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TECNICAS
INMUNOLOGICAS
PRIMARIAS
Bioq. Esp. Federico Payes Monzón
Cátedra de Inmunología 2014
EL LABORATORIO DE HORMONAS
Fase analitica
Inmunoanalisis o
Inmunoensayos
Otras técnicas
•Conjunto de operaciones relacionadas en forma directa con
la realización de las mediciones de los analitos
• El inmunoanálisis es el método más empleado para la
cuantificación de la mayor parte de las hormonas y de
anticuerpos.
• Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), análisis
de catecolaminas y sus metabolitos
•Cromatografía de gases conectada a Espectrometría de
masas, método de referencia hormonas esteroideas
La medición de las interacciones Ag-Ac con fines diagnósticos se
realizan por 2 vías
Dx directo
Utilización de Acs específicos
para detectar Ag
Dx. indirecto
Utilización de Ags específicos
para detectar Acs
ETAPAS DE LA REACCIÓN AG-AC
Para observarla se aplican técnicas que utilizan marcadores
INMUNOANÁLISIS O INMUNOENSAYOS
Analitos
•Antígenos
(hormonas)
•Anticuerpos
Interacción
primaria
•Antigeno –
Anticuerpo
•Sustancia
marcadora
•Metodos de
marcación
•Tipos de
técnica
Interpretación
del resultado
•Sensibilidad
•Especificidad
•Errores
ANALITOS
Anticuerpos
 Antigenos:

 Presentes
naturalmente Ej Hormonas, CD
 No presentes naturalmente Ej drogas de abuso
 De procesos patológicos: Antigenos tumorales,
microbianos
MEDICION DE LA INTERACCIÓN PRIMARIA

Inmunoanálisis homogeneos





El compuesto marcado presenta un comportamiento diferente según se
halle o no unido a un anticuerpo.
No requieren separación física de las fracciones ligadas (Ac-Ag*) y libres
(Ag*) antes de la medición
Se desarrollan en fase líquida.
Ej Hormonas, medicamentos, drogas de abuso.
Inmunoanalisis heterogeneos




El compuesto marcado presenta igual comportamiento este libre o
unido a un anticuerpo .
Requieren separación física de las fracciones ligadas (Ac-Ag*) y libres
(Ag*) antes de la medición
Requiere soporte sólido
Ej Ag microbianos
SEGÚN LA DISPONIBILIDAD DEL REACTIVO

Competitivos (modulacion de actividad)
 Requiere
un exceso de anticuerpos fijados.
 Se utiliza un Ag marcado
 Suero del paciente (contiene el Ag a medir)
 La señal generada es inversamente proporcional a
la concentración del antigeno (analito).

No Competitivos (amplificación de actividad)
 Requiere
un exceso de anticuerpos fijados
 Suero del paciente (contiene el Ag a medir)
 Requiere un exeso de anticuerpos marcados
 La señal generada es directamente proporcional a
la concentración del antigeno (analito).
INMUNOENSAYOS COMPETITIVOS
INMUNOENSAYOS NO COMPETITIVOS
TIPOS DE INMUNOENSAYOS SEGÚN MARCADORES
Inmunoensayo
Formación de
complejos
Ag-Ac
Sustancias
Marcadoras
conjugados a
moléculas
que emiten
señales
detectables
RIA (Marcador: isótopo radiactivo)
ELISA (Marcador: enzima)
IF (Marcador: partícula fluorescente)
CLIA marcador: sust.quimioluminiscente
El enzimoinmunoanálisis (EIA)
Emplean la capacidad catalítica de las enzimas como marcador
inmunoquímico para la valoración de la unión Ag-Ac producida tras
un periodo de incubación, con la adición posterior de un sustrato.
Tienen alta sensibilidad
La realización de los enzimoinmunoanálisis consta de dos etapas
bien diferenciadas.
1) Unión entre el Ag y el Ac,
2) Se añade el sustrato y se determina la actividad enzimática del
marcador. Esta determinación puede ser principalmente
realizada por dos tipos de métodos : de punto final y cinetico.
