métodos, se llevaron a cabo las mutaciones V244D y C257R. La 6PGDH recombinante doble mutante
se expresó en E. coli de acuerdo al protocolo mencionado con anterioridad y fue purificada por IMAC
en las mismas condiciones utilizadas para la purificación de la enzima salvaje, no mutada. Para comparar
la estabilidad de la doble mutante con la de esta última, ambas enzimas se purificaron en el mismo
momento y su actividad enzimática se determinó a intervalos de tiempo definidos en distintas condiciones
a saber: 1) En presencia de Tris HCl 50 mM pH 7.5, 500 mM ClNa conteniendo 100 mM imidazol, con
o sin el agregado de 4 mM DTT o 2) En presencia de la misma solución amortiguadora conteniendo 300
mM imidazol, con o sin el agregado del agente reductor (Fig. 10). En dicho experimento, la 6PGDH no
mutada, incubada en presencia de 300 mM imidazol, y en ausencia del agente reductor mostró la
pérdida de más del 50 % de la actividad enzimática en los primeros 5 min de incubación. La enzima
doble mutante, en cambio, sufrió el mismo decaimiento en su actividad en 30 min. En estas condiciones,
Resultados 6PGDH - 98
la adición de DTT sólo protegió parcialmente a ambas enzimas de la inactivación (Fig.10 A). Cuando las
muestras fueron incubadas en presencia de 100 mM imidazol, el agregado de DTT pareció no afectar
demasiado la actividad de la enzima doble mutante (al menos en el tiempo en que se llevó a cabo el
experimento). Sin embargo, su presencia fue crucial para mantener la actividad de la 6PGDH no
mutada (Fig.10 B). A su vez, en un intento de corroborar si la mayor estabilidad de la enzima doble
0
A
100
Actividad (%)
DM + DTT
SAL + DTT
DM - DTT
10
SAL - DTT
1
0
40
80
120
160
Tiempo (min)
Fig.10.
Comparación
de
estabilidad entre las 6PGDH
recombinantes de T. cruzi salvaje y
doble mutante. Las enzimas
recombinantes fueron incubadas a 4
°C in presencia de la solución
amortiguadora
de
elución
conteniendo 300 mM imidazol (A) o
100 mM imidazol (B). Los símbolos
abiertos corresponden a la 6PGDH
recombinante no mutada (0.3 mg.ml1
), y los cerrados a la doble mutante
(0.24 mg.ml-1).
B
100
Actividad (%)
DM + DTT
DM - DTT
SAL + DTT
SAL - DTT
10
0
315
630
945
1260
Tiempo (min)
mutante era una consecuencia de la conservación de su estado dimérico a lo largo del tiempo, se
llevaron a cabo sucesivas cromatografías de filtración el gel (en Superdex G200), de acuerdo al protocolo
descripto anteriormente. En dicho experimento ambas proteínas recombinantes (no mutada y doble
mutante) se purificaron por columna de Ni2+ en Tris HCL 50 mM pH 7.5, 500 mM ClNa, 100 mM
imidazol. Se agregó DTT 4 mM final a cada uno de los eluídos y se cromatografiaron inmediatamente
después de su purificación, como así también 5 hs. y 24 hs después de la misma. De esta manera, la
enzima no mutada mostró un único pico activo con una masa molecular aparente de 93 kDa,
Resultados 6PGDH - 99
correspondiente a la forma dimérica de la enzima, cuando esta fue cromatografiada inmediatamente
después de su purificación (Fig.11 A1); sin embargo, cuando la misma muestra fue cromatografiada 5 hs
después de su purificación, se observó un segundo pico (con una masa molecular aparente de 45 kDa),
sin actividad enzimática, correspondiente a la forma monomérica de la enzima (Fig.11 A2). 24 hs.
después de su purificación dicha muestra había sufrido la pérdida del 40 % de su actividad, y al ser
cromatografiada se observó una marcada disminución en el pico correspondiente al dímero, como así
también un aumento en el pico correspondiente a la forma monomérica de la enzima (Fig.11 A3). La
6PGDH doble mutante, por su parte no sufrió una inactivación significativa en el período de tiempo
ensayado, y un único pico, con actividad enzimática, correspondiente a la forma dimérica de la enzima,
se observó en los tres intervalos de tiempo ensayados (Fig.11 B1-3). De esta manera, se determinó que
20
30
10
20
10
29
17
12.4
10
1
30
66
44
200
150
40
BD
A
20
10
Absorbancia (mUA)
O hr
40
2
40
ml
30
40
ml
20
30
40
ml
10
20
30
40
ml
10
20
30
40
ml
10
20
30
40
ml
30
20
10
5 hr
40
3
30
20
10
24 hr
B
40
30
1
20
Absorbancia (mUA)
10
40
2
O hr
30
20
10
5 hr
40
3
30
20
10
24 hr
Fig.11. Perfiles cromatográficos en
Superdex G200 de las 6PGDH
recombinantes de T. cruzi salvaje y
doble mutante. 1) Muestras
resueltas inmediatamente después
de su purificación; 2) muestras
resueltas 5 hs después de su
purificación; 3) muestras resueltas 24
hs después de su purificación. A)
6PGDH recombinante salvaje de
T.cruzi (0.5 mg.ml-1); B) 6PGDH
recombinante doble mutante (0.24
mg.ml-1). Las flechas verticales se
encuentran señalando el volumen de
elución de los estándares de masa
molecular utilizados (los valores
corresponden a kDa). BD: Blue Dextran. Entre cada corrida
cromatográfica las muestras se
mantuvieron a 4°C en la solución
amortiguadora de elución en
presencia de 100 mM imidazol y 4
mM DTT.
Resultados 6PGDH - 100
una de las causas de la pérdida de actividad enzimática observada en la enzima no mutada estaba
relacionada con la aparición del monómero libre (inactivo) y se confirmó que la mayor estabilidad de la
doble mutante era debida a la conservación de su estructura dimérica. Debido a que la mayor pérdida
de actividad enzimática en la proteína no mutada era causada por fenómenos de disociación, y a que
estos se hacían más pronunciados al llevar a cabo diluciones de la enzima, se pensó que el agregado de
una proteína enzimáticamente inerte como la BSA, podría ayudar en la estabilización de la misma. De
esta manera se determinó que el agregado de BSA a una concentración final de 2 mg.ml-1 permitía
prevenir e incluso revertir en cierto grado la inactivación de la enzima.
Determinación de pH óptimo y parámetros cinéticos.
El pH óptimo para la reacción catalizada por la 6PGDH recombinante se determinó de acuerdo al
protocolo descripto en Materiales y Métodos. La máxima actividad enzimática se registró a pH 8.4. Sin
embargo, los estudios de estabilidad a los distintos valores de pH ensayados (llevados a cabo mediante
la incubación de la enzima durante 10 min. en las distintas soluciones amortiguadoras), mostraron una
marcada inactivación de la misma a pH extremos, siendo de aproximadamente un 30 % en el rango de
8.4 a 9.8 (Fig. 12) indicando la imposibilidad de trabajar al pH óptimo para la enzima. De esta manera,
la determinación de los parámetros cinéticos de la 6PGDH de T. cruzi se llevó a cabo utilizando
Trietanolamina 50 mM pH 7.5 como solución amortiguadora.
Fig.12. Determinación de pH óptimo de
la 6PGDH recombinante de T. cruzi. El
pH óptimo para la enzima recombinante
se determinó tal como se describe en la
sección de Materiales y Métodos.
Actividad (µmol.min-1.ml-1)
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
sin inc.
inc. 10 min.
2.0
1.0
6.0
7.0
8.0
pH
9.0
10.0
Resultados 6PGDH - 101
La determinacion del Km aparente para sustrato y cofactor se llevó a cabo (de acuerdo al protocolo
descripto en la sección Materiales y Métodos) tanto para la enzima salvaje (no mutada) (Fig.13) como
para la doble mutante (Fig.14). Esto se realizó a los fines de comparar la afinidad de ambas enzimas por
su sustrato y cofactor y de esta manera descartar cualquier alteración en los parámetros cinéticos causada
por la doble mutagénesis. La representación gráfica de los datos obtenidos se llevó a cabo mediante las
rectificaciones de Lineweaver-Burk, y de Woolf. Ambas representaciones fueron utilizadas para la
determinación de los Km aparentes (para sustrato y cofactor) debido a que permiten visualizar de manera
diferente la distribución de los datos. Los valores obtenidos por ambos métodos fueron totalmente
comparables entre si y como así también entre ambas enzimas (ver Fig.13 y 14).
Fig.13
A
Determinación de Km ap para sustrato y cofactor de la 6PGDH recombinante de T. cruzi (no mutada)
Woolf plot
[6PG] /V
Lineweaver-Burk plot
-Km
-1/Km
B
Woolf plot
[NADP] /V
Lineweaver-Burk plot
-1/Km
-Km
Resultados 6PGDH - 102
Fig.14
A
Determinación de Km ap para sustrato y cofactor de la 6PGDH recombinante "doble mutante" de T. cruzi .
Woolf plot
[6PG] /V
Lineweaver-Burk plot
-1/Km
-Km
B
Woolf plot
[NADP] /V
Lineweaver-Burk plot
Debido a marcada inestabilidad de la enzima no mutada, que hacía imposible su utilización en ensayos
cinéticos de larga duración (como la determinación de Km reales o ensayos de inhibición), la enzima
doble mutante fue utilizada para la realización de dichos estudios, ya que como se mencionó con
anterioridad presenta una mayor estabilidad que la primera.
La determinación del Km real para sustrato y cofactor se llevó a cabo variando la concentración de
6PG (a distintas concentraciones fijas de NADP), tal como se describe en la sección Materiales y
Métodos. De esta manera, los valores de Km real se determinaron a partir de gráficos secundarios de las
intersecciones y pendientes correspondientes a las rectas derivadas de la representación de LineweaverBurk de los datos experimentales (Fig.15). Los valores obtenidos fueron Km real 6PG: 18 ± 0.4 µΜ,
Km real NADP 4.87 ± 0.2 µΜ. La constante catalítica calculada fue de 98 s-1.
Resultados 6PGDH - 103
A
1
K 6PG
= m
V Vmax
sNADP * 1
(1+ K[NADP]
) [6PG] +
m
y
x
1
K NADP
1+ m
(
)
[NADP]
Vmax
b
-1/Km NADP
1/Vmax
Pendiente
Ord. al origen
B
Km6PG/Vmax
Fig.15. Determinación de los parámetros cinéticos (Km reales para 6PG y NADP) de la 6PGDH recombinante
doble mutante de T. cruzi.
El tipo de gráfico obtenido anteriormente (con las rectas intersectándose a la izquierda del eje y), estaría
indicando un mecanismo de reacción de tipo secuencial. De acuerdo con esto, y en un intento de
discernir si se trataba de un mecanismo secuencial al azar (de equilibrio rápido) o secuencial ordenado,
se llevaron a cabo ensayos de inhibición por producto. Así, los estudios de inhibición por NADPH
con respecto al NADP, llevados a cabo variando la concentración de NADP para distintas
concentraciones del inhibidor y manteniendo el 6PG en concentración saturante (1 mM), mostraron una
inhibición de tipo competitiva con un valor de Ki : 4.7 µM. Los ensayos de inhibición por NADPH con
respecto al 6PG en cambio, llevados a cabo variando la concentración de 6PG (para distintas
concentraciones fijas del inhibidor) y manteniendo el NADP saturante (0.5 mM), mostraron un perfil de
inhibición de tipo mixto (Fig.16). Por su parte, los estudios de inhibición llevados a cabo con Ru-5P
con respecto al 6PG, mostraron un patrón de inhibición de tipo a-competitiva. Este último resultado no
Resultados 6PGDH - 104
fue tenido en cuenta debido a la posibilidad de la presencia de impurezas en la Ru-5P que pudiesen
estar actuando también como inhibidores para la enzima. La imposibilidad de utilizar la Ru-5P como
inhibidor condujo a tener un análisis incompleto de la inhibición por producto de la 6PGDH de T. cruzi
no pudiéndose definir con exactitud el mecanismo de reacción para la 6PGDH de T. cruzi. Sin embargo,
Fig.16.
Inhibición por NADPH con respecto al NADP.
Pendiente
s/NADPH
-Ki
Inhibición competitiva:
1
V
=
Km
I
1
1
1 +
+
(
)
Vmax
Ki
S Vmax
Inhibición por NADPH con respecto al 6PG
s/NADPH
Inhibición mixta :
1
V
=
Km
I
1
1
I
1 +
1 +
+
Vmax(
Ki ) S Vmax(
Ki«)
Resultados 6PGDH - 105
estudios de inhibición llevados a cabo posteriormente con 2-deoxi-6PG (un análogo del sustrato)
mostraron perfiles de tipo competitivo con respecto al 6PG (ver más adelante). Esto sugiere que el
mecanismo de reacción más probable para la enzima de T. cruzi es secuencial al azar de equilibrio
rápido.
Detección de actividad de 6PGDH en extractos totales de T cruzi, purificación
parcial de la enzima nativa y determinación de sus parámetros cinéticos.
Con la finalidad de determinar la actividad de la 6PGDH en los distintos estadíos del ciclo de vida de T.
cruzi del clon CL Brener, se obtuvieron extractos totales libres de células (tal como se describe en
Materiales y Métodos) y se llevaron a cabo las determinaciones de actividad enzimática por
espectrofotometría tal como se mencionó con anterioridad. Las medidas de actividad específica así
obtenidas mostraron que la mayor actividad para la enzima se encuentra en tripomastigotes metacíclicos
(0.1 µmol.min-1.mg-1) mientras que epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes de cultivo presentaron
actividades específicas similares (0.05, 0.041 y 0.038 µmol.min-1.mg-1respectivamente). Por otra parte
se llevó a cabo también la determinación de la actividad específica de la enzima en extractos totales de
epimastigotes de otras cepas y clones de T. cruzi. Los valores así obtenidos indicaron una gran similitud
entre los mismos siendo 0.049 µmol.min-1.mg-1 para Tul 2, 0.045 µmol.min-1.mg-1 para RA y 0.048
µmol.min-1.mg-1 para Dm28c.
