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Conceptos generales de Biología Molecular.
Extracción de DNA y Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR).
Olga Redondo González
MIR 3 Análisis Clínicos
Hospital Universitario de Guadalajara,
25 abril 2007
Objetivos
„
„
„
„
„
„
Conceptos básicos: estructura del DNA
Tipo de muestra
Obtención de la muestra
Características de la muestra: Pureza/
Concentración
Amplificación de fragmentos de DNA
mediante “Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)”
Análisis e identificación de fragmentos:
„
„
„
„
Electroforesis
Enzimas de Restricción
Hibridación
Secuenciación
Etapas principales del desarrollo de la
tecnología del DNA recombinante
1869
Miescher. Primer aislamiento del DNA
1944
Abery. El DNA y no la proteína, contiene la información genética
1953
Watson y Crick. Modelo de doble hélice del DNA
1957
Kornberg. DNA polimerasa I
1959
Severo Ochoa. Polinucieótido-fosforilasa, síntesis de ARN
1961
Marmur y Doty. Renaturalización del DNA, especificidad e
hibridación de los ácidos nucleicos
1962
Alber, Nathans y H. Smith. Nucleasas de restricción
1966
Nirenberg, Ochoa y Khorana. Código genético
1967
Geller. DNA ligasa
1972-73 Boyer, Cohen, Berg. Técnicas de clonaje del DNA
1975
Southern. Hibridación y transferencia sobre gel, para la
detección de secuencias específicas de DNA
1975-77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert. Métodos rápidos de
secuenciación del DNA
1985
Mullis
Mullisyycols.
cols.PCR
PCR
En 1953, James Watson y Francis
Crick propusieron el modelo de la doble
hélice para la estructura del DNA,
basados en los resultados de los rayos X
de Franklin y Wilkins.
La Real Academia de las Ciencias de Suecia concede el Premio
Nobel en Química 1993, a Kary B. Mullis, USA, por su invento
del método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR).
Estructura del DNA
Núcleo de la
célula
eucariota
Cromosoma
Enrollamiento de
la cromatina
5´
3´
0.34 nm
(2´-desoxiD-rribosa)
3.4 nm
Doble hélice y
Fibra de
cromatina
2 nm
3´
5´
Tipo de muestra
„
Características de la muestra:
DNA = “huella genética”
1 mg de DNA = 150.000 células
6.6 pg de DNA/célula
„
ESTABILIDAD
MUTABILIDAD
Evolución
especies
¿De dónde se obtiene la muestra?
De cualquier tipo de célula nucleada:
„ Sangre
„ Tejidos
„ Células bucales
„ Raíces de pelo
„ Semen
„ Vellosidades coriales
„ Líquidos biológicos
Patologías
Obtención de la muestra
Sangre + Solución hipotónica
Tejido + Homogeneizador
+ 300 µl Buffer
de Extracción (SDS al
PELLET 10% P/V)
Ácidos
Nucleicos
Fase Acuosa
Proteínas
Fase Orgánica
+ 15 µl Proteinasa K
Incubar 1 hora a 55ºC
Inactivar 10´a 98ºC
Lípidos,
Proteínas
Extracción Fenol: CH3Cl (1:1)
Centrifugación
Fase acuosa
Precipitación: 0.1 V AcNa 0.3M + 2.5 V Etanol
Precauciones:
Sensibilidad al cizallamiento
Precauciones
¡Ojo con las DNAsas!
Incubar 1 h a –70ºC ó 24 h a -20ºC
Resuspender pellet en 30 µl de solución
amortiguadora de TE.
Agitación suave 37ºC, 2h.
SDS= dodecil sulfato de sodio
TE= Tris 2 mol/L, EDTA 0.25 mol/L pH 7.5
Características de la muestra
„
Concentración:
„
Espectrofotometría
1 Unidad de Absorbancia a 260 nm = 50 µg/ml de
doble hebra de DNA ó 40 µg/ml de hebra sencilla
de DNA o RNA.
[ DNA ] = A 260 * 50µg * dilución
„
„
Fluorometría
Pureza:
2.2 ≥ A260/ A280 ≥ 1.8
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) 1985, K. Mullis y cols.