Descripción
Válido para determinar moléculas de bajo peso molecular, como por ejemplo la
tiroxina.
Se basa en el marcaje de una enzima con el Ag a determinar. La unión del Ac a este
complejo inhibe la actividad catalítica de la enzima, al impedir el acceso del sustrato
al centro activo. La competencia entre el Ag del espécimen y el Ag ligado a enzima
por el anticuerpo implica que a mayor concentración de Ag presente en la muestra,
menor cantidad de enzima será inactivada, por lo que la actividad es directamente
proporcional al Ag del espécimen
Tipo
Homogeneo competitivo
Denominación
Inmunoanalisis mediado por enzimas (EMIT)
Descripción
Se basa en el uso de la enzima β-galactosidasa fraccionada mediante técnicas de
DNA recombinante en dos partes inactivas, una aceptora grande y una donadora de
menor tamaño unida al Ag a determinar.
La combinación de ambos fragmentos da lugar a la enzima activa, siendo ésta
imposibilitada por la unión del Ac al Ag ligado a la fracción donadora.
La competencia entre el Ag del espécimen y el Ag ligado a la fracción donadora por
el Ac implica que a mayor concentración de Ag presente en el espécimen, un mayor
número de moléculas de enzima β-galactosidasa activa podrá se ensamblada,
por lo que la actividad es directamente proporcional al Ag del espécimen
Tipo
Homogeneo competitivo
Denominación
Inmunoanalisis donador con enzima clonada (CEDIA)
Descripción:
Uno de los componentes de la reacción se halla ligado a una superficie de fase
sólida, como una placa de microtitulación, una bola de plástico o una
micropartícula magnética.
En los métodos competitivos, el Ac se halla ligado a la fase sólida, y puede
reconocer tanto al Ag del espécimen como a un Ag marcado adicionado
independientemente. La competencia de ambos Ag por los lugares de unión al Ac
implica que a mayor concentración de Ag de la muestra, una menor concentración
de Ag marcado será ligada. La actividad enzimática es por tanto inversamente
proporcional a la concentración del Ag presente en el espécimen (Figura 3).
En los métodos inmunométricos, el Ag del espécimen a determinar es reconocido
por un Ac ligado a la fase sólida y por un segundo anticuerpo marcado, formando
una estructura de tipo sándwich. El Ag del espécimen y el Ac marcado pueden
añadirse simultáneamente (sistema de un solo paso) o secuencialmente (sistema
de dos pasos). La actividad enzimática es en ambos casos directamente
proporcional a la concentración del Ag del espécimen (Figura 4)
Tipo:
Heterogeneo, competitivo o no competitivo (inmunométrico)
Denominación:
Analisis inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA)
Descripción:
Los Ac de captura se hallan unidos a una superficie de fase sólida de pequeñas
esferas de látex de 0.47 um de diámetro denominadas micropartículas, capaces de
acelerar la unión del Ag del espécimen.
La separación entre el Ag libre y el unido se produce en una matriz de fibra de vidrio,
que retiene de forma irreversible al segundo.
Los métodos competitivo e inmunométrico poseen las mismas características que
los presentes en el ELISA, siendo la enzima utilizada para el marcaje la fosfatasa
alcalina unida a un Ag adicionado independientemente o a un segundo Ac
respectivamente. En ambos casos, el sustrato empleado es la 4-metilumbeliferona,
que produce fluorescencia
Tipo:
Heterogeneo; competitivo o inmunometrico
Denominación:
Inmunoensayo por microparticula (MEIA)
ENZIMAS Y SUSTRATOS
Caracteristicas de las enzimas:
Ser solubles, con elevada actividad específica y recambio enzimático alto, ser
estables en las condiciones de la prueba, con una medida sencilla, sensible y
rápida, así como no estar presentes en los líquidos biológicos ni ser inhibidas por las
condiciones del análisis.