Como la finalidad última de la producción de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi era su
utilización en estudios de inhibición (debido a la importancia de dicha enzima como posible blanco para
quimioterapia) se consideró necesario establecer si los parámetros cinéticos determinados para la proteína
recombinante se asemejaban a los correspondientes a la enzima nativa. De esta manera se llevó a cabo
la purificación parcial de la 6PGDH de T. cruzi, a partir de un extracto libre de células de epimastigotes
del clon CL Brener (de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos). Luego del
último paso de dicha purificación la recuperación de la actividad enzimática fue de tan sólo un 11 %
habiéndose purificado la proteína 25 veces (tabla 1). Las fracciones correspondientes a los distintos
pasos de purificación fueron analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (teñidos con
Coomasie Brillant Blue) y Western blot. En ambos casos, previamente a su siembra las muestras fueron
concentradas mediante precipitación con ácido tricloro acético (TCA 10 %). El gel teñido con Coomassie
Blue mostró una marcada disminución en el número de bandas conforme se avanzaba en la purificación,
Resultados 6PGDH - 106
Act. Esp (U.mg-1)
Muestra
Unidades totales
% Recuperación
Veces de purificación
Ext. Total
epimastigotes
0.059
2.59
100
-
Eluído Blue
Sepharosa
0.64
1.96
75.7
10.8
Eluído 2'- 5'-ADP
Sepharosa
1.50
0.28
10.8
25.4
Tabla 1. Tabla de purificación correspondiente a la 6PGDH nativa de T. cruzi
A
4
3
2
llegando a obtenerse 6 bandas proteicas
1
mayoritarias y otras tantas de menor intensidad en
kDa.
66
el eluído de la columna de 2’-5’ ADP Sepharosa
(Fig.17.A). Mediante el ensayo de Western blot
(donde se utilizaron los anticuerpos anti 6PGDH
45
desarrollados en ratón en una dilución 1/250), fue
posible detectar la proteína nativa solamente en la
29
fracción correspondiente al último paso de la
purificación. La banda reactiva detectada poseía
B
4
3
2
una masa molecular aparente de 46,6 kDa (menor
1
kDa.
66
a aquella correspondiente a la proteína
recombinante que se había colocado como control
positivo en el Western blot) (Fig.17 B). Este
45
resultado fue acorde a lo esperado ya que la
6PGDH recombinante posee en su extremo N-
29
terminal los 6 residuos de histidina como así también
los residuos de aminoácidos que conforman el sitio
Fig.17. Purificación parcial de la 6PGDH
nativa de T. cruzi. A) SDS PAGE 10 % teñido
con Coomasie Brillant Blue. Línea 1: 6PGDH
recombinante 0.5µg, línea 2: extracto total libre
de células de epimastigotes de CL Brener, 800 µg
de proteína total; línea 3: Eluído de Blue
Sepharosa, 10 µg de proteína total; línea 4: eluído
de 2’-5’ ADP Sepharosa, 40 µg de proteína total.
B) Western blot utilizando como primer
anticuerpo anti-6PGDH de ratón en dilución 1/
250, las muestras se sembraron en igual orden y
cantidad que en el gel (A).
de corte para trombina, haciendo que la masa
molecular aparente calculada para dicha enzima sea
mayor a la calculada para la proteína nativa.
Por otro lado, a pesar de que la cantidad sembrada
de extracto total de epimastigotes de CL Brener
fue muy elevada (aprox 800 µg), no fue posible
detectar una banda reactiva en dicho extracto,
Resultados 6PGDH - 107
indicando que la 6PGDH nativa representa un muy bajo porcentaje de la proteína total, no siendo
posible detectarla hasta tanto se obtenga una fracción enriquecida en dicha enzima.
Este ensayo de Western blot permitió también determinar la especificidad de los anticuerpos anti 6PGDH
de ratón que iban a ser utlizados para llevar a cabo la determinación de la localización subcelular de la
enzima mediante inmufluorescencia. Dichos anticuerpos, a pesar de no estar purificados, no presentaron
reacción cruzada con otras proteínas, ya que no se detectaron bandas inespecíficas (aún después de
sembrar 800 µg de proteína total correspondiente al extracto de epimastigotes de CL Brener).
Fig.18.
Determinación de Km ap para sustrato y cofactor de la 6PGDH nativa de T. cruzi .
A
Woolf plot
[6PG] /V
1/V (µmol-1.min. ml)
Lineweaver-Burk plot
1/[6PG] (µM-1)
-1/Km
-Km
Km ap 6PG: 22.7 µM
Km ap 6PG: 22.6 µM
B
Lineweaver-Burk plot
Woolf plot
[NADP] /V
1/V (µmol-1.min. ml)
-1/Km
[6PG] µM
1/[NADP] (µM-1)
Km ap NADP: 3.1 µM
-Km
[NADP] µM
Km ap NADP: 2.8 µM
Resultados 6PGDH - 108
Una vez finalizada la purificación antes mencionada, la fracción eluida de 2’-5’ ADP Sepharosa
(conteniendo la 6PGDH nativa de T. cruzi), fue utilizada para la determinación del Km aparente para
sustrato y cofactor tal como se describe en Materiales y Métodos. Los valores obtenidos fueron muy
similares a aquellos determinados para la 6PGDH recombinante no mutada y doble mutante, ya que
los valores de Km aparente para el 6PG y NADP obtenidos fueron 22.6 µΜ y 3.0 µΜ respectivamente
(Fig.18). Estos resultados permitieron confirmar que la realización de aquellos ensayos tendientes a
determinar el mecanismo de reacción de la enzima, como así también los estudios de inhibición de la
6PGDH de T. cruzi (utilizando la 6PGDH recombinante doble mutante, era una aproximación totalmente
válida ya que enzima nativa y las recombinantes poseen la misma afinidad por su sustrato y cofactor, con
la ventaja de que la enzima doble mutante posee una mayor estabilidad que permite trabajar con
comodidad obteniéndose, por lo tanto, resultados más confiables.
Estudios de inhibición de la 6PGDH de T. cruzi.
Los estudios de inhibición de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi se llevaron a cabo
con algunos de los inhibidores desarrollados para la 6PGDH de T. brucei, proporcionados por la Dra.
Stefania Hanau, perteneciente al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad
de Ferrara, Italia.
Dichos inhibidores fueron diseñados en base a estudios cristalográficos llevados a cabo tanto con la
enzima de T. brucei como con su homólogo de oveja. Estos estudios mostraron que a pesar de que los
residuos de aminoácidos pertenecientes al centro activo de ambas enzimas se encontraban conservados,
existían diferencias en su localización espacial que podían ser explotadas para el diseño de inhibidores
específicos. La mayor diferencia fue encontrada en el bolsillo de unión del OH perteneciente al C2 del
sustrato que es considerado de importancia para la comunicación entre las subunidades del homodímero
y para la tautomerización ceto-enólica que forma parte del mecanismo de reacción de la enzima. Los
primeros estudios de inhibición de la 6PGDH de T. brucei se llevaron a cabo con análogos del 6PG (2deoxi 6PG, análogos del 6PG protegidos en el C2 mediante la introducción de un grupo CH3, como así
también la combinación de ambos). Estos compuestos poseían mejores propiedades farmacocinéticas
que los carbohidratos fosforilados que son marcadamente inestables y presentan alta dificultad para
atravesar membranas. Un análogo del 6PG por el cual la enzima de T. brucei mostró poseer mucha más
afinidad que su homólogo de oveja (Ki 4.4 µM y 770 µM respectivamente), fue el 2-deoxi 6PG, sin
Resultados 6PGDH - 109
embargo, este compuesto (como así también otros pertenecientes a la misma familia), se comportaron
como inhibidores débiles ya que sus constantes de inhibición presentaron valores mayores que el Km
para el 6PG [Pasti y col; 2003]. A causa de esto se comenzó a trabajar en el desarrollo de otro tipo de
inhibidores, análogos del estado de transición y de los intermediarios de alta energía presentes en la
reacción. De acuerdo con el mecanismo propuesto para las 6PGDHs [Berdis y col; 1993] [ Hanau y
col; 1992], estos compuestos serían el 3-ceto 6PG y el 1,2 enediol intermediario (de alta energía). Se ha
demostrado que algunos derivados de azúcares con grupos fosfato y fosfonatos, presentaron una inhibición
selectiva para la enzima de T. brucei con respecto a su homólogo de oveja. El mejor de estos compuestos
ha sido el 4-fosfo eritronato Ki (T. brucei) 0.13 µM Ki (oveja) 10.7 µM. Se ha propuesto que estos inhibidores
se unen a la enzima por medio de su grupo fosfato. El 4-fosfo eritronato estaría mimetizando el enediol
intermediario de la reacción, ya que su C1 se encontraría en la misma posición que el C2 del enediol, y el
doble enlace presente en este último entre el C1 y el C2 estaría siendo mimetizado por la unión entre el
C1 y el oxígeno del carboxilato del 4-fosfoeritronato [Pasti y col; 2002]. Dardonville y col; [2003] han
informado que dos de los inhibidores diseñados para la 6PGDH de T. brucei, un 2,4-dideoxi análogo
del 6PG y un 2-metil 4-deoxi (también análogo del 6PG), presentaron una moderada toxicidad in vitro
contra amastigotes de T. cruzi. Recientemente, y en un intento de mejorar estos análogos de intermediarios
para hacerlos más estables y aumentar su permeabilidad a través de membranas, Dardonville y col;
[2004], han diseñado análogos del 3-ceto 6PG que poseen un grupo sulfóxido en el C3 que mimetiza la
polarización del doble enlace entre el C3 y el oxígeno del mencionado ceto derivado, como así también
compuestos conteniendo ácido hidroxámico. El ácido 4 fosfo-D-eritronohidroxámico mimetizaría el 1,2
enediol intermediario de alta energía mencionado anteriormente. Estos últimos compuestos mostraron
ser potentes inhibidores contra la enzima de T. brucei con constantes de inhibición del orden nano
molar, sin embargo, estudios de toxicidad in vitro llevados a cabo con amastigotes de T. cruzi mostraron
que ninguno de ellos es efectivo contra este parásito.
Los inhibidores probados para la 6PGDH de T. cruzi en este trabajo de Tesis pertenecen al grupo de
los primeros que fueron desarrollados para la enzima de T. brucei. Si bien hoy en día, tal como se
mencionó con anterioridad, se cuenta con compuestos mejorados en cuanto a estabilidad, permeabilidad
a membranas y eficiencia de inhibición, la prueba de estos inhibidores básicos continúa siendo de
importancia para poder evaluar la factibilidad del uso de aquellos que han sido mejorados. De esta
manera, se ensayó la inhibición de la 6PGDH de T. cruzi por 2 deoxi-6 fosfogluconato (2d-6PG), y 4fosfoeritronato (4PE). Tal como se mencionó con anterioridad, el primero es un análogo del 6PG por lo
que se comportó como un inhibidor de tipo competitivo con respecto a dicho sustrato, presentando un
Resultados 6PGDH - 110
valor de Ki de 13.4 µM. Este resultado mostró que, al igual que para la enzima de T. brucei, la 6PGDH
de T. cruzi posee buena afinidad para este compuesto (si se lo compara con la enzima de oveja cuyo Ki
es de 770 µM), pero dicho valor de Ki es demasiado elevado para ser considerado un buen inhibidor
(Fig.19). El 4PE en cambio, es un análogo del enediol intermediario que se comportó también como un
Pendiente
1/V (µmol-1.min. ml)
Cinética de inhibición por 2 deoxi 6-fosfogluconato (2d-6PG)
s/2d-6PG
3 µM 2d-6pg
8 µM 2d-6PG
12 µM 2d-6PG
−Ki
[2d-6PG] µM
Ki: 13.4 µM
1/[6PG] (µM-1)
Fig.19. Cinética de inhibición de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi por 2 deoxi 6-fosfogluconato
(2d-6PG) con respecto al 6PG.
inhibidor de tipo competitivo con respecto al 6PG presentando un valor de de Ki de 0.16 µM (Fig.20).
Este compuesto podría ser considerado como un muy buen inhibidor lo que indicaría que al igual que
para la enzima de T. brucei, los análogos de los estados de transición de la enzima son muy promisorios
como potenciales inhibidores, ya que a demás de trabajar en el orden nano molar, poseen alta
especificidad por las enzimas de tripanosomátidos ya que la 6PGDH de oveja presentó un valor de Ki
para dicho compuesto de 10.7 µM. Cabe aclarar que estos inhibidores no fueron probados in vivo
por tratarse de azúcares fosfato que, tal como se mencionó con anterioridad no poseen la capacidad de
atravesar membranas.
Resultados 6PGDH - 111
Pendiente
Cinética de inhibición por 4-fosfo eritronato (4P-E).
s/ 4P-E
Fig.20. Cinética de inhibición de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi por 4 fosfo eritronato (4PE) con respecto al 6PG.
Localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi.
La secuencia aminoacídica derivada a partir del gen de la 6PGDH de T. cruzi, no mostró ningún motivo
correspondiente a ninguna de las dos señales de reclutamiento glicosomal PTS1 o PTS2 en el extremo
carboxilo o amino terminal de la proteína, respectivamente. Sin embargo, se detectó una posible señal
interna de tipo PTS1 (SHL) presente en un loop expuesto al solvente (residuos 248-250) pertenecientes
al dominio central, todo hélice de la enzima. Un hallazgo similar se realizó en la 6PGDH de Leismania
donde se detectó también una señal interna de tipo PTS1 (AKL) correspondiente a los residuos de
aminoácidos 416-418 [Greenblat y col; 2002]. En la misma ubicación, la 6PGDH de T. brucei presenta
la señal SKL (residuos 420-422) mientras que la 6PGDH de T. cruzi posee el tripéptido SKT, que no
está descripto como una de las variantes funcionales del tripéptido canónico SKL (ver Fig.3). Resultados
de fraccionamiento subcelular llevados a cabo en epimastigotes del clon CL Brener [Maugeri y col;
2004], sugirieron que la mayor parte de la 6PGDH presente en dicho estadío es citosólica, sin embargo,
la presencia de un pequeño componente glicosomal para la enzima no fue descartado. Con la finalidad
de definir la localización subcelular de dicha enzima en los distintos estadíos del clon CL Brener de T.
cruzi, se llevaron a cabo inmunofluorescencias indirectas de acuerdo al protocolo descripto en Materiales
y Métodos. Para ello se utilizaron anticuerpos policlonales anti 6PGDH recombinante desarrollados en
Resultados 6PGDH - 112
A
K
N
Gli
Gli
B
K
N
C
K
N
D
Gli
N
K
Resultados 6PGDH - 113
Fig.21. Inmunofluorescencias indirectas correspondientes a los distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi.