¿Para qué sirve?:
1) Identifica el fragmento de DNA que nos interesa
2) Genera “in vitro” grandes cantidades de ese fragmento
a partir de una cantidad mínima del mismo
¿En qué se fundamenta?: “mimetiza” el proceso de replicación
que tiene lugar “in vivo”
1) Capacidad del DNA para desnaturalizarse/ renaturalizarse por
calor/frío
2) Propiedad de las polimerasas de reparar el DNA que se fragmenta,
añadiendo bases complementarias sobre la hebra sencilla, siempre y
cuando se encuentren un fragmento de doble cadena
Doble hebra de
DNA diana
Esquema de un ciclo de PCR convencional
Ciclo 1
Tª (ºC)
100
Ciclo 2
Ciclo 3
Desnaturalización
Programa de PCR
95ºC
80
Síntesis
70ºC
60
Anillamiento
50-60ºC
Tiempo
Primer ciclo
Segundo ciclo
Tercer ciclo
D
A
S
Termociclador
2ⁿ
n=20-50 ciclos
Electroforesis
Electroforesis
Enzimas de
restricción
Hibridación
Secuenciación
Electroforesis (EF)
„
„
Ácidos nucleicos: moléculas polianiónicas
uniformemente cargadas que pueden migrar en un
campo eléctrico.
Geles:
„
„
„
„
poliacrilamidaÆ fragmentos < 500 pb;
agarosa (fragmentos 200 pb-50Kb). EF en gel de campo
pulsante (agarosa al 1%).
Visualización: colorante bromuro de etidio,
marcaje radiactivo (32P).
Identificación fragmentos de DNA por tamaño:
„
„
Virus/ bacterias
Deleciones
-
700-800 pbÆ
400-500 pbÆ
+
Transiluminador
Marcadores de
peso molecular
Aparato de
electroforesis
horizontal
Electroforesis
Enzimas
de
Enzimas de
restricción
restricción
Hibridación
Secuenciación
Enzimas de restricción
„
“In vivo”
„
„
„
Reconocen y cortan el DNA de doble hélice en
sitios específicos (secuencias de
reconocimiento) Æ endonucleasas.
Origen bacteriano: supervivencia a
lisis por fagos (no existente en
eucariotas).
“In vitro”
„
Localizan secuencias mutadas dentro del
genoma.
Secuencias de reconocimiento de algunos enzimas de restricción
Extremos cohesivos 5´
Extremos cohesivos 3´
Extremos romos
Secuencias de bases palindrómicas, 4-6 pb
↑↓: enlaces fosfodiéster hidrolizados por el enzima de restricción (sitio de corte)
N: cualquier base
400 pb
M1
DNA normal
M2
DNA mutado
-ACCATG-
-ACCGTG-
-TGGTAC-
-TGGCAC-
100 pb
400 pb
300 pb
100 pb
300 pb
WM
400 pb
M1
M2
El enzima de restricción
no reconoce la secuencia
Electroforesis
Enzimas de
restricción
Hibridación
Hibridación
Secuenciación
Hibridación molecular
„
Fundamento: Apareamiento de dos secuencias
„
Utilidad:
„
nucleotídicas por complementariedad de basesÆ
C-G y A-T
- Reconocimiento de
secuencias “diana”
por apareamiento con
secuencias conocidas
(SONDAS).
Detección:
„
„
„
„
Radioactiva (32P)
Fluorescente (fluorocromo)
Quimioluminiscente (luminol)
Tipos: Northern, Southern y Western blot.
Electroforesis
Enzimas de
restricción
Hibridación
Secuenciación
Secuenciación
Identificación completa
de la secuencia del
fragmento amplificado
Electroforesis
Enzimas de
restricción
Hibridación
Secuenciación
Elemental mi
querido Watson,
elemental!! Nos
quedó como una
doble hélice!!!
Lo logramos
Crick!!!
Cómo te
parece que
nos quedó
el modelo
del ADN?
En 1962, Watson,
Crick y Wilkins,
recibieron el
Premio Nobel por
su descubrimiento
¡¡Muchas
gracias por
vuestra
atención!!