Enzimas
Sustratos
Peroxidasa
β-galactosidasa
Fosfatas alcalina
TMB: ; Azul λ=650nm Amarillo λ=450nm
ABTS; 2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid)
Azul verdoso λ=405-410 nm
OPD; o-fenilendiamina; amarillo; λ=490nm
MUG (ácido 4 - metilumbeliferil - D -lucopiranosidurónico)
(fluorescente) ; λem=440nm
AMPGD (Adamantil-l,2-dioxetano ) (luminiscente)
p-NPP (para nitrofenilfosfato); Amarillo: λ=405-410
4-MUP 4-Methylumbelliferyl phosphate, Disodium
trihydrate (fluorescente) ; λex=360nm; λem=440nm
AMPPD 3-(2′-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3″phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane (luminiscente)
Soportes (fase solida: policubetas, bolitas, peines)
El poliestireno (PS) es un polimero termoplastico que se obtiene de la polimerización
del estireno.
Existen cuatro tipos principales:
PS cristal Ej cajas de CD, policubetas, que es transparentes rígido y quebradizo; el PS
de alto impacto, resistente y opaco Ej.Cubierta de TV, maquinas de afeitar.
PS expandido, muy ligero Ej. Telgopor,
PS extrusionado, similar al expandido pero más denso e impermeable Ej
impermeabilizantes
Fijación de Antígenos y Anticuerpos a
soportes solidos
Incubar la solución de antígeno/Anticuerpo en buffer Carbonato ph 9,6
sobre el soporte solido a 4`C durante toda la noche
Lavar con buffer fosfatos ph 7,6
Neutralizar con albumina 4% durante 1 hora
Lavar con buffer fosfatos ph 7,6
Radioinmunoanálisis
Radioinmunoanálisis clásico (RIA), que es del tipo heterogéneo competitivo y el
análisis inmunorradiométrico (IRMA), que es del tipo heterogéneo no competitivo
Al ser métodos heterogéneos se hace necesario en ambos casos la separación de la
fracción libre, constituidas por los Ag y Ag*, y la fracción ligada, formadas por los
complejos Ag-Ac y Ag*-Ac.
En ausencia de esta separación previa, la radiactividad total del tubo permanece
constante antes y después de la reacción, por lo que esta debe ser realizada en todo
caso siguiendo alguno de los métodos previamente descritos.
Los isótopos utilizados han de poseer una serie de características para su uso en el
radioinmunoanálisis, tales como una actividad específica elevada, una producción de
energía alta, vida media adecuada, ser de fácil obtención y que no se acomplejen
durante su acoplamiento a la molécula de ligando. Los emisores utilizados para el
radioinmunoanálisis son los de tipo β o γ, siendo los isótopos de mayor difusión el
carbono 14 (14C), el tritio (3H) y el yodo 125 (125I)
Si bien los radioinmunoanálisis son empleados aún en la actualidad para la detección
de analitos de muy baja concentración, las complicaciones inherentes de la técnica y
el desecho de los materiales radioactivos por parte del laboratorio tienen como
consecuencia un desplazamiento de los mismos en favor del uso del inmunoensayo
enzimático
Los fluoroinmunoanálisis (FIA)
Se basan en la utilización de compuestos fluorescentes para el marcaje de los
inmunocomplejos.
La principal característica que han de poseer estos compuestos es una intensidad de
fluorescencia elevada, claramente diferenciable de la fluorescencia de fondo
presente en los fluidos biológicos e inalterable tras su unión a los Ag o Ac.
Entre los compuestos séricos que contribuyen a la fluorescencia de fondo estan las
proteínas, el NADH, las porfirinas y los fármacos, muestras hemolizadas e ictéricos.
Los compuestos fluorescentes más empleados en este tipo de inmunoanálisis son
losderivados de fluoresceína, rodamina y umbeliferona
Existen varios tipos de técnicas basadas en el fluoroinmunoanálisis, tanto de tipo
homogéneo como heterogéneo.