Como primer anticuerpo se utilizó anti-6PGDH desarrollado en ratón 1/100, y como segundo anticuerpo anti mouseAlexa Fluor ® 488 (verde). El núcleo y kinetoplasto se presentan teñidos con DAPI (azul). Panel A: Epimastigotes de
T. cruzi clon CL Brener. Panel B: tripomastigote metacíclico. Panel C: Amastigotes. Panel D: tripomastigote de cultivo.
En todos los casos, la figura de la izquierda (en canal gris) muestra la señal correspondiente a la 6PGDH de T. cruzi,
la figura central ( también en canal gris) corresponde a la imagen de núcleo (N) y kinetoplasto (K), y por último la
figura de la izquierda muestra la superposición en color de las imágenes anteriores. Algunos de los gránulos que se
consideran potenciales glicosomas se encuentran señalados como (Gli). (Las fotografías no se presentan en escala).
A
B
C
Fig.22. Estudio de co-localización de la 6PGDH de T. cruzi con PPDK (marcador glicosomal) por
inmunofluorescencia indirecta. Epimastigote de T. cruzi clon CL Brener inmunomarcado con: Panel A: anti-6PGDH
de ratón 1/100, utilizando como segundo anticuerpo anti mouse- Alexa Fluor ® 488 (verde); Panel B: anti PPDK de
ratón, en una dilución 1/100. Dichos experimentos mostraron que en los cuatro estadíos del parásito la
enzima posee una localización esencialmente citosólica, sin embargo, en epimastigotes y tripomastigotes
de cultivo se detectó también señal en una especie de gránulos distribuídos al azar a lo largo del cuerpo
del parásito (Fig. 21), en un patrón muy similar al correspondiente a los glicosomas de T. cruzi [Quiñones
y col; 2004]. Para determinar la identidad de dichas estructuras, se llevaron a cabo estudios de colocalización de los anticuerpos anti 6PGDH con anticuerpos desarrollados contra una enzima marcadora
de glicosoma. En el caso particular de este trabajo de Tesis se utilizaron anticuerpos policlonales anti
piruvato fosfato di kinasa (PPDK) de T. brucei, desarrollados en conejo en dilución 1/500 (cortesía del
Dr. F. Bringaud). En dichos ensayos, las señales correspondientes a los segundos anticuerpos, anti
ratón-Alexa Fluor 488 y anti conejo-Alexa Fluor 546, se solaparon completamente en las estructuras
granulares antes mencionadas (Fig. 22), confirmándose de esta manera que al menos una fracción de la
6PGDH de T. cruzi se encuentra compartimentalizada en los glicosomas.
Discusión 6PGDH - 114
Discusión
Al igual que la 6PGDH de T. brucei y Leishmania, la 6PGDH de T. cruzi clon CL Brener se encuentra
codificada por un único gen y la proteína derivada a partir del mismo, a diferencia de la de mamíferos,
posee un extremo C-terminal altamente cargado que cumple un rol fundamental en la dimerización y por
lo tanto en la estabilización de la enzima. La 6PGDH de T. cruzi, a pesar de poseer un 78 % de
identidad con respecto a la mutaciones sitio dirigidas permitió aumentar la estabilidad de la enzima sin
afectar los parámetros cinéticos de la misma. Debido a que la inactivación por disociación de la 6PGDH
de T. cruzi depende también de la concentración de proteínas, probablemente la actividad de la enzima
in vivo no se vea afectada, ya que su entorno proteico la protege de este fenómeno.
El efecto de la presencia de un agente reductor sobre la actividad de la 6PGDH de T. cruzi estaría
relacionado con la conservación (en su estado reducido) de uno o varios grupos sulfhidrilo importantes,
como fue informado para la 6PGDH de Candida utilis [Rippa y col; 1978]. Si bien la necesidad del
agregado de un agente reductor luego de las purificaciones por columnas de afinidad a quelatos metálicos
(IMAC) es una característica común a casi todos los protocolos de purificación de proteínas
recombinantes, en el caso particular de la 6PGDH de T. cruzi, el efecto benéfico del agregado de DTT
a las muestras que contenían la enzima, se observó también para la proteína nativa. Como se mencionó
anteriormente, se encontraron diferencias por la necesidad de la presencia de un agente reductor para la
conservación de la actividad enzimática entre la enzima salvaje y la doble mutante. Esto podría explicarse
en base a lo siguiente: la 6PGDH de T. cruzi posee 7 residuos de cisteína por monómero, 5 de los
cuales pertenecen al dominio todo hélice, y por lo tanto se encuentran ocultos en la interfase del dímero.
Las débiles interacciones entre los monómeros presentes en la enzima salvaje no mutada, (nativa y
recombinante) podrían resultar en una mayor exposición de dichas cisteínas, y por lo tanto hacerlas más
sensibles a la oxidación. Debido a que en la enzima doble mutante las interacciones entre los monómeros
son más fuertes, los residuos de cisteína antes mencionados estarían menos expuestos, por lo que el
agregado de un agente reductor deja de ser un factor crucial para la preservación de la actividad de la
misma. Siguiendo el mismo razonamiento, el efecto de pérdida de actividad enzimática por la presencia
de altas concentraciones de imidazol, podría deberse a interferencia con el puente salino Asp 464 →His
253. Dicha interferencia, en la enzima no mutada que posee naturalmente 3 puentes genera un efecto
desestabilizador muy pronunciado, en la doble mutante, en cambio, dicho efecto se atenúa bastante ya
que posee dos puentes salinos adicionales.
Discusión 6PGDH - 115
Con respecto a los parámetros cinéticos, se pudo determinar que la mutación de los residuos de
aminoácidos V244D y C257R, llevados a cabo con la finalidad de estabilizar la proteína recombinante,
no afectaron la afinidad de la enzima por su sustrato o cofactor ya que se obtuvieron valores de Km
reales y aparentes muy similares para la enzima doble mutante, no mutada y nativa. El valor de Km para
el NADP es mayor que aquel obtenido para la enzima de T. brucei [Hanau y col; 1996], sin embargo,
es significativamente más bajo que el informado para la enzima humana [Pearse y col; 1975]. La
constante de afinidad por el 6PG correspondiente a la 6PGDH de T. cruzi fue, en cambio,
significativamente mayor que la determinada para la enzima de T. brucei y del mismo orden que la
informada para su homólogo de eritrocitos humanos, [Tabla.2]. Las causas de tan marcada diferencia
T. cruzi
T. brucei
Oveja
Humana
Km kcat kcat/Km
Km kcat kcat/Km
Km kcat kcat/Km
Km kcat kcat/Km
6PG
18
98
5.4
3.5
27
7.7
16
21
1.3
20
13
0.7
NADP
4.9 98
20
1.5
27
18
7
21
3
30
13
0.4
Tabla2. Comparación de parámetros cinéticos de 6PGDHs de distintas especies. Los valores de Km son del orden
µM, las Kcat se expresan en seg-1. Todos los parámetros se determinaron a pH 7.5.
entre ambas enzimas parasitarias no han sido establecidas ya que todos los residuos de aminoácidos
involucrados en la formación del sitio de unión de sustrato se encuentran estrictamente conservados, no
pudiendo descartase sin embargo la presencia de variaciones en la ubicación espacial de dichos residuos
como así también en los residuos de aminoácidos circundantes que participen en la orientación de la
molécula de sustrato en el sitio activo.
Con respecto al mecanismo de reacción, la 6PGDH de T. cruzi parece trabajar por medio de un
mecanismo secuencial al azar de equilibrio rápido, al igual que la enzima de T. brucei [Hanau y col;
1996] y Candida utilis [Berdis y col 1993]. Estudios iniciales llevados a cabo por Topham y col
[1986] para determinar el mecanismo de reacción de la 6PGDH de oveja mostraron que este varía con
la solución amortiguadora utilizada. De esta manera, utilizando soluciones de fosfato el mecanismo de
reacción resultó ser secuencial ordenado siendo el NADP el sustrato conductor, y en trietanolamina,
Discusión 6PGDH - 116
en cambio, la reacción se inicia fundamentalmente a través del complejo enzima-6PG. Sin embargo,
estudios posteriores de inhibición por producto llevados a cabo por Price y col [1996], (utilizando
como solución amortiguadora 100 mM Hepes), mostraron un mecanismo de reacción para la 6PGDH
de oveja de tipo secuencial al azar de equilibrio rápido. Ante todo lo expuesto surge que, si bien solo
nos fue posible sugerir el mecanismo de reacción para la 6PGDH de T. cruzi (debido a la imposibilidad
de llevar a cabo un estudio completo de inhibición por producto para la enzima), el mismo se encontraría
en concordancia con aquellos informados para sus homólogos de otras especies.
Con respecto a la localización subcelular, los resultados obtenidos indican que parte de la 6PGDH de T.
cruzi se encontraría dentro del glicosoma, en buena correlación con los experimentos de fraccionamiento
subcelular llevados a cabo por Maugeri y Cazzulo; [2004] con epimastigotes de T. cruzi clon CL
Brener (ver introducción). Esto hace suponer que la señal interna tipo PTS1 detectada en la secuencia
de la 6PGDH de T. cruzi estaría siendo funcional, aunque con baja eficiencia ya que la enzima posee
una localización mayoritariamente citosólica. Este no sería un caso único de localización bipartita (citosólica
y glicosomal) de una proteína codificada por un único gen, ya que una observación similar se realizó
para la glucosa fosfato isomerasa de Leishmania (ver introducción). Si bien la presencia de la G6PDH
de T. cruzi en glicosomas no pudo ser confirmada debido a la imposibilidad de llevar a cabo estudios de
co-localizacion con la PPDK tal como se mencionó con anterioridad; su presencia dentro de dichas
organelas no puede ser descartada. De esta manera, la razón de la presencia de ambas deshidrogenasas
de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato dentro de los glicosomas podría explicarse por la
necesidad, dentro de dicha organela, de una fuente de NADPH necesario para llevar a cabo las reacciones
de metabolización de hidroperóxidos de fosfolípidos y ácidos grasos por parte de la peroxidasa
glicosomal dependiente de glutatión TcGPXI que forma parte del sistema tripanotiona-tripanotiona
reductasa y cuyo rol fundamental es la protección de membranas del estrés oxidativo. Por otro lado, la
rama oxidativa de la vía de las pentosas también podría estar suministrando a dichas organelas la Ru-5P
necesaria para la síntesis de purinas y pirimidinas que se lleva a cabo en dichos compartimentos. Si bien
la presencia de la 6-fosfoglucono lactonasa dentro de los glicosomas no ha sido confirmada, su presencia
dentro de dichas organelas no sería crucial, ya que la apertura del anillo de la γ 6-fosfo glucono lactona
es un proceso que puede ocurrir espontáneamente, aún en ausencia de la enzima. Por lo tanto, una rama
oxidativa de la vía de las pentosas incompleta, en ausencia de la 6PGL, sería probablemente menos
eficiente, pero potencialmente funcional.
Más allá de las diferencias mencionadas, las enzimas de T. cruzi y T. brucei presentan algunas
características en común, como ser la alta afinidad por su cofactor que se ve reflejada en los bajos
Discusión 6PGDH - 117
valores de Km para el NADP obtenidos; y a pesar de que difieren de manera pronunciada en la afinidad
por su sustrato presentan un comportamiento muy similar en la respuesta a los inhibidores. Esto último
se vio reflejado en el valor de Ki para el 4P-E (0.16 µM) obtenido para la enzima de T. cruzi, que es
prácticamente idéntico al obtenido para la enzima de T. brucei (0.14 µM). Esto indica que a pesar de la
diferencia en la afinidad por el sustrato mencionada anteriormente, la utilización de inhibidores que sean
análogos a los intermediarios de reacción permiten salvar dichas diferencias haciendo muy promisoria la
extrapolación a la 6PGDH de T. cruzi de aquellos compuestos diseñados para inhibir a la enzima de T.
brucei.
Conclusiones generales.
Conclusiones generales - 118
Conclusiones generales.
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.
*Dentro del genoma de T. cruzi clon CL Brener existen varias copias del gen de la G6PDH (que
pudieron ser separadas en tres grupos) como así también dos pseudo genes que codifican para proteínas
inactivas.
*Dichos genes se encuentran distribuídos en tres de los cromosomas del parásito y hemos podido
establecer que existe conservación en el entorno genético de algunos de ellos (sintenía) con respecto a
sus homólogos de T. brucei y Leishmania.
*En todas las secuencias genómicas analizadas como así también aquellas correspondientes a ADNcopia
hemos detectado dos codones de iniciación de la traducción separados uno de otro por 111 pb sugiriendo
la posibilidad del inicio de la traducción a partir de cualquiera de ellos pudiéndose generar una proteína
de 518 o 555 residuos de aminoácidos.
*Pudimos determinar que ambas enzimas (G6PDHcorta y G6PDHlarga) son activas ya que pudieron ser
expresadas en E. coli como proteínas recombinantes con actividad de G6PDH. Sin embargo presentaron
diferencias en sus parámetros cinéticos y en su sensibilidad a la presencia de DTT.
*La G6PDHlarga, al igual que la G6PDH nativa, y de manera similar a la G6PDH de cloroplastos de
plantas superiores, sufrió una marcada inactivación en presencia de DTT sugiriendo que ambas cisteínas
presentes en la extensión amino terminal de dicha proteína estarían formando un puente disulfuro necesario
para la conservación de la actividad de la enzima.
*La G6PDHcorta presentó mayor afinidad por su sustrato que la G6PDHlarga (Km ap 76 y 199 µM
respectivamente), siendo este último valor más similar al correspondiente a la G6PDH nativa determinado
en extractos totales de epimastigotes de T. cruzi.
Conclusiones generales - 119
*Se detectó actividad diferencial correspondiente a la G6PDH en extractos totales de los distintos
estadíos del ciclo de vida de T. cruzi, siendo esta mas elevada en aquellas formas del parásito que se
encuentran naturalmente sometidas a estrés oxidativo. Dichas medidas de actividad enzimática tuvieron
buena correlación con los niveles de G6PDH (detectada por Western blot) como así también con los
niveles de ARNm correspondientes a la enzima.
