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Adición de un gen que incrementaba el color
Flores con
sectores con
distinta
intensidad en el
color o blancas
1
Inyectan RNA para una proteína de miofilamento cuya disminución induce
movimientos tipo “sacudones”
2
RNA de interferencia
Representa un mecanismo inventado por
la naturaleza para proteger y regular al
genoma.
3
1990
La RNAi fue observada por primera vez en plantas
1998
RNA doble cadena induce el silenciamiento de genes en el gusano
C.elegans.
2000
Se identifica el complejo RISC, responsable de la RNAi
2001
siRNA (pequeños RNA de interferencia) de 21-25 pb inducen RNAi en
mamíferos
2002
Mediante RNAi, se disminuye la actividad de virus como HIV y HCV.
2003
RNAi: biología, mecanismo y aplicaciones.
2006
Premio Nobel en Fisiología/Medicina para los autores del primer trabajo
sobre RNAi en C. elegans.
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Mecanismo regulatorio de la expresión de genes
que limita los niveles de transcripto.
Ocurre por:
™ Supresión de la transcripción
transcripcional de genes)
(silenciamiento
™ Por activación de la degradación del RNA de
manera secuencia-específica (silenciamiento posttranscripcional de genes/interferencia de RNA
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RNAi
función natural de protección del genoma contra la
invasión de elementos genéticos móviles (virus,
transposones)
necesaria para el correcto funcionamiento de los
programas de desarrollo de organismos eucariotas
moléculas de RNA doble cadena (dsRNA)
inductores y activadores de este proceso
Componentes comunes a todos los organismos
1- La molécula inductora es el dsRNA
2- El RNA blanco es degradado de manera dependiente de la homología de
secuencia
3- La maquinaria de degradación requiere un conjunto de proteínas cuya
estructura y función son similares en la mayoría de los organismos.
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COMPONENTES DEL SILENCIAMIENTO DE GENES:
Dicer
Rnase-III-like dsRNA-specific ribonuclease
(ribonucleasa específica de dsRNA, de tipo RNAsa III)
Enzima
involucrada
en
la
iniciación de la RNAi. Digiere al
dsRNA en RNAs pequeños (siRNA) de
tamaño uniforme.
™ Dicer: nucleasas dependientes de ATP. Rnasa III
actúa
cómo dímero.
™ Hay
homólogos
de
DICER
en
la
mayoría
de
los
falta
del
organismos.
™ La
ausencia
procesameniento
de
para
DICER
el
produce
la
silenciamiento
de
genes
in
vitro.
™ In vivo, provoca fallas en el desarrollo de Drosophila
y C.elegans
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MECANISMO DE LA RNAi
PASO 1 : Iniciación
Unión de Dicer a un dsRNA
(30-200 nt) y su clivaje en
fragmentos de RNA (siRNA) de
≅21 a ≅25 nucleótidos
PASO 2 : Paso Efector
siRNAs se unen al complejo
multinucleasa, RISC, el cuál
degrada al mRNA simple cadena
homólogo.
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RNA pequeños
(siRNA)
Moléculas de RNA de ≅ 25 nucleótidos tanto sense
como antisense
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Cada cadena de siRNA tiene:
a. 5’-phosphate extremo
b. 3’-hidroxil extremo
c. 2/3-nucleótidos
extremo 3’
protruyentes en el
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El complejo RISC (complejo de
silenciamiento inducido por RNA)
Nucleasa multicomponente para
RNAi (500 kDa)
• siRNAs son incorporados en el RISC
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• Guiado por la complementariedad de
bases del siRNA, el RISC dirige al mRNA
para su degradación
12
13
Hay diferentes maneras de inducir la RNAi…
14
La RNAi como herramienta
15
RNA interference in adult mice
McCaffrey et. al.
NATURE/VOL 418/2002.
Supresión por siRNAs
sintéticos: reducción de 82 ±
2.2% en la actividad luciferasa.
Supresión usando vectores de
DNA: reducción de 92.8 ± 3.4%
en la actividad luciferasa.
16
Los siRNAs no son las únicas especies de RNA pequeños
17
miRNA
™
ARN endógenos
™
Compuestos por alrededor de 25 nucleótidos
™
Los miARN son producidos cuando Dicer digiere dsARN imperfectas,
porque el apareamiento de los nucleótidos no es total.
™
Precursores de entre 70 y 200 nucleótidos.
™
Formados a partir de una región del genoma que se creía sin
función.
™
La estructura de varios miARN se mantiene sin cambios en
diferentes especies (conservado evolutivamente).
™
Cualquier alteración que interrumpa la actividad de los miARN lleva a
un desarrollo anormal de los individuos.
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Programa por defecto: cél. de la glía (astrocitos)
Programa alternativo: neuronas
Aparición de miR-124
Represión de Sox mRNA
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miARN y siARN
silencian a los genes después de que estos fueron transcriptos
pueden inducir la destrucción de
los ARN mensajeros
impedir su traducción a la
proteína correspondiente
20
¿Qué tamaño tienen los siRNA?
¿Qué función cumplen DICER y RISC?
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