Entre las primeras se encuentra el fluoroinmunoanálisis de polarización de
fluorescencia (FPIA) EJ Tiroxina y Cortisol, el inmunoanálisis de fluorescencia con el
sustrato marcado (SLFIA) y el inmunoanálisis de transferencia de energía de
fluorescencia (FETI).
La técnica heterogénea más utilizada es el fluoroinmunoanálisis de disociación
aumentada por lantánidos (DELFIA)
FPIA:
El análisis está basado en la cantidad de luz fluorescente polarizada que se detecta
cuando el trazador, un antígeno unido a un compuesto fluorescente (fluoroporo),
es iluminado con luz polarizada plana.
El grado de polarización de la fluorescencia depende del giro de las moléculas en la
solución.
De esta forma, las moléculas de pequeño tamaño, como es el trazador no ligado,
giran libremente a una velocidad elevada, dando lugar a un grado de polarización
bajo.
Por el contrario, las moléculas de gran tamaño, tales como el complejo formado por el
Ac y el trazador, rotan lentamente, lo que se traduce en un elevado grado de
polarización de la fluorescencia emitida. Al ser un método competitivo, el Ag de la
muestra compite por un número limitado de lugares de unión del anticuerpo
con el Ag fluorescente del trazador. A mayor concentración del Ag en la muestra,
menor será la cantidad de trazador unido al anticuerpo, por lo que el valor de la
polarización de la fluorescencia será bajo.
El fluoroporo de elección empleado en el trazador es la fluoresceína, capaz de
absorber la energía de la luz a 490 nm y liberarla posteriormente a una longitud de
onda superior, de 520 nm, como luz fluorescente. La relación precisa entre la
polarización de la fluorescencia emitida y la concentración de la sustancia se
establece en base a un conjunto de calibradores de concentración conocida.
El luminoinmunoanálisis
Se basan en la utilización de sustancias luminiscentes como marcadores para
detectar la formación del complejo antígeno-anticuerpo.
Se usaron moléculas de origen natural capaces de generar bioluminiscencia, de
bacterias fluorescentes o peces abisales.
Uno de los sistemas mejor conocidos es el de la luciérnaga, en el que la enzima
luciferasa cataliza la oxidación de la molécula de luciferina en presencia de ATP y
Mg2+, con la emisión de luz a 546 nm.
Se usan el luminol, isoluminol, pirogalol o derivados de acridina se conjugan con
algún elemento de la inmunorreacción, Ag o Ac. En presencia de compuestos
oxidantes, como el peróxido de hidrógeno, el hipoclorito o el oxígeno, tiene lugar la
emisión de luz a partir del producto excitado en la reacción de oxidación.
Hoy en día las técnicas más empleadas en los laboratorios de hormonas por su
elevada sensibilidad son:
•La Electroquimioluminiscencia, la emisión de luz tiene lugar como resultado de la
oxidación de un compuesto marcador de tris (bipiridil) de rutenio en la superficie de
un electrodo, en presencia de tripropilamida, para formar especies de rutenio (II)
excitadas, las cuales vuelven a su estado basal emitiendo luz a 620 nm (Figura 9).
• El inmunoensayo magnético quimioluminiscente (CMIA), donde se emplean
micropartículas magnéticas con anticuerpos de captura en su superficie para ligar el
Ag a determinar y anticuerpos marcados para el revelado de la reacción, tratándose
de un ensayo inmunométrico no competitivo similar al MEIA
Limitaciones del inmunoanálisis
Efecto matriz
Se define como el conjunto de alteraciones ocasionadas por componentes de la
muestra, a excepción del analito a determinar.
Su detección puede ser llevada a cabo mediante la realización de diluciones sucesivas
en las muestras.
Factor reumatoide: Interfieren de forma aún no conocida Ej con hormonas tiroideas.
Complemento: pueden bloquear el sitio de unión a anticuerpos.
Lisozima: formación de puentes entre el anticuerpo de fase sólida y el anticuerpo
marcado, dando resultados falsamente elevados.