*Con respecto a la localización subcelular de la proteína pudimos confirmar que la enzima posee una
localización esencialmente citosólica, aunque también hemos confirmado su presencia en el aparato de
Golgi (en epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos). En amastigotes, tripomastigotes de cultivo y
tripomastigotes metacíclicos hemos detectado también señal correspondiente a la proteína en unos gránulos
de mayor tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas.
*Mediante experimentos de generación de estrés oxidativo con H2O2 llevados a cabo en tripomastigotes
metacíclicos pudimos determinar que la G6PDH forma parte de un mecanismo inducible en respuesta al
estrés que sería funcional en dicho estadío del ciclo de vida del parásito y no en epimastigotes. Esto
demostró que la G6PDH puede jugar realmente un rol muy importante en la respuesta al estrés oxidativo,
al menos en las formas del parásito que naturalmente se encuentran sometidas a estrés.
6-fosfogluconato deshidrogenasa.
*La 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH) se encuentra codificada por un único gen dentro del
genoma de T. cruzi clon CL Brener.
*Dicha enzima pudo ser expresada como una proteína soluble y activa en E. coli que resultó ser
marcadamente inestable al igual que la 6PGDH nativa de T. cruzi.
*Debido a la naturaleza dimérica de dicha enzima propusimos que la inestabilidad de la misma podría
deberse a la ausencia de dos de los cinco puentes salinos que se encuentran estabilizando a su homólogo
de T. brucei.
Conclusiones generales - 120
*Mediante mutagénesis sitio dirigida pudimos restablecer dichos puentes en la 6PGDH de T. cruzi
generándose así una enzima marcadamente más estable que la salvaje, cuyos parámetros cinéticos
fueron totalmente comparables con los determinados para esta última como así también con los
correspondientes a la enzima nativa.
*La 6PGDH doble mutante resultó entonces ser una herramienta muy útil para llevar a cabo la determinación
del posible mecanismo de reacción de la enzima como así también para ensayos de inhibición.
*A partir de estos últimos pudimos determinar que la 6PGDH de T. cruzi posee un comportamiento
cinético muy similar al de su homólogo de T. brucei siendo altamente factible la extrapolación de los
inhibidores específicos desarrollados para la 6PGDH de este parásito.
*Con respecto a la localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi pudimos concluir que si bien la
enzima posee una localización esencialmente citoplasmática, en epimastigotes y tripomastigotes de cultivo
pudimos detectarla también en glicosomas sigiriendo que la señal de interna tipo PTS1 sería funcional.
De acuerdo con esto podemos concluir que ambas deshidrogenasas de la vía de las pentosas fosfato
pueden ser consideradas como posibles blancos de quimioterapia para el tratamiento de la enfermedad
de Chagas. De acuerdo con los experimentos presentados, la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de T.
cruzi parecería cumplir un rol importante en la defensa del parásito contra el estrés oxidativo por lo que
una inhibición selectiva de la misma podría generar parásitos más susceptibles a dicho estrés que
potencialmente tendrían menor capacidad de sobrevivir a la infección o como formas intracelulares.
Por su parte la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de T. cruzi ha presentado un comportamiento cinético
muy similar al determinado para la 6PGDH de T. brucei y marcadamente distinto al de su homólogo de
oveja por lo que, teniendo en cuenta la potencial letalidad de la carencia de 6PGDH, dicha enzima se
convierte en un blanco muy promisorio para el desarrollo de inhibidores específicos para la enzima.
Materiales y Métodos.
Materiales y Métodos - 121
Cultivo de parásitos y obtención de extractos libres de células.
Epimastigotes de los clones CL Brener y Dm28c, y de las cepas Tul 2 y RA, fueron cultivados en medio
axénico, cosechados posteriormente por centrifugación a 3500 g durante 10 min. y lavados con 50 mM
Tris-HCl pH 7.5, de acuerdo al método descripto por Cazzulo y col [1985]. Los tripomastigotes
metacíclicos fueron obtenidos mediante la diferenciación espontánea de epimastigotes del clon Cl Brener
a 28 ºC, y posterior purificación por cromatografía de intercambio iónico (DEAE-celulosa) [De Souza;
1983]. Los amastigotes y tripomastigotes de cultivo fueron obtenidos mediante la infección de monocapas
de células Vero con tripomastigotes del clon CL Brener [Andrews y col; 1982]. Los extractos libres de
células de los diferentes estadíos mencionados más arriba, fueron obtenidos por sonicación o por
congelamiento y descongelamiento. Este último procedimiento se llevó a cabo mediante tres ciclos de
congelado a -20 ºC y posterior descongelado en amortiguador Tris-HCl 50 mM pH 7.5, 0.5 mM ditiotreitol (DTT), en presencia de inhibidores de proteasas: 0.5 mM tosil-lisil-clorometil cetona (TLCK) y
0.1 mM E64. La lisis por sonicación se realizó mediante la aplicación a la suspensión de parásitos de
tres pulsos de 20 seg. de duración cada uno, al 60% de la potencia máxima del sonicador (Branson
450). Las suspensiones fueron luego centrifugadas a 20.000xg durante 10 min. a 4 ºC. Los sobrenadantes
así obtenidos fueron inmediatamente utilizados para la determinación de la actividad enzimática de
6PGDH y G6PDH.
Purificación parcial de la 6PGDH de T. cruzi nativa.
La 6PGDH nativa fue parcialmente purificada a partir de un extracto libre de células de epimastigotes
del clon CL Brener obtenido por sonicación, tal como se describió anteriormente. Dicho extracto fue
inmediatamente sembrado en una columna de afinidad general, Blue-Sepharosa, pre-equilibrada con
50 mM Tris-HCl, 4 mM DTT pH 7.5. Las proteínas unidas de manera inespecífica a la matriz fueron
eluidas mediante lavados con el mismo amortiguador conteniendo 50 mM ClNa. La elución de la 6PGDH
se llevó a cabo utilizando la solución amortiguadora antes mencionada, conteniendo en esta oportunidad
250 mM ClNa. Dicho eluído fue rápidamente desalado en una columna de Sephadex®-G25 M PD-10
Materiales y Métodos - 122
(Amersham Biosciences), y posteriormente aplicado a una columna de 2´-5’ ADP Sepharosa® 4B
(Amersham Biosciences) pre-equilibrada con 50 mM Tris-HCl, 4 mM DTT pH 7.5. Dicha columna fue
posteriormente lavada con el mismo amortiguador para eliminar el material unido inespecíficamente, y la
elución de la 6PGDH se efectuó en presencia de 500 mM ClNa. Todos los pasos de purificación se
llevaron a cabo a 4ºC y se monitorearon mediante la determinación de actividad enzimática de 6PGDH.
Preparación de los plásmidos.
*Mini preparación de los plásmidos.
Las mini preparaciones de pGEMT-Easy se llevaron a cabo a partir de cultivos de E. coli tanto de la
cepa XL1Blue como de la cepa DH5α. Las mini preparaciones de pET28a(+) (plásmido utilizado
para la expresión de las proteínas recombinantes mencionadas en este trabajo de Tesis) se llevaron a
cabo únicamente a partir de cultivos de E. coli de la cepa XL1 Blue.
Los plásmidos rutinariamente se prepararon mediante el protocolo de lisis alcalina, que involucra los
siguientes pasos: 1) resuspensión del pellet bacteriano en 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
conteniendo 100 µg.ml-1 de RNAsa, 2) lisis celular mediante el agregado de una solución 200 mM
NaOH, 1% SDS, 3) precipitación del ADN genómico mediante el agregado de AcK 3 M pH 5.5 y
posterior centrifugación a 14.000 rpm durante 30 min. A continuación se realiza la precipitación del
plásmido por medio de la adición de 2.5 volúmenes de isopropanol y centrifugación a 14.000 rpm
durante 30 min. El plásmido así precipitado se lava con etanol 70 % y posteriormente se resuspende en
agua Milli Q autoclavada. En caso de ser necesario un plásmido de alta pureza (para secuenciación) al
protocolo antes descripto se le adiciona un paso más que implica una nueva precipitación del plásmido.
Esto se realiza mediante el agregado (al plásmido purificado tal como se describió con anterioridad) de
polietilén glicol (PEG 8000) 6,5 % concentración final y ClNa 400 mM concentración final, su incubación
en hielo durante 40 min y posterior centrifugación a 14.000 rpm durante 30 min. Finalmente el plásmido
precipitado se lava con etanol 70 % y se lo resuspende en agua Milli Q autoclavada.
*Preparación de plásmidos para transfectar.
Los plásmidos pTEX-GFP, y pTEX-G6PDH-GFP, se purificaron a partir de 250 ml de cultivo de
células (DH5α) crecidas en medio LB en presencia de 50 µg.ml-1 de ampicilina, por medio de columnas
Materiales y Métodos - 123
de intercambio aniónico QIAGEN–tip 500 (QIAGEN) de acuerdo a las instrucciones provistas por el
fabricante.
Ligaciones.
Todas las ligaciones llevadas a cabo en este trabajo de Tesis, se realizaron de manera rutinaria a 16ºC
durante toda la noche utilizando 0.4 U ADN ligasa del bacteriofago T4 (Promega) y una relación inserto:
vector (3:1) en la solución amortiguadora correspondiente a la enzima.
Preparación de bacterias competentes, electrocompetentes y transformación.
*Preparación de bacterias competentes.
La preparación de bacterias competentes de las distintas cepas de E.coli utilizadas (DH5α, XL1Blue,
BL21 codon Plus (DE3)) se llevó cabo de acuerdo al protocolo que se describe a continuación: se pica
una colonia de la cepa de E. coli elegida y se inocula medio LB estéril conteniendo el antibiótico para el
cual dichas bacterias posean resistencia natural. El cultivo se crece a 28 ºC hasta un valor de DO 600 mn
de 0.6 y a continuación las bacterias se cosechan por centrifugación 2500 rpm durante 10 min.
Posteriormente se las resuspende en una solución conteniendo 15 mM CaCl2, 55 mM Cl2Mg, 250 mM
MnCl2 en 10 mM Hepes, se las incuba durante 10 min en hielo y se centrifuga nuevamente. Por último se
resuspende el pellet bacteriano en la solución antes mencionada conteniendo DMSO 7 % concentración
final, se vuelven a incubar durante 10 min en hielo, se alicuotan y se congelan a – 70 ºC hasta su uso.
*Preparación de bacterias electrocompetentes.
La preparación de bacterias electrocompetentes de la cepa de E. coli XL1 Blue, se llevó a cabo de
acuerdo al siguiente protocolo: se prepara un precultivo de dichas bacterias inoculando medio SOB
estéril conteniendo 20 µg/ml de tetraciclina con una única colonia y se creciendo toda la noche a 37 ºC.
Al día siguiente se realiza una dilución 1/1000 de dicho cultivo en SOB conteniendo el mismo antibiótico
y se crece a 37ºC hasta una DO 600 mn de 0.6. Posteriormente se cosechan las bacterias mediante
centrifugación a 1250x g durante 10 min, se descarta el sobrenadante y el pellet se lava mediante su
Materiales y Métodos - 124
resuspención en el mismo volumen de glicerol 10 % estéril. Se vuelven a centrifugar las bacterias, se
descarta el sobrenadante y el pellet se resuspende ahora en la mitad del volumen inicial de glicerol 10 %
y se centrifuga nuevamente. Dicho procedimiento se repite una vez más resuspendiendo el pellet bacteriano
en ¼ del volumen inicial. Las bacterias así lavadas finalmente se resuspenden a razón de 0.5 ml de
glicerol 10 % estéril por cada 100 ml de cultivo inicial, se fraccionan en pequeños volúmenes y se
congelan a –70 ºC hasta su uso.
*Transformación bacteriana mediante shock térmico.
Este método de transformación se utilizó rutinariamente para la transformación de las distintas cepas de
E. coli con plásmidos superenrrollados y se llevó a cabo de acuerdo al método que se describe a
continuación: 50 µl de bacterias compententes se ponen en contacto con el plásmido durante 30 min. (en
hielo) en tubos de polipropileno (Falcon® de 15 ml). Posteriormente se las somete al shock térmico
mediante su incubación durante 45 seg a 42 ºC. A continuación se enfrian las bacterias en hielo, se les
adiciona 800 µl de medio de cultivo estéril, se incuban a 37 ºC durante 1 hora, y se plaquean en LB agar
conteniendo el anticuerpo específico.
*Transformación bacteriana mediante electroporación.
Este método se utilizó esencialmente para la transformación de E. coli con productos de ligación y se
llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: se ponen en contacto 30 µl de bacterias (preparadas tal
como se describió anteriormente) con 2 µl de plásmido en un tubo eppendorf estéril, se homogeniza
bien y se incuba durante 3 min en hielo. Luego se coloca dicha mezcla en la cubeta de electroporación
previamente enfriada y se electroporan las bacterias mediante un único pulso de 2.5 kV (para cubetas
con un paso de 0.2 cm de longitud). Inmediatamente después se adicionan 500 µl de SOB estéril dentro
de la cubeta de electroporación, se resuspenden las bacterias, se las trasvasa a un tubo Falcon de 15 ml
de capacidad (estéril), se recuperan a 37 ºC durante 1h y se plaquean en LB agar conteniendo el
anticuerpo específico.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes.
*Expresión de las G6PDHcorta y G6PDHlarga recombinantes.
Materiales y Métodos - 125
Con la finalidad de obtener la G6PDH recombinante de T. cruzi en su forma corta (de 1557 pb de
longitud) y en su forma larga (de 1668 pb) ambos genes fueron clonados en el vector de expresión
PET28a (+) bajo el control del promotor T7Lac, que dirige la producción de la proteína recombinante
con un tracto de 6 residuos de histidina en su extremo amino terminal. De esta manera, ambas enzimas
fueron expresadas en E. coli de la cepa BL21 codon Plus (DE3) de acuerdo al siguiente protocolo: se
prepara un precultivo a partir de una única colonia de dichas bacterias transformadas con el vector de
expresión PET28a (+)-Tc G6PDHcorta o PET28a (+)-Tc G6PDHlarga, en medio LB conteniendo 50
µg.ml-1 kanamicina y 10 µg.ml-1 cloramfenicol. Posteriormente se realiza una dilución 1:50 de dicho
precultivo en el mismo medio conteniendo los antibióticos antes mencionados. Se crece el cultivo a 37
ºC hasta una densidad óptica de 0.6 a 600nm, luego de lo cual se agrega isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 0.5 mM concentración final y se induce la expresión de la proteína recombinante a 28 ºC
durante 3 hs. Posteriormente se cosechan las bacterias por centrifugación a 3000 x g durante 10 min. y
el pellet se resuspende en solución amortiguadora de lisis: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM ClNa, 0.1
% Tritón X100, 2 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), 10 µM leupeptina y lisozima 1 mg.ml-1
concentración final. Una vez llevada a cabo la lisis bacteriana, el ADN se digiere mediante la incubación
con desoxirribonucleasa I (DNasa I) durante 30 min. Luego se centrifuga la muestra a 20.000 x g
durante 25 min. para obtener el extracto libre de células (todos estos procedimientos se llevan a cabo a
4 ºC).
La eficiencia en la expresión de las proteínas recombinantes se analizó inicialmente mediante la
comparación de actividades específicas y patrón de proteínas en geles de poliacrilamida entre extractos
totales (libres de células) de bacterias transformadas con el vector de expresión conteniendo el inserto:
PET28a (+)-Tc G6PDH a las cuales se les agregó IPTG para inducir la expresión de la proteína
recombinante, y los extractos obtenidos a partir de cultivos controles. Usualmente se realizan dos tipos
de controles: 1) inducidos, provenientes de bacterias transformadas con el vector de expresión sin
inserto PET 28a (+) a las cuales se les agrega IPTG ; y 2) no inducidos, provenientes de bacterias
transformadas con el vector de expresión conteniendo el inserto PET28a (+)-Tc G6PDH, pero a las
cuales no se les agrega IPTG.
*Purificación de la G6PDHcorta y G6PDHlarga recombinantes.
La purificación de las proteínas recombinantes se llevó a cabo por medio de cromatografía de afinidad
a quelatos metálicos de acuerdo al siguiente protocolo: el extracto libre de células se siembra en una
columna de Ni2+ ProBondTM (Invitrogen) equilibrada en 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM ClNa. Las
Materiales y Métodos - 126
proteínas unidas de manera inespecífica a la matriz se eliminan mediante sucesivos lavados con la solución
amortiguadora antes mencionada conteniendo 80 mM imidazol. La elución de las G6PDHs recombinantes
se lleva a cabo mediante el pasaje a través de la columna del mismo amortiguador conteniendo 300 mM
imidazol. Todos los pasos de purificación se llevan a cabo a 4ºC y el perfil de elución se monitorea
mediante la determinación de actividad enzimática. La pureza de las GPGDHs obtenidas se analiza
mediante geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata.
*Expresión y purificación de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.
Al igual que para la G6PDH de T. cruzi, la 6PGDH fue expresada en E. coli BL21 codon Plus (DE3)
utilizando el PET28a (+) como vector de expresión. El protocolo de inducción utilizado en este caso fue
esencialmente el mismo que el antes descripto para la GPGDH de T. cruzi, con la excepción de que en
lugar de llevar a cabo la inducción en medio LB a 28 ºC, en este caso dicho procedimiento se llevó a
cabo en medio mínimo M9 a 18 ºC, para disminuir la formación de cuerpos de inclusión. La lisis bacteriana,
al igual que la purificación de la proteína recombinante por columna de Ni2+, se llevaron a cabo de
acuerdo al protocolo antes mencionado, exceptuando la eliminación de las proteínas unidas de manera
inespecífica a la matriz (que en este caso se llevó a cabo mediante sucesivos lavados con 50 mM TrisHCl pH 7.5, 500 mM ClNa conteniendo 50 mM imidazol). La elución de la proteína recombinante se
realizó utilizando el amortiguador antes mencionado conteniendo 100 o 300 mM imidazol. En el caso
particular de esta enzima el agregado de un agente reductor (4 mM DTT) inmediatamente después de la
elución fue estrictamente necesario para prevenir e incluso revertir la inactivación de la enzima por
oxidación.
Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Los geles de poliacrilamida se llevaron a cabo rutinariamente en condiciones desnaturalizantes de acuerdo
a la técnica descripta por Laemmli en 1970. Las muestran son desnaturalizadas antes de su siembra
mediante el agregado de 0.1% SDS, 100 mM DTT en Tris-HCl pH 6.8 y su posterior calentamiento a
100 ºC durante 5 min. Los marcadores de peso molecular utilizados de rutina fueron: BSA (66 kDa),
ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa) y tripsinógeno (24 kDa).
Materiales y Métodos - 127
Tinción de geles de poliacrilamida.
*Tinción con Coomasie Brillant Blue.
La tinción de geles de poliacrilamida mediante ésta técnica permite la detección de cantidades relativamente
altas de proteína ya que posee baja sensibilidad (el límite de detección es de aproximadamente 500 ng
de proteína). Si bien no constituye un criterio seguro de pureza, debido a que es un método sencillo y
rápido es ampliamente utilizado en el seguimiento de sucesivos pasos de purificación enzimática y para
la determinación de masa molecular aparente de subunidad de acuerdo al método descripto por Weber
and Osborn [1969]. La tinción se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: una vez finalizada la
electroforesis, se incuba el gel durante 10 min en una solución 50 % metanol y 10 % de ácido acético
para posteriormente ponerlo en contacto durante 30 min con una solución de Coomasie Brilliant Blue
R250 al 0.2%, disuelto en 30% de metanol y 10% de ácido acético. A continuación se lleva a cabo el
desteñido del gel mediante su incubación en una solución de 30% de metanol y 10% de ácido acético
realizando sucesivos cambios cada 15 minutos.
*Tinción con nitrato de plata.
Este método de tinción es mucho más sensible que el antes mencionado ya que permite la detección de
picogramos de proteína, y esto hace que sea considerado un buen criterio de pureza. Dicha tinción se
realizó de acuerdo al siguiente protocolo: al igual que para el método anterior, una vez finalizada la
electroforesis, se incuba el gel en 50 % de metanol – 10 % de ácido acético durante 10 min, luego se lo
coloca en 7 % metanol - 5 % de ácido acético durante otros 10 min, y a continuación se lo lava con
agua bidestilada. Posteriormente se realiza la fijación de las proteínas al gel mediante su incubación
durante 15 min en una solución de glutaraldehido al 10%, luego de lo cual se descarta dicha solución y
se lava exhaustivamente durante 90 min con agua bidestilada realizando numerosos cambios. Por último
se incuba el gel en una solución de plata amoniacal (AgNO3 0.8%, NaOH 0.02N, NH3 1.4% en agua)
durante 10 min, se lava con agua bidestilada y se revela con una solución de 0.05 mg.ml-1 ácido cítrico
y 0.02 % formaldehído. El desarrollo de color se detiene mediante la acidificación con ácido acético al
50 %.
Materiales y Métodos - 128
Digestión tríptica en gel de la 6PGDH recombinante de T.cruzi.
La digestión tríptica en gel de la 6PGDH de T. cruzi se llevó a cabo de acuerdo al protocolo que se
describe a continuación: las proteínas a ser analizadas (previamente reducidas y alquiladas con
iodoacetamida) se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, se tiñe el gel con Coomasie
Brilliant Blue tal como se describió anteriormente (utilizando reactivos de alta calidad) y se recortan las
bandas correspondientes a dichas proteínas. Los bloques de gel recortados se colocan en tubos eppendorf
y se lavan dos veces con 200 µl de bicarbonato de amonio 0.2 M en 50 % de acetonitrilo durante 20
min. Posteriormente se secan completamente bajo una corriente de nitrógeno y se re-hidratan mediante
el agregado de 5 µl de bicarbonato de amonio 0.2 M en 0.02% de Tween 20. Se adicionan 5 µl de una
solución de tripsina 0.1 µg/µl, se continúa la re-hidratación del gel mediante el agregado de pequeñas
alícuotas de bicarbonato de amonio 0.2 M y se incuba durante toda la noche a 30 ºC. Al día siguiente se
lleva a cabo la inactivación de la proteasa mediante el agregado de 1/10 del volumen de ácido trifluoro
acético 10% y se separa el sobrenadante. Posteriormente se lleva a cabo la extracción de los péptidos
generados mediante la incubación de los tozos de gel con 150 µl de 0.1 % ácido trifluoro acético en 60
% de acetonitrilo durante 30 min a 30 ºC (este proceso se repite dos veces y se combinan ambos
sobrenadantes). A continuación se evapora la fase orgánica en speed-vac, y la muestra queda lista para
ser analizada.
Electrotransferencia de proteínas y Western blot.
La electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham Biosciences),
se llevó a cabo de acuerdo el siguiente protocolo: una vez finalizada la electroforesis, se equilibra el gel
y la membrana de nitrocelulosa en la siguiente solución amortiguadora: 20 mM Tris pH 7.6, 150 mM
glicina, 20 % metanol, durante 2-3 min. La transferencia se realiza a 80 mA constantes durante 1h. 15
min. o a 200 mA durante 2 hs en el amortiguador antes mencionado (las primeras condiciones se aplican
a geles de 1 mm de espesor, y las segundas a geles de 1.5 mm.). Una vez finalizada la transferencia, la
eficiencia del proceso se verifica mediante la tinción de las membranas con una solución de Rojo Ponceau
al 0.5 % en 5 % TCA.
Materiales y Métodos - 129
*Western-blots.
Los western blots se realizaron de acuerdo al protocolo que se detalla a continuación: inicialmente se
lleva a cabo el bloqueo de las membranas de nitrocelulosa mediante su incubación durante 30 min con
una solución conteniendo 3 % de leche descremada y 2 % de glicina en TBS. Luego, se incuban los
filtros en presencia del primer anticuerpo, diluido en solución de bloqueo (dicha dilución, como así
también el tiempo de incubación, dependen exclusivamente del suero a utilizar, y de la muestra a ser
analizada). Posteriormente se procede a la eliminación de los anticuerpos unidos de manera inespecífica
a la membrana mediante una serie de lavados que se detallan a continuación: 1) se realizan dos lavados
de 10 min. cada uno con TBS, 2) se efectúa un lavado de 10 min. exactos con una solución de NP40
al 0.05% en TBS, y por último, 3) se realizan dos lavados adicionales de 10 min cada uno con TBS
(para eliminar cualquier resto de detergente de la membrana). Posteriormente se incuban los filtros con
un anticuerpo capaz de reconocer la porción Fc de los primeros anticuerpos utilizados. Este usualmente
se encuentra acoplado a enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa, que permiten llevar a cabo
el revelado de las membranas mediante su incubación con el sustrato específico para dichas enzimas. En
el caso particular de este trabajo de Tesis se utilizaron rutinariamente como segundos anticuerpos,
sueros de cabra anti-conejo o anti-ratón conjugados a peroxidasa (Sigma), diluidos 1/10.000 en
solución de bloqueo. El revelado de las membranas se llevó a cabo por quimioluminiscencia mediante la
incubación de los filtros con SuperSignal®West Pico Chemiluminescent Substrate (PIERCE), y la posterior
sensibilización de placas AGFA GP-BU New Medical X-Ray Film durante 30min.
Obtención de anticuerpos anti G6PDH y 6PGDH.
Los anticuerpos específicos contra la G6PDH y la 6PGDH de T. cruzi se obtuvieron mediante la
inmunización de ratones y conejos con las proteínas recombinantes purificadas. Los animales se
inmunizaron mediante la aplicación de 4 dosis de 100 µg de proteína recombinante cada 21 días (conejos)
y 10 µg cada 15 días (ratones). En ambos casos dichas proteínas se administraron emulsionadas con
adyuvante de Freund, completo para la primera inoculación, e incompleto para las demás. Diez días
después de la cuarta dosis los animales fueron sangrados a blanco y el suero fue separado del paquete
globular mediante centrifugación a 2000 rpm durante 10 min.
Materiales y Métodos - 130
Purificación de anticuerpos específicos anti-G6PDH.
*Acople de la G6PDH recombinante a la matriz.
Los anticuerpos específicos anti-G6PDH se purificaron por cromatografía de afinidad mediante el acople
de la G6PDH recombinante de T. cruzi purificada a matrices de Sepharosa 4-B activada con bromuro
de cianógeno. Esto se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: se resuspende la cantidad deseada
de resina en HCl 1 mM teniendo en cuenta que por cada 1g de resina seca se obtienen aproximadamente
3.5 ml de matriz y que ésta posee una capacidad de unión de entre 5-10 mg de proteína.ml-1. Se lava la
resina con dicha solución durante 15 min. y posteriormente se la equilibra con 10 volúmenes de solución
amortiguadora de acople (0.1 M NaHCO3 pH 8.3, 0.5 M ClNa) mantenida a 4ºC. Este proceso debe
realizarse rápidamente para prevenir la hidrólisis alcalina de los grupos reactivos de la matriz. Luego se
la incuba durante 2 hs. con la proteína a ser acoplada disuelta en dicha solución amortiguadora y
transcurrido el tiempo de incubación se realizan sucesivos lavados de la matriz para eliminar la proteína
no unida. Posteriormente se procede a realizar el bloqueo de los grupos reactivos que no hayan unido
proteína, mediante la incubación de la matriz durante 2 hs. con una amina primaria (usualmente se utiliza
una solución de glicina 0.2 M pH 8). Por último se lleva a cabo la eliminación de aquellas proteínas que
se hayan unido de manera no covalente a matriz. Esto se realiza mediante el lavado de la misma con 10
volúmenes de una solución de acetato de sodio 0.1 M, ClNa 0.5 M pH 4, seguida por 10 volúmenes de
0.1 M NaHCO3 0.5 M ClNa pH 8.3. Este procedimiento se repite tres veces luego de lo cual se
considera que la matriz está lista para ser utilizada.
*Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad.