Proteínas de unión endógenas: La albúmina, prealbúmina, globulina fijadora de
hormonas sexuales, globulina fijadora de tiroxina y globulina fijadora de Cortisol entre
otras, pueden ocasionar alteraciones en las medidas hormonales.Ej varaiaciones de
albumina y hormonas tiroideas libres.
Autoanticuerpos:
Los anticuerpos contra la hormona a cuantificar puede interferir en la
inmunorreacción, dando lugar a resultados falsamente aumentados o
disminuidos. Ej a hormonas tiroideas, antitiroglobulina, antiinsulina, antiTSH,
antiparatohormona. Es muy frecuente la formación de la denominada
macroprolactina, complejos formados por prolactina e inmunoglobulina,
responsables su sobreestimación.
Anticuerpos heterófilos:
Constituidos por anticuerpos anti-IgG de animales empleados para la obtención
de los reactivos del inmunoanálisis, tales como ratón (HAMA), conejo, oveja,
etc. Existen interferencias para la TSH, prolactina y gonadotropina coriónica
humana, debido al uso de anticuerpos monoclonales de ratón con fines
diagnósticos (pruebas de imagen) o terapeúticos (antivirales, antineoplásicos,
trombolíticos, etc.).
Especificidad de los anticuerpos
Las características propias de los anticuerpos utilizados en las técnicas de
inmunoanálisis condicionan la especificidad de las mismas. Los problemas
derivados pueden ser debidos a una falta de especificidad, surgidos
principalmente en la utilización de anticuerpos policlonales y debidos
principalmente a reacciones cruzadas con componentes en la muestra de
estructura química similar, endógenos o farmacológicos, o por una excesiva
especificidad, propia de los anticuerpos monoclonales, y que tiene su origen en la
valoración exclusiva de la molécula intacta.
Este problema, especialmente presente cuando la hormona a cuantificar presenta
heterogeneicidad molecular o en el caso de secreción tumoral, es importante en los
análisis de hormona luteinizante, gonadotropina coriónica humana, hormona de
crecimiento y corticotropina entre otras
Efecto hook o gancho
Se produce de forma ocasional cuando la concentración del antígeno a
determinar es inusualmente elevada y uno o ambos anticuerpos quedan
saturados antes de que se forme el sándwich, induciendo resultados
falsamente disminuidos. La curva dosis-respuesta típica de estos métodos es
lineal hasta una concentración determinada en que se produce una meseta;
en caso de producirse el efecto hook, la curva inicia una pendiente negativa
hasta alcanzar valores bajos (Figura 10). Esta interferencia ha sido descrita
para la determinación de tiroglobulina, gonadotropina coriónica humana y
prolactina entre otras. Cuando se sospecha este fenómeno se recomienda la
realización de diluciones seriadas de la muestra hasta alcanzar una
concentración dentro del intervalo de referencia de la técnica
Fase postanalítica
Esta fase comprende el proceso desde que se obtiene el resultado de una prueba
hasta que el informe es recibido por el médico peticionario. El facultativo responsable
de la aceptación o validación de los resultados obtenidos ha de conocer determinados
aspectos analíticos, entre los que se incluyen los siguientes:
1) Metodología empleada en la determinación:
Cada sistema analítico posee una serie de características propias, que deben ser
comparadas y relacionadas con el método de referencia recomendado por las
sociedades científicas. ANMAT-Tecnologia Medica Productos de tecnología Médica
es un producto para la salud tal como equipamiento, aparato, material, artículo o
sistema de uso o aplicación médica, odontológica o laboratorial, destinada a la
prevención, diagnóstico, tratamiento, rehabilitación o anticoncepción y que no utiliza
medio farmacológico, inmunológico o metabólico para realizar su función principal en
seres humanos, pudiendo entretanto ser auxiliado en su función, por tales medios.
2) Linealidad del método:
Es el intervalo de concentración en el que los resultados emitidos son fiables y no
requieren ningún tipo de modificación.