Este proceso se llevó a cabo utilizando la matriz de afinidad preparada en el párrafo anterior. Previamente
a su utilización la matriz se cargó en una columna plástica (BIO-RAD), se lavó mediante el pasaje de 10
volúmenes de columna de PBS y otros 10 volúmenes de glicina 0.1 M pH 2.5 y finalmente se la equilibró
en el primero. La purificación de los anticuerpos propiamente dicha se llevó a cabo de acuerdo al
siguiente protocolo: el suero conteniendo los anticuerpos a ser purificados se diluye 1/2 en PBS, se lo
siembra 3 veces en la columna y posteriormente se realiza la eliminación de anticuerpos unidos de
manera inespecífica mediante al lavado exhaustivo de la matriz con la misma solución amortiguadora
(este procedimiento se continúa hasta obtener un valor constante de A 280nm). A continuación se realiza la
elución de los anticuerpos específicos mediante el pasaje a través de la columna de glicina 0.1M pH
2.5. Para evitar la alteración de los anticuerpos debida a la marcada acidez de dicha solución
Materiales y Métodos - 131
amortiguadora, las fracciones eluídas se colectan sobre Tris-HCl 2 M pH 8.3 para neutralizar
inmediatamente la solución. En el caso particular de este trabajo de Tesis, los anticuerpos anti G6PDH
se purificaron a partir de suero de conejo. Las fracciones eluídas (de 300 µl cada una), se colectaron
sobre 150 µl de Tris-HCl 2 M pH 8.3. El perfil de elución de la columna se monitoreó mediante A 280 nm.
Posteriormente los eluídos fueron dializados en PBS en presencia de azida sódica 0.5 % durante 3 hs,
y se conservaron a 4 ºC hasta su uso.
Determinación de masa molecular aparente por filtración en gel.
*Determinación de la masa molecular aparente de la G6PDHcorta activa de T.cruzi.
La masa molecular de la G6PDHcorta activa de T. cruzi, se llevó a cabo por filtración en gel en una
columna Bio-Sil SEC 250 (BIO-RAD). Como eluyente se utilizó el siguiente amortiguador: Tris-HCl 50
mM, 0.5 mM ClNa, pH 7.0. La calibración se efectuó utilizando como marcadores de peso molecular:
tiroglubulina (670 kDa), gamma globulina (158 kDa), ovoalbúmina (44 kDa), mioglobina (17
kDa), y Blue Dextran. Las muestras y estándares de masa molecular se resolvieron a un flujo de 0.7
ml.min-1, y el perfil de elución de la columna se monitoreó por A 280 nm y determinación de actividad
enzimática.
*Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa de T. cruzi.
La determinación de la masa molecular de la 6PGDH activa de T. cruzi se llevó a cabo por filtración en
gel en una columna Superdex G 200 XK 16/40 (Amersham Biosciences) grado preparativo, de 53 ml
de matriz. Como eluyente se utilizó la siguiente solución amortiguadora: Tris-HCl 50 mM , 0.5 mM
ClNa, 4 mM DTT, pH 7.6. La calibración de dicha columna se efectuó utilizando como marcadores de
peso molecular: citocromo c (12.4 kDa), mioglobina (17 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa),
ovoalbúmina (44 kDa), seroalbúmina bovina (66 kDa), alcohol deshidrogenasa (150 kDa), β-amilasa
(200 kDa), y Blue Dextran. Las muestras y estándares de masa molecular se resolvieron a un flujo de
0.8 ml.min-1, y el perfil de elución de la columna se monitoreó por absorbancia a 280 nm y determinación
de actividad enzimática.
Materiales y Métodos - 132
Ensayos enzimáticos.
*Determinación de actividad de la G6PDH de T. cruzi.
La actividad de la G6PDH de T. cruzi se determinó rutinariamente en la dirección de la oxidación de la
G6P, monitoreando la reducción del NADP a 340 nm [Cronin y col; 1989] en un espectrofotómetro
Beckman DU®Series 600, a temperatura constante (30 ºC). Para determinaciones de actividad enzimática
con la enzima purificada, la mezcla de reacción estándar utilizada contenía 50 mM trietanolamina pH
7.5, 5 mM Cl2Mg, 0.5 mM NADP y 1 mM G6P. En el caso de extractos totales o fracciones parcialmente
purificadas donde tanto la 6PGDH como la G6PDH se encontraban presentes, la actividad de esta
última se determinó mediante la diferencia entre el valor de actividad obtenido con una mezcla de
reacción conteniendo ambos sustratos (6PG y G6P) y aquel derivado de una mezcla de reacción que
solo contenía 6PG como sustrato.
*Determinación de pH óptimo para la G6PDHcorta de T. cruzi.
Para la determinación del pH óptimo para la actividad de la G6PDHcorta recombinante de T. cruzi, se
realizaron medidas espectrofotométricas de la actividad de la enzima purificada por columna de Ni2+ en
un rango real de pH de 6 a 9.8 a concentración saturante de ambos sustratos, 1 mM G6P y 0.5 mM
NADP utilizando las soluciones amortiguadoras que se detallan a continuación: citrato de sodio pH 6 y
6.4; trietanolamina/HCl pH 7.0 a 8.4, y glicina/NaOH pH 8.8 a 9.8.
*Determinación de los parámetros cinéticos de la G6PDHcorta y G6PDHlarga de T. cruzi.
Los parámetros cinéticos correspondientes a la G6PDHcorta recombinante de T. cruzi fueron determinados
en presencia y en ausencia de DTT. Las muestras analizadas en presencia del agente reductor se incubaron
durante 10 min con 62.5 mM DTT, y posteriormente se realizaron las determinaciones de actividad
enzimática. El Km aparente para la G6P se determinó variando la concentración de dicho sustrato entre
30 y 1000 µM (manteniendo el NADP en concentración saturante, 500 µM). El Km aparente para
NADP, por su parte, se determinó variando su concentración entre 1 y 500 µM (manteniendo la G6P a
concentración saturante, 1 mM). Estas medidas se llevaron a cabo en un espectrofluorómetro AmincoBowman Series 2, midiendo la emisión de fluorescencia del NADPH (longitud de onda de excitación
340 nm, longitud de onda de emisión 450 nm), a temperatura constante (30 ºC). Las unidades arbitrarias
de intensidad de fluorescencia fueron convertidas en cantidades µmolares de NADPH, mediante la
Materiales y Métodos - 133
calibración del instrumento, a cada sensibilidad utilizada, con soluciones de NADPH de concentración
conocida.
El Km aparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDHlarga de T. cruzi se llevó a cabo
utilizando el mismo rango de concentraciones utilizado para la G6PDHcorta con la excepción de que
dichas determinaciones se realizaron únicamente en ausencia del agente reductor y las medidas se realizaron
en espectrofotómetro. En las mismas condiciones se determinó el Km aparente para G6P correspondiente
a la G6PDHnativa en extracto total de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.
Antes de llevar a cabo estas determinaciones tanto el NADP como la G6P fueron valorados. La titulación
del NADP se llevó a cabo de manera directa de acuerdo al siguiente modo: se preparó una solución 50
mM en agua bidestilada de dicho compuesto, se realizó una dilución 1/1000 del mismo, y se determinó
la absorbancia de dicha solución a 259 nm. Luego, utilizando el coeficiente de extinción molar del
NADP (18µmoles-1.ml) fue posible obtener la concentración real de la solución preparada. La titulación
de la G6P en cambio, se llevó a cabo por un método indirecto, ya que dicho sustrato no puede ser
detectado espectrofotométricamente. Para esto se utilizó la propia reacción llevada a cabo por la G6PDH,
midiendo la aparición de NADPH a 340 nm. Se trabajó con concentraciones bajas de 6PG
(aproximadamente 80 µM) y un exceso de G6PDH (se utilizó G6PDH de Leuconostoc mesenteroides
SIGMA). Se midió la A 340 nm inicial (antes del agregado de la G6P y en presencia de la enzima), y la A
340 nm
final, luego de alcanzada la meseta por consumo total del sustrato. Por último se realizó el cociente
de la diferencia entre los dos valores de A obtenidos y el coeficiente de extinción molar del NADPH
(6.22 µmoles-1.ml ) obteniéndose así los µmoles NADPH generados durante la reacción, que tienen
correlación directa con los µmoles de sustrato (G6P) consumidos, ya que la presente reacción es
1mol:1mol.
*Determinación de actividad de la 6PGDH de T. cruzi
Las determinaciones de actividad enzimática se llevaron a cabo en la dirección de la decarboxilación
oxidativa del 6-fosfogluconato (6PG), monitoreando la reducción del NADP a 340 nm [Cronin y col;
1989]. Rutinariamente las medidas se llevaron a cabo en un espectrofotómetro Beckman DU® Series
600, a temperatura constante (30ºC), utilizando cubetas de cuarzo de 100 µl de capacidad. Las mezclas
de reacción estándar contenían: 50 mM trietanolamina pH 7.5, 5 mM Cl2Mg, 0.5 mM NADP y 1 mM
6PG.
Materiales y Métodos - 134
*Determinación de pH óptimo para la 6PGDH de T. cruzi
Para la determinación del pH óptimo para la actividad de la 6PGDH recombinante mutada de T. cruzi,
se realizaron medidas espectrofotométricas de la actividad de la enzima en un rango real de pH de 6.3
a 9.7 a concentración saturante de ambos sustratos, 1 mM 6PG y 0.5 mM NADP. Esto se llevó a cabo
utilizando la enzima recombinante purificada por columna de Ni2+ (tal como se describe más arriba), en
presencia de diferentes soluciones amortiguadoras: citrato de sodio pH 6; imidazol/HCl pH 6.3 y 6.8;
trietanolamina/HCl pH 7.5 y 8.4, y glicina/NaOH pH 8.8 y 9.8. Todas ellas se utilizaron a una
concentración final de 50 mM. Para descartar efectos de inhibición o activación de la enzima por la
composición de los diferentes amortiguadores utilizados, se combinaron todos ellos a una concentración
de 50 mM cada uno, para determinar la actividad de la enzima a pH 7.5 y 7.8. Los valores así
obtenidos fueron comparados con los alcanzados mediante la utilización de soluciones del mismo valor
de pH pero de un único componente. Los estudios de la estabilidad de la enzima a los distintos valores
de pH se llevaron a cabo incubando la proteína recombinante, durante 10 min a 4 ºC en la mezcla de
reacción conteniendo todos los reactivos excepto el 6PG, e iniciando la reacción mediante el agregado
de dicho sustrato. En todos los casos el pH real de la reacción se determinó en muestras simuladas
conteniendo todos sus componentes excepto la enzima.
*Determinación de los valores de Km aparentes y reales para la 6PGDH de T. cruzi. Perfiles de
inhibición.
Para la determinación del Km aparente, para ambos sustratos, de ambas enzimas recombinantes (salvaje
y doble mutante) y de la enzima nativa parcialmente purificada, las concentraciones de 6PG y NADP
se variaron entre 3 y 90 µM, y entre 2 y 40 µM, respectivamente. En ambos casos el otro sustrato se
mantuvo a una concentración fija: 500 µM NADP, y 1 mM 6PG. Dichos ensayos se llevaron a cabo
utilizando como amortiguador 50 mM trietanolamina pH 7.5, en un espectrofluorómetro AmincoBowman Series 2, midiendo la emisión de fluorescencia del NADPH (longitud de onda de excitación
340 nm, longitud de onda de emisión 450 nm), a temperatura constante (30 ºC). Las unidades arbitrarias
de intensidad de fluorescencia fueron convertidas en cantidades µmolares de NADPH, mediante la
calibración del instrumento, a cada sensibilidad utilizada, con soluciones de NADPH de concentración
conocida. Los ensayos cinéticos llevados a cabo para la determinación de los valores de Km real para
sustrato y cofactor de la 6PGDH recombinante de T. cruzi, se realizaron variando las concentraciones
de 6PG entre 15 y 90 µM, manteniendo el NADP en 4 concentraciones fijas (6, 12, 24 y 36 µM). Los
Materiales y Métodos - 135
valores de Km real se determinaron a partir de los gráficos secundarios de las pendientes y ordenadas la
origen de las rectas obtenidas a partir de las representaciones de Lineweaver-Burk
A su vez, para llevar a cabo la determinación de los parámetros cinéticos de la enzima, los sustratos
fueron previamente valorados. El NADP se tituló de manera directa tal como se describió anteriormente.
La titulación del 6PG en cambio, se llevó a cabo por un método indirecto, ya que dicho sustrato no
puede ser detectado espectrofotométricamente. Para esto se utilizó la propia reacción llevada a cabo
por la 6PGDH, midiendo la aparición de NADPH a 340 nm. Se trabajó con concentraciones bajas de
6PG (aproximadamente 160 µM) y un exceso de 6PGDH. Se midió la A 340 nm inicial (antes del agregado
del 6PG, y en presencia de la enzima), y la A 340 nm final, luego de alcanzada la meseta por consumo total
del sustrato. Por último se realizó el cociente de la diferencia entre los dos valores de A obtenidos y el
coeficiente de extinción molar del NADPH (6.22 µmoles-1.ml ) obteniéndose así los µmoles NADPH
generados durante la reacción, que tienen correlación directa con los µmoles de sustrato (6PG)
consumidos, ya que la presente reacción es 1mol:1mol.
*Estudios de inhibición.
Se estudió el efecto inhibitorio de varios compuestos sobre la actividad de la 6PGDH de T. cruzi. Esto
se llevó a cabo mediante la determinación de actividad enzimática (en presencia de distintas
concentraciones del agente inhibidor), variando las concentraciones de 6PG o NADP+ mientras se
mantenía el otro sustrato en cantidades saturantes. Estas medidas también fueron llevadas a cabo en
espectrofluorómetro a temperatura constante 30 ºC, utilizando trietanolamina 50 mM pH 7.5 como
amortiguador.
Determinación de concentración proteica.
La determinación de la concentración de proteínas de los distintos tipos de muestras analizados se llevó
a cabo por el método de Bradford [1996], utilizando seroalbúmina bovina (BSA) como estándar.
Materiales y Métodos - 136
Modelado molecular de la 6PGDH de T. cruzi.
El modelado molecular de la G6PDH de T. cruzi se llevó a cabo utilizando la estructura tridimensional
de cada uno de los monómeros de la 6PGDH de T. brucei como templado (códigos ExPDB: 1PGJA y
1PGJB), utilizando el servidor automático de modelado de proteínas por homología (SWISS-MODEL)
[Guex y col; 1997] [Peitsh; 1995] [Peitsh; 1996].