3) Errores analíticos:
Imprecisión e inexactitud existente de forma inherente en la técnica empleada, y que
han de ser mantenidas bajo el límite del error total permisible definido por el objetivo
analítico marcado.
4) Límite de detección:
Es el resultado aislado más pequeño que, con una determinada probabilidad, se
puede distinguir de un blanco verdadero.
5) Especificidad:
Es la capacidad de un método para determinar únicamente el componente que se
pretende medir.
6) Interferencias de la técnica:
La alteración de un determinado resultado debido a sustancias ajenas a las que se
pretende determinar.
7) Estabilidad del espécimen:
Implica el conocimiento del tiempo y temperatura que puede transcurrir antes de
que tengan lugar alteraciones significativas en los resultados.
8) Tipo y condiciones de extracción del espécimen:
Condicionan los valores de referencia y el tratamiento de la muestra en las distintas
fases del proceso analítico.
Además de asegurar la fiabilidad de los resultados obtenidos, es función del
facultativo el procurar que los informes de resultados sean recibidos por los
destinatarios adecuados, evitando las derivaciones a terceras personas y velando por
el cumplimiento de la ley de protección de datos
Derechos del Paciente en su Relación con los Profesionales e Instituciones de la
Salud)
(Ley 26.529 DERECHOS DEL PACIENTE, HISTORIA CLINICA Y CONSENTIMIENTO
INFORMADO
c) Intimidad. Toda actividad médico - asistencial tendiente a obtener, clasificar, utilizar,
administrar, custodiar y transmitir información y documentación clínica del paciente
debe observar el estricto respeto por la dignidad humana y la autonomía de la
voluntad, así como el debido resguardo de la intimidad del mismo y la confidencialidad
de sus datos sensibles, sin perjuicio de las previsiones contenidas en la Ley Nº 25.326
(Ley de protección de datos personales;
d) Confidencialidad. El paciente tiene derecho a que toda persona que participe en la
elaboración o manipulación de la documentación clínica, o bien tenga acceso al
contenido de la misma, guarde la debida reserva, salvo expresa disposición en
contrario emanada de autoridad judicial competente o autorización del propio
paciente;
Calidad:
Para determinar si los resultados obtenidos para una magnitud concreta son
correctos o incorrectos, se hace necesaria la definición del error máximo
permitido(EM) en los resultados, en base a una serie de objetivos de control de
calidad(QC). Una vez establecidos estos objetivos de QC, es necesario cuantificar
el error total(ET) presente en el laboratorio para cada una de las magnitudes,
mediante el cálculo del error sistemático(ES) y error aleatorio(EA) de cada una de
ellas.
Para que un resultado se considere aceptable, el ET presente en el laboratorio ha
de ser inferior al EM definido en base a los objetivos analíticos.
Error sistemático
El error sistemático (ES), también conocido como Sesgo, se define como la
diferencia entre la media de un número infinito de mediciones de una magnitud,
realizada bajo condiciones de repetitividad, y el valor verdadero.
Este error siempre se halla presente en el laboratorio, siguiendo una tendencia
que desplaza a la media de una población de su valor real. Puede ser debido a
errores de muestreo, errores propios del método, cambio en los materiales de
control y calibración o errores del personal. Para su determinación es necesario
disponer de los datos proporcionados por programas de garantía externa
de calidad, cuyos valores medios para una determinada magnitud se consideran
una aproximación al valor verdadero de la medición.
Error aleatorio
El error aleatorio, también conocido como Imprecisión, se define como la dispersión de
resultados de medidas independientes obtenidas bajo condiciones específicas.
La magnitud y dirección de estos errores no puede ser predicha, y son el resultado de
lecturas incorrectas de los instrumentos, cálculos erróneos, cambios en el uso de
muestras o reactivos y estándares mal preparados. Puede expresarse como desviación
estándar (DE) o como coeficiente de variación de la media (CV), utilizándose el primero en
el uso rutinario del laboratorio y el segundo en la comparación de la precisión de
diferentes sistemas analíticos.
Las diferentes medidas de una determinada magnitud biológica realizadas en el mismo
espécimen y bajo las mismas condiciones representadas gráficamente dan lugar a una
campana de gauss, y siguen una distribución gaussiana o normal. La descripción de este
tipo de distribuciones puede ser realizada en base a estadística paramétrica. 1) Es
necesario conocer la media como estimación de la tendencia central, y 2) la desviación
estándar o coeficiente de variación como medida de la dispersión de la distribución.
Asi podemos definir la probabilidad de que una medición concreta se halle entre un
intervalo de valores concreto.
- Media +/- 1 DE incluye al 66% de las mediciones
- Media +/- 1.65 DE incluye al 70% de las mediciones
- Media +/- 1.96 DE incluye al 95% de las mediciones
-Media +/- 2.57 DE incluye al 99% de las mediciones
-- Media +/- 3 DE incluye al 99.7% de las mediciones
De esta forma, la estimación del error aleatorio del laboratorio viene dada por la DE o el
CV multiplicado por una constante k, que define los intervalos de confianza de la
distribución gaussiana
Error total
El error total, también conocido como Inexactitud, se define como la discrepancia entre
el resultado de una única medición y el valor verdadero de la magnitud biológica
medida.
Su cálculo teórico es el resultado de la suma entre error sistemático y error aleatorio,
teniendo en cuenta en este último caso los intervalos de confianza previamente
descritos (Figura 12). En la práctica, sin embargo, este valor se obtiene en base a la
comparación de una medida realizada en el laboratorio con la propuesta por un
programa de control de calidad externo. El desempeño de un método es considerado
aceptable cuando la magnitud del error total obtenido es inferior al error máximo
permitido establecido en base a los objetivos analíticos del control de calidad
Objetivos analíticos del control de calidad
En los procesos analíticos, los Objetivos Analíticos definen las especificaciones
de calidad, o lo que es lo mismo, el Error Admisible.
Existen multitud de modelos basados en criterios diversos que permiten al laboratorio
comprobar cuál es el grado de cumplimiento de sus prestaciones analíticas. En 1999
tuvo lugar la denominada Conferencia de Estocolmo sobre “Estrategias para establecer
especificaciones globales de la calidad en el laboratorio clínico”, en la que numerosos
especialistas en la materia consensuaron la aplicación de un modelo ordenado
jerárquicamente para el establecimiento de las especificaciones de la calidad, o lo que
es lo mismo, el establecimiento de los límites de error máximo permitidos en el
laboratorio clínico:
1) Efecto del error sobre los resultados en situaciones clínicas concretas.
2) Variabilidad biológica.
3) Recomendaciones de los paneles de expertos.
4) Programas de comparación interlaboratorio (evaluación externa de la calidad).
5) Estado del arte.
El documento recomienda la utilización de los criterios más altos de la jerarquía,
siempre y cuando éstos estén disponibles y se adecuen a su uso en el trabajo rutinario
del laboratorio. Actualmente se acepta por consenso que si el error total del laboratorio
permanece por debajo del error máximo permitido basado en los objetivos analíticos de
la variabilidad biológicade las muestras humanas, el informe producido será adecuado
para el cribado, diagnóstico y monitorización de los pacientes
Variabilidad biológica
La variabilidad biológica (VB) puede ser definida como la fluctuación que experimenta
un determinado constituyente alrededor de su punto de equilibrio homeostático,
también llamado de equilibrio dinámico.
El concepto global incluye dos aspectos, el de la variabilidad biológica intraindividual
(VBw), presente en cada individuo, y el de la variabilidad biológica interindividual
(VBb), referida al conjunto de la población (Tabla 1).
En función de los valores de la VB y de la capacidad tecnológica empleada, es posible
aplicar tres niveles de exigencia en la prestación del laboratorio, denominadas
especificaciones mínimas, deseables y óptimas.