Preparación del ARN total de parásitos mediante el método de TRIZOL®
El ARN total de los distintos estadíos de T. cruzi clon Cl Brener se extrajo de acuerdo al siguiente
protocolo: 109 epimastigotes lavados con PBS o bien 109 tripomastigotes metacíclicos, tripomastigotes
de cultivo o amastigotes se resuspenden en 3 ml o 1 ml respectivamente de reactivo de TRIZOL®
(GIBCO BRL, Life Technologies) que es una solución homogénea de fenol e isotiocianato de guanidinio.
Dicho reactivo produce la lisis celular manteniendo en todo momento la integridad del ARN. Una vez
resuspendidos los parásitos se los incuba durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la disociación
completa de los complejos nucleoproteína. Posteriormente se agregan 0.2 ml de cloroformo por cada 1
ml de TRIZOL® se agita vigorosamente durante 15 seg, se incuba la muestra en hielo de 2 a 3 min. y
luego se centrifuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 ºC. Se separa el sobrenadante (fase acuosa) que
contiene el ARN y se lo precipita mediante el agregado de isopropanol, en una relación de 0.5 ml de
dicho compuesto por cada 1 ml de TRIZOL® utilizado. Se incuba la muestra en hielo 10 min. y
posteriormente se la centrifuga a 12.000 x g durante 20 min. Se remueve el sobrenadante y se lava el
precipitado con etanol 75 %. Se seca brevemente el pellet y luego se resuspende el ARN en 25 mM
EDTA, 0.1 % SDS. La cuantificación del ARN obtenido se realiza midiendo la absorbancia de la
muestra a 280 y 260 nm. Es deseable que la relación A260/A280 sea mayor a 1.8, lo que indica bajo
contenido proteico en la muestra, y buena solubilización de la misma. La integridad del ARN purificado
se corrobora mediante electroforesis en geles de agarosa (1.2-1.5 %).
Materiales y Métodos - 137
Transcripción reversa, síntesis de la primera hebra de ADNc.
A partir del ARN total de parásitos extraído tal como se detalló anteriormente, se realizó la síntesis de la
primera hebra de ADNc. Esto se llevó a cabo se acuerdo al siguiente protocolo: se incuban 5 µg de
ARN total, con 500 ng de un oligonucleótido anti sentido durante 10 min. a 72 ºC, posteriormente se
enfría la muestra y se agrega DTT, dNTPs y 200 U de la transcriptasa reversa SuperScript II (GIBCO
BRL) en la solución amortiguadora correspondiente a la enzima, se incuba a 42 ºC durante 60 min, y
finalmente se detiene la reacción mediante el calentamiento de la muestra a 90ºC durante 10 min. El
ADNc así sintetizado se conserva a -20ºC hasta su uso.
Preparación de ADN total de T. cruzi .
El ADN total de epimastigotes de T.cruzi clon CL Brener se extrajo de acuerdo al siguiente protocolo:
se cosechan los parásitos por centrifugación a 3500 rpm durante 10 min, se lava el pellet con solución
amortiguadora Tris HCl 10 mM pH 7.6, y se lo resuspende (a razón de 10 ml de solución por cada 1 gr.
de pellet) en el mismo amortiguador conteniendo 100 mM ClNa; 100 mM EDTA y 1 % SDS para
producir la lisis celular. Posteriormente se agrega proteinasa K a una concentración final de 100 µg.mly se incuba toda la noche a 50 ºC luego de lo cual se agrega RNAsa, concentración final 100 µg.ml-1,
1
y se incuba durante 2 hs más a 37 ºC. Por último se realiza la eliminación de las proteínas presentes en
la muestra mediante sucesivas extracciones con fenol (equilibrado en Tris-HCl pH 8), y fenol:cloroformo
(1:1). Esto se repite hasta la completa desaparición de la interfase blanca (proteica), presente entre la
fase acuosa y la orgánica. Posteriormente se realiza una última extracción con 1 volumen de cloroformo:
alcohol isoamílico (24:1), y se precipita el ADN con 2.5 volúmenes de etanol 100%. El precipitado se
lava con etanol 70% y se resuspende en agua milli Q autoclavada. La cuantificación del ADN obtenido
se realiza mediante la determinación de A 260nm.
Materiales y Métodos - 138
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Rutinariamente las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µl, utilizando 0.2 U
de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen, Life Technologies) por reacción (en la solución
amortiguadora provista por el fabricante). La concentración de Cl2Mg se ajustó a cada reacción en
particular, siendo sin embargo 1.5 mM la concentración final más utilizada. Cada reacción de PCR
contenía además 240 ng de cada uno de los oligonucleótidos, y 0.2 mM de cada uno de los
deoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP, dGTP). Las condiciones generales de las reacciones
llevadas a cabo, involucran los siguientes pasos: 1) Desnaturalización del ADN por calentamiento a 94
ºC durante 5 min. 2) Ciclado (por lo general se utilizaron 35 ciclos) y comprende 3 pasos: Adesnaturalización a 94 ºC durante 45 seg. B-Pegado del oligonucleótido, (la temperatura utilizada
está relacionada con la longitud y composición del mismo) durante 45 seg. y C-Elongación a 72 ºC (el
tiempo de elongación depende del tamaño del inserto a amplificar, y se lo calcula a razón de 1 min por
cada kpb). 3) Extensión final, a 72 ºC durante 10 min.
*Colony PCR.
La técnica de colony PCR es un método rápido de detección de presencia de inserto en un determinado
plásmido, a partir de colonias bacterianas individuales crecidas en LB-agar en presencia de antibiótico.
Dicha técnica se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: se pica parte de la colonia con una
punta de pipeta estéril, y se la resuspende en agua Milli Q autoclavada. Se lisan las bacterias mediante
calentamiento a 90-100 ºC durante 10 min., y luego se centrifuga 10 min a 14.000 rpm . 5µl del
sobrenadante se utilizan como molde para llevar a cabo la reacción de PCR de acuerdo al protocolo
antes mencionado, con la excepción de que el volumen final de la reacción se reduce a 25 µl.
*Mutación del gen de 6PGDH.
El gen de la 6PGDH de T. cruzi clonado en el vector de expresión pET28a(+) fue sometido a dos
mutaciones por PCR mediante la utilización del kit QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis
(Stratagene). Mediante este método es posible realizar mutaciones puntuales dentro de una secuencia
de ADN sin la necesidad de poseer un vector específico; es un método rápido que se lleva a cabo en
cuatro pasos y posee una eficiencia mayor al 80 %. Esta técnica se realizó de acuerdo al siguiente
protocolo: para cada mutación se diseñaron dos oligonucleótidos totalmente complementarios entre si
conteniendo la base a ser mutada en el centro de dicha secuencia. De esta manera, para la mutación
Materiales y Métodos - 139
C257R, se utilizó el siguiente oligonucleótido: 5´-GAACACGTCAAGGACCGTATTGGTTCTAAAG3´ y su complementario. El que se muestra a continuación, en cambio, fue utilizado para realizar la
mutación V244D 5´-GCGCGTGCCAAGGATGCGGATGGCAGC-3´ (en ambos casos la base sujeta
a reemplazo se marca con negrita). La reacción de PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:
como molde se utilizaron 10 ng de plásmido purificado por la técnica de mini prep a partir de bacterias
con capacidad de metilar el ADN, 125 ng de cada uno de los oligonucleótidos antes mencionados, 0.2
mM de cada uno de los dNTPs, y 2.5 U de Pfu Turbo DNA polimerasa (Stratagene), en el buffer de
reacción para la enzima. En estas condiciones la polimerasa replica ambas hebras del plásmido con alta
fidelidad, a razón de 2 min/kpb, sin desplazar a los oligonucleótidos que contienen la mutación. Estos
últimos son extendidos durante el tiempo de ciclado generándose así un plásmido mutado no circular, ya
que posee un corte entre el extremo 5´ del oligonucleótido, y el 3´del plásmido amplificado. Una vez
finalizado el ciclado, el producto de PCR se trata durante 1 hora a 37ºC con 10 U de la enzima Dpn I,
que posee la capacidad de degradar el ADN metilado y hemi metilado, (en este caso degradará el ADN
del plásmido parental, no mutado). Posteriormente se transforman E.coli XL1-Blue con 1 µl del producto
anterior, para llevar a cabo la circularización del plásmido, ya que dichas bacterias poseen los mecanismos
necesarios de reparación del ADN. A continuación se corrobora la presencia de la mutación mediante
secuenciación. Para el caso de la 6PGDH de T. cruzi, las mutaciones se realizaron de a una por vez. En
primera instancia se llevó a cabo la mutación V244D, una vez confirmada, dicho plásmido se utilizó
como molde para la segunda mutación C257R. El plásmido doble mutante así obtenido fue utilizado
para transformar E. coli BL21 Codon Plus, para llevar a cabo la expresión de la proteína recombinante
tal como se explica más adelante.
Digestión de ADN genómico con enzimas de restricción.
El ADN genómico obtenido tal como se mencionó anteriormente fue sometido a digestión con enzimas
de restricción de acuerdo al siguiente protocolo: se colocan 5 µg de ADN total por reacción en presencia
de la solución amortiguadora correspondiente a la enzima de restricción a utilizar y seroalbúmina bovina
(si es necesario) en un volumen final de 27 µl. Se incuba de 5-10 min a 65 ºC hasta obtener una
completa homogenización de la muestra, y luego se la coloca en hielo durante 30 min. Posteriormente se
agrega 1µl de la enzima de restricción diluida 1/2 en su respectivo amortiguador, se homogeniza y se
incuba a la temperatura de trabajo de la enzima durante 1 hora luego de lo cual se adiciona nuevamente
Materiales y Métodos - 140
1µl de la enzima diluida 1/2 y se incuba durante 3 hs más a la misma temperatura. Para asegurar una
digestión completa del ADN, se agrega 1µl de la enzima sin diluir, se homogeniza nuevamente la muestra
y se incuba durante toda la noche. La inactivación de las enzimas se lleva a cabo por calentamiento a 65
ºC durante 10 min o mediante extracciones de la muestra con fenol-cloroformo. La eficiencia de la
digestión se verifica mediante electroforesis en geles de agarosa 0.8 %.
Marcación de sondas por PCR.
Las sondas utilizadas en los experimentos de Southern blot y Northern blot, fueron marcadas por PCR
con dCTP32 de acuerdo al siguiente protocolo: el fragmento de DNA a ser utilizado como sonda se
amplifica mediante una reacción de PCR convencional (fría) y se lo purifica a partir de geles de agarosa
mediante QIAEX II Agarose gel extraction kit (QIAGEN®). 10 ng del fragmento purificado se utilizan
como molde para llevar a cabo la PCR radiactiva donde se utilizan 200 ng de cada uno de los
oligonucleótidos especificos, dATP, dGTP y dTTP a una concentración de 1 µM final cada uno, 1.5 mM
Cl2Mg, 50 µCi de dCTP32 y 0.2 U de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen, Life Technologies)
en el amortiguador correspondiente a la enzima. Una vez finalizada la amplificación se procede a la
separación de la sonda de los nucleótidos libres mediante columnas de filtración en gel de SephadexG50 equilibradas en amortiguador TE. Previo a su inyección la sonda se desnaturaliza durante 5 min a
95ºC.
Southern blot.
La técnica de Southern blot se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descripto en Sambrook y col
[1989]: los fragmentos de ADN genómico obtenidos mediante digestión con enzimas de restricción, se
separan electroforéticamente en geles de agarosa 0.8 % de 0.5 cm de espesor, conteniendo bromuro de
etidio. La electroforesis se lleva a cabo en amortiguador TBE 0.5 x a 2 V/cm. Una vez finalizada la
misma, se fotografía el gel y se lo coloca en una solución desnaturalizante (0.5 N NaOH, 1.5 M ClNa)
durante 45 min. Posteriormente se lleva a cabo la neutralización del gel mediante su incubación durante
50 min en una solución de Tris HCl 1 M, pH 7.4, 1.5 M ClNa. Los fragmentos de ADN son
Materiales y Métodos - 141
posteriormente transferidos a membranas de Nylon (HybondTM N+, Amersham LIFE SCIENCE), por
capilaridad, durante toda la noche, utilizando como amortiguador SSC 10X. Una vez finalizado el tiempo
de transferencia, se enjuaga el filtro con una solución SSC 2x y se fija el ADN a la membrana mediante
su exposición a luz ultravioleta (en el caso particular de este trabajo de Tesis esto se llevó a cabo
mediante la utilización de un aparato CL 1000 utraviolet crosslinker UVP y la intensidad de la luz
ultravioleta utilizada fue de 120.000 µJ/cm2 durante 30 seg). A continuación se lleva a cabo la prehibridización de la membrana (para evitar el pegado inespecífico de la sonda) mediante su incubación
en una solución conteniendo 6 X SSC, 1 % SDS, 10 X reactivo de Denhardt y 250 µg.ml-1 de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado (Sigma) durante 3 hs a 65 C. Posteriormente se inyecta la sonda y
se incuba toda la noche en baño termostatizado. La temperatura de incubación de este paso depende de
la naturaleza de la sonda (para el caso particular de sondas homólogas la temperatura usualmente utilizada
es 64 ºC). Una vez finalizada la hibridización se procede llevar a cabo sucesivos lavados de la membrana
mediante la utilización de una solución 0.2 X SSC, 0.1 % de SDS a 63 ºC (en condiciones de alta
astringencia). Posteriormente se realiza la detección de la señal mediante la sensibilización de placas
radiograficas AGFA GP-BU New Medical X-Ray Film.
Northern blot
La técnica de Northern blot se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descripto por Fourney y col
[1978]: el ARN total extraído tal como se describió anteriormente, es separado por electroforesis en
condiciones desnaturalizantes, en geles de agarosa 1.5 % conteniendo 0.66 M de formaldehído. Se
colocan de 10-30 µg de RNA total por muestra disuelto en una solución conteniendo formamida
deionizada, formaldehído, glicerol, bromuro de etidio y azul de bromofenol, en MOPS 10 x como
solución amortiguadora. La electroforesis se lleva a cabo en dicho amortiguador a 80V constantes
durante 4-5 hs. Una vez finalizada la misma, se fotografía el gel, y posteriormente se lo equilibra durante
40 min. en 10 x SSC para posteriormente llevar a cabo la transferencia. Esta última se realiza por
difusión pasiva durante toda la noche utilizando membranas de Nylon (HybondTM N+, Amersham LIFE
SCIENCE), de acuerdo al mismo protocolo antes descripto para la técnica de Southern blot, al igual
que la fijación del ARN a la membrana, la pre-hibridización , hibridización y lavado de los filtros.