Todas ellas se expresan en porcentaje y se calculan con las ecuaciones propuestas en
la Tabla 4.
Siempre y cuando sea posible se recomienda el empleo de las especificaciones
deseables, utilizándose las mínimas en el caso de que el laboratorio tenga
dificultades para alcanzarlas.
Las especificaciones óptimas son de opción libre para aquellos laboratorios que
aspiren a niveles de calidad superiores
Para que un resultado se considere aceptable, el Error Total del laboratorio ha de ser
inferior al Error Máximo Permitido basado en la especificación de calidad exigida.
Control de calidad interno
El control de calidad interno es aquel que se realiza íntegramente en el laboratorio
durante la actividad
diaria del mismo. Los resultados se obtienen de forma inmediata y permite tomar
decisiones en
tiempo real. El sistema clásico de control de calidad fue propuesto por Levey y
Jennings en la
década de los 50, y está basado en la representación gráfica de los resultados
analíticos de controles
a lo largo del tiempo (Figura 13). La media del valor control es el valor central de la
gráfica, y
el intervalo comprendido entre la media y dos DE limita el intervalo dentro del cual
el proceso
analítico se considera correcto (con un 95% de confianza)(29).
Este sistema fue perfeccionado por Westgard en 1970, mediante la implantación de un
sistema informatizado de normas, conocidas hoy en día como las reglas de Westgard,
incorporadas en la mayoría de los autoanalizadores automáticos. Se basa en el empleo de
una secuencia lógica de normas de control, cuya aplicación minimiza los falsos rechazos y
potencia la detección de errores.
Algunas de las reglas más empleadas son las siguientes
(36)(Figura 14):
-1-2s:Un valor sobrepasa los límites de +/- 2 DE. Detecta error aleatorio.
- 2-2s:Dos valores consecutivos sobrepasan los límites de +/- 2 DE. Detecta error
sistemático.
-1-3s:Un valor excede los límites de +/- 2 DE. Detecta error aleatorio.
- R-4s:La diferencia entre dos valores consecutivos del control es superior a 4 DE. Detecta
error aleatorio.
-4-1s:Cuatro valores consecutivos sobrepasan los límites de +/- 1 DE. Detecta error
sistemático.
-10-X:Diez valores consecutivos se encuentran por debajo o por encima de la media. Detecta
error sistemático.
Como norma general, la regla 1-2s se considera de aviso, mientras que el
resto se consideran criterio de rechazo, aunque depende en cada caso del
criterio del laboratorio. Dado que no existe una norma de control que
proporcione una respuesta óptima para el conjunto de errores aleatorios y
sistemáticos, la tendencia es la utilización de una combinación de estas
normas, las conocidas como multireglas de Westgard (33-36). La elección de
estas reglas depende del rendimiento del método y de las especificaciones
de calidad escogidas por el laboratorio, y pueden ser definidas en base a las
denominadas curvas de potencia, cuya elaboración se realiza en base a
programas informáticos y su
descripción queda fuera de los objetivos de este texto.
Control de calidad externo
Si bien los procedimientos de control interno permiten verificar la imprecisión propia
del proceso analítico, tienen como limitación su dificultad en la determinación de la
inexactitud del mismo.
Para ello se hace necesaria la participación en programas de control de calidad
externos.
Estos programas valoran los resultados obtenidos por varios laboratorios sobre los
mismos materiales de control.
La organización del programa compara los diferentes resultados aportados y verifica
la homogeneidad entre los mismos, permitiendo definir la inexactitud de cada
laboratorio con respecto del conjunto y facilitando de esta forma la transferibilidad de
resultados entre los participantes .
Este tipo de controles utiliza como valor diana la media del conjunto de todos los
laboratorios, teniendo en cuenta la agrupación de los mismos en función del método
empleado en los casos en los que existan grandes diferencias entre ellos.
La información obtenida puede ser empleada para ajustar los valores de los
calibradores de cada laboratorio, ajustándose de esta forma al valor medio
consenso de los participantes.
MUCHAS GRACIAS