Materiales y Métodos - 142
Electroforesis en campo pulsante (Pulse Field gel electrophoresis)
La separación de los cromosomas de epimastigotes de T. cruzi, clon CL Brener mediante electroforesis
en campo pulsante se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo:
*Preparación de las muestras.
Se cosechan epimastigotes de T. cruzi del clon CL Brener mediante centrifugación, se los lava con
PBS-G y se los resuspende en la misma solución amortiguadora a una concentración de 109 células/ml.
Luego los parásitos se diluyen en igual volumen de agarosa de bajo punto de fusión al 1 % y se los
distribuye en soportes pre-armados (BIO-RAD) a razón de 40 x 106 células por pocillo. Una vez
solidificados los bloques de agarosa son tratados con solución amortiguadora de lisis: 0.5 M EDTA pH
9.5, 1 % Sarcosil, 20 mg.ml-1 de proteinasa K durante 48 hs a 50 ºC, para llevar cabo la lisis celular y la
degradación de las proteínas. Posteriormente los bloques son lavados con 10 mM Tris-HCl pH 8, y son
finalmente almacenados en 0.5 M EDTA pH 8 a 4 ºC hasta su uso.
*Electroforesis y detección de los genes de la G6PDH de T. cruzi.
La separación de los cromosomas obtenidos en el paso anterior se llevó a cabo en un gel de agarosa 1.2
% a 14 ºC en un aparato CHEF-DR®III Pulse Field Electrophoresis System (BIO-RAD) utilizando
como solución amortiguadora TBE 0.5 X. La corrida electroforética se llevó a cabo a 4 V.cm-1 de
acuerdo a los siguientes parámetros: Bloque 1) Tiempo de corrida: 24 hs, ángulo 120º, tiempo de rampa
60-120 seg. Bloque 2) Tiempo de corrida: 24 hs, ángulo 120º, tiempo de rampa 120-350 seg. Una vez
finalizada la electroforesis, los cromosomas fueron teñidos con bromuro de etidio y fotografiados. Antes
de llevar a cabo la desnaturalización del ADN, se realizó la depurinación del mismo mediante la incubación
del gel en presencia de una solución 0.2 N de HCl, (esto se lleva a cabo con la finalidad de fragmentar
el ADN para favorecer su transferencia). Posteriormente el gel se lavó con agua deionizada durante 5
min, y se realizó la desnaturalización y neutralización del mismo tal como se describe en el protocolo de
Southern blot. Finalmente se llevó a cabo la transferencia a membranas de Nylon (HybondTM N+,
Amersham LIFE SCIENCE) por difusión pasiva tal como se describió anteriormente. El bloqueo,
hibridización y lavado de los filtros se llevó a cabo tal como se describió en los protocolos de Southern
blot y Northern blot.
Materiales y Métodos - 143
Microscopía de fluorescencia.
* Inmunofluorescencia indirecta utilizando segundos anticuerpos acoplados a fluoróforos.
Las inmunofluorescencias indirectas correspondientes a los distintos estadíos del ciclo de vida de T.
cruzi, se llevaron acabo de acuerdo al siguiente protocolo: cubreobjetos de 20 mm x 20 mm
(MARIENFELD) previamente lavados con metanol son tratados durante 10 min con una solución
0.25 mg.ml-1 de poli-L-lisina. Se retira dicha solución y se colocan 200 µl de una suspensión de parásitos
2.5 x106.ml-1 en PBS durante 10 min para llevar a cabo la adhesión de las células a la superficie del
vidrio. Luego se realiza la fijación de los parásitos mediante su incubación durante 10 minutos con una
solución de paraformaldehído al 4% y posteriormente se lavan los preparados con 200 µl de PBS (dos
veces). Luego se los incuba en presencia de ClNH4 25 mM durante 10 min (para disminuir la señal de
fondo del paraformaldehido) y se los lava nuevamente con PBS. A continuación se lleva a cabo el
bloqueo de los preparados, mediante su incubación durante 30 min con una solución conteniendo 2 %
de BSA, 2% del suero normal (del animal a partir del cual se obtuvieron los segundos anticuerpos) y 0.1
% saponina en PBS (este detergente se adiciona para permeabilizar la membrana celular). Posteriormente
se realiza la incubación de los parásitos con el primer anticuerpo (diluído en solución de bloqueo)
durante 1 hora, luego de lo cual se lavan exhaustivamente los preparados por inmersión para llevar a
cabo a continuación, la incubación (durante 1 hora) con el segundo anticuerpo y 4’,6’-diamidino-2
fenilindol (DAPI), diluídos también en solución de bloqueo. Este último es un agente utilizado para la
marcación del ADN nuclear y mitocondrial debido a su capacidad de unirse específicamente al ADN.
Por último, se lleva a cabo un lavado exhaustivo de los preparados con PBS, y finalmente se los monta
sobre portaobjetos con 15 µl de Fluor Save (CALBIOCHEM®).
Los preparados controles se realizan de acuerdo al protocolo antes mencionado con la excepción de
que en lugar del primer anticuerpo, se coloca suero normal del animal a partir del cual éstos fueron
obtenidos.
En el caso particular de este trabajo de Tesis los segundos anticuerpos utilizados (en dilución 1/1000)
fueron anti conejo o anti ratón obtenidos en cabra conjugados con isotiocianato de fluoresceína o tetrametil
rodamina (Alexa Fluor ® 488 o 546 (H+L) highly cross adsorbed ) Molecular Probes. Para la marcación
de núcleo y kinetoplasto se utilizó DAPI-dilactato (Molecular Probes) en una concentración final de 5
µg.ml-1. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio Nikon Eclipse E600, mediante una cámara
digital Spot RT Slider Modelo Nº 2.3.1 (Diagnostic Instruments Inc; USA).
Materiales y Métodos - 144
*Marcación del bolsillo flagelar de epimastigotes de T. cruzi y co-localización con la G6PDH.
Para llevar a cabo la marcación del bolsillo flagelar de epimastigotes de T. cruzi, 107 parásitos
(resuspendidos en 1 ml de medio BHT sin suero), se incuban durante 15 seg a temperatura ambiente
con 100 µg de Concanavalina-A conjugada con tetrametil rodamina (Molecular Probes). A continuación
se lleva a cabo la fijación de los mismos mediante su incubación durante 10 min con una solución de
paraformaldehído 4% luego de lo cual los parásitos son adheridos a cubre-objetos pre-tratados con
poli-L-lisina tal como se describió anteriormente. A partir de este punto se continúa con el protocolo
convencional de inmunofluorescencia antes mencionado.
*Marcación de aparato de Golgi en epimastigotes de T. cruzi y co-localización con la G6PDH.
Para realizar la marcación del complejo de Golgi de epimastigotes de T. cruzi, 107 parásitos (resuspendidos
en 1 ml de medio BHT sin suero) se incuban durante 1h a 4 ºC, en presencia de BODIPY®TR C5ceramida complejada con BSA (Molecular Probes) a una concentración final de 5 µM. Posteriormente
los parásitos se lavan con BHT sin suero, y se incuban durante 30 min a 28 ºC, para permitir la acumulación
de la ceramida en el complejo de Golgi. A continuación los parásitos se fijan con paraformaldehído 4 %
como se describió anteriormente y se adhieren a cubreobjetos pretratados con poli-L-lisina. Luego se
lleva a cabo la inmunolocalización de la G6PDH de T. cruzi de acuerdo al protocolo convencional de
inmunofluorescencia antes mencionado.
Transfección de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.
Epimastigotes de T. cruzi clon Cl Brener fueron transfectados con el vector pTEX-GFP y pTEXG6PDHcorta-GFP, de acuerdo al siguiente protocolo: se cultivan los parásitos en medio BHT suplementado
con 10 % de suero fetal bovino a 28 ºC. Una vez alcanzada la fase logarítmica de crecimiento se
cosechan por centrifugación a 3500 g durante 10 min y se los resuspende en el mismo medio (sin suero)
a una concentración de 8 x 108 células.ml-1. A continuación 350 µl de la suspensión de parásitos se
incuban durante 10 min en hielo en presencia de 40 µg de plásmido para posteriormente llevar a cabo la
electroporación mediante la aplicación de un pulso único de 335 V, 1400 µfaradios y 24 ohms. Las
células asi electroporadas se incuban durante 5 min. en hielo y luego se diluyen hasta un volumen final de
3 ml en BHT suplementado con 10 % de suero fetal bovino. 48 hs. después de la transfección se agrega
Materiales y Métodos - 145
G418 (Geneticina, GIBCO) a una concentración final de 50 µg.ml-1. Los transformantes se seleccionan
gradualmente mediante el aumento en la concentración del antibiótico hasta llegar a una concentración
final de 100 µg.ml-1 a las cuatro semanas. En los parásitos controles, el ADN plasmídico fue reeemplazado
por agua. Para la detección de los transformantes por inmunofluorescencia, 5 x 105 parásitos de cada
uno de los cultivos fueron adheridos a cubreobjetos previamente tratados con poli-L-lisina, para luego
llevar a cabo la fijación de los mismos y marcación del ADN nuclear y mitocondrial, tal como se describió
con anterioridad. En el caso de las co-localizaciones con el aparato de Golgi, los parásitos transfectados
fueron incubados con BODIPY®TR C5-ceramida complejada con BSA (Molecular Probes) de acuerdo
al protocolo descripto más arriba.
Análisis de la expresión de la G6PDH frente a estrés oxidativo en epimastigotes y
tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.
La expresión de la G6PDH en respuesta a condiciones de estrés oxidativo generado por H2O2 se llevó
a cabo con epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi purificados por cromatografía de
intercambio iónico (DEAE-celulosa). Debido a que el H2O2 puede reaccionar con distintos componentes
de los medios de cultivo convencionales haciendo imposible determinar la concentración real de dicho
compuesto en la solución, los experimentos se llevaron a cabo incubando los parásitos en una solución
amortiguadora denominada IB (5 mM ClK, 80 mM ClNa, 2 mM Cl2Mg, 16.2 mM Na2HPO4, 3.8 mM
NaH2PO4, 50 mM glucosa, pH 7.4, 0.15 % seroalbúmina bovina (W/V)) conteniendo 200 mg/L de
rojo fenol (este último compuesto se utiliza como indicador de la reacción enzimática empleada para la
determinación de la concentración de H2O2 en la solución). Esto se llevó a cabo tal como se detalla a
continuación: se prepara una curva de calibración en solución amortiguadora IB con distintas
concentraciones de H2O2 a partir de una solución stock previamente titulada mediante la determinación
de absorbancia a 230 nm (coeficiente de extinción molar 81 M-1.cm). 100 µl correspondientes a cada
uno de los puntos de la curva de calibración se colocan en tubos eppendorf a los cuales se les adiciona
1 µl de una solución (12 mg/ml) de peroxidasa equina (SIGMA) y se incuba a 37 ºC durante 5 min luego
de lo cual se detiene la reacción mediante el agregado de 2 µl de NaOH 2 M y se determina A 610 nm. La
concentración real de H2O2 en la solución conteniendo los parásitos se lleva a cabo a partir de la curva
de calibración antes mencionada La determinación de su valor de A 610 nm se realiza de acuerdo al
protocolo mencionado con anterioridad con la excepción de que previamente al agregado de la peroxidasa
Materiales y Métodos - 146
la muestra se centrifuga a 5000 rpm durante 10 min para precipitar los parásitos y llevar a cabo las
determinaciones con el sobrenadante.
Los experimentos de estrés oxidativo propiamente dichos se llevaron a cabo de acuerdo al protocolo
que se detalla a continuación: epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos purificados (previamente
lavados dos veces con solución amortiguadora IB) se resuspenden en dicha solución a razón de 107
células/ml. 14 ml de la suspensión de parásitos (1.4 x108 células) se centrifugan a 4000 rpm durante 5
min, se descarta el sobrenadante, el pellet se lava dos veces con Tris HCl 50 mM pH7.6, 1 mM EDTA,
100 µM E64 y 0.5 mM TLCK, y se congela a –70 ºC hasta su procesamiento (este punto es considerado
T0). Otros 80 µl de la suspensión se separan para llevar a cabo inmunofluorescencias de acuerdo al
protocolo descripto con anterioridad. Al resto de la suspensión de parásitos se le adiciona H2O2 hasta
una concentración final de 20 o 70 µM para epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos respectivamente.
Inmediatamente después 100 µl de la misma se toman para la determinación de la concentración inicial
real de H2O2 de acuerdo al protocolo mencionado con anterioridad. Este procedimiento se repite cada
30 min a lo largo de todo el experimento para seguir la disminución en la [H2O2] debido al metabolismo
celular. En los experimentos llevados a cabo con trimastigotes metacíclicos a las 4, 5 y 6 hs posteriores
a la adición del H2O2 se separan 14 ml de muestra se precipitan los parásitos por centrifugación (tal
como se mencionó anteriormente), se lava el pellet con Tris HCl 50 mM pH7.6, 1 mM EDTA, 100 µM
E64 y 0.5 mM TLCK, y se congela a –70 ºC hasta su procesamiento. También en cada uno de dichos
intervalos de tiempo se aíslan 80 µl de muestra para llevar a cabo inmunofluorescencias. Una vez finalizada
esta parte del experimento se realiza la obtención de los extractos totales libres de células de cada uno
de los pellets de parásitos mediante congelamiento y descongelamiento. Se determina la actividad
correspondiente a la 6PGDH y G6PDH como así también la concentración de proteína total en las
mismas. Finalmente se siembran los extractos totales en geles de poliacrilamida 7.5 %, se los transfiere
a filtros de nitrocelulosa y se llevan a cabo ensayos de Western Blot. Los experimentos controles se
realizaron mediante la incubación de los parásitos en solución amortiguadora IB pero en ausencia de
H2O2. Las muestras se tomaron a los mismos intervalos de tiempo y se analizaron mediante la
determinación de actividad enzimática para ambas deshidrogenasas.
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