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Ingeniería Genética II
Unidad VIII (parte 1)
RNAs no codificantes
RNAs no codificantes
En una célula existen numerosos tipos de RNAs que se sintetizan por
RNA polimerasas a partir del gDNA.
gDNA
Estos RNAs los conocemos con el nombre de transcriptos, dado que
surgen mediante el mecanismo conocido como transcripción.
Los transcriptos pueden ser clasificados en dos grandes grupos: los
codificantes para polipéptidos (mRNAs) y los no codificantes (ncRNAs).
Los ncRNAs presentan diversas funciones en la célula, y los mayormente
descriptos desde hace años son los rRNA (ribosomales), tRNA
(transferencia), snRNA (small nuclear, implicados en splicing) y snoRNA
(
(small
ll nucleolar,
l l implicados
i li d en modificación
difi
ió de
d rRNAs).
RNA )
Sin embargo, la observación de RNAs celulares ha revelado en los últimos
que existen muchas más variantes de ncRNAs.
años q
RNAs no codificantes
Fracción de gDNA codificante para polipéptidos.
A pesar que menos del 2% del gDNA humano es codificante para proteínas,
se ha visto q
que alrededor del 90% es activamente transcripto,
p , lo cual muestra
la importancia del transcriptoma no codificante.
Sana et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer . Journal of Translational Medicine 2012, 10:103
RNAs no codificantes
La enorme diversidad de ncRNAs derivó en su clasificación en dos
grandes grupos:
sncRNAs (small non-coding RNAs)
Hasta 200 b
lncRNAs (long non-coding RNAs)
200 b a ~100 kb
En los últimos años,
años se han asociado muchas patologías humanas a
alteraciones en el patrón de transcripción de estos ncRNAs.
RNAs no codificantes
Sana et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer . Journal of Translational Medicine 2012, 10:103
RNAs no codificantes
Sana et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer . Journal of Translational Medicine 2012, 10:103
RNAs no codificantes
Sana et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer . Journal of Translational Medicine 2012, 10:103
RNAs no codificantes
Sana et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer . Journal of Translational Medicine 2012, 10:103
RNAs no codificantes
Función de los lncRNA
Sana et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer . Journal of Translational Medicine 2012, 10:103
¿Cuál es uno de los sncRNA
más estudiados y aplicados
en Biología?
RNAs no codificantes
Dentro de los sncRNA, uno de las variantes más estudiadas y
aplicadas en Ingeniería Genética es la conformada por el grupo de
transcriptos conocido bajo el nombre de RNA de interferencia
(siRNA, de small o short interfering RNA).
Su rol biológico es participar en un mecanismo de
silenciamiento génico post-transcripcional activado por la
presencia de dsRNA (RNA doble cadena).
Los otros sncRNA que cumplen roles similares son los miRNAs
((microRNAs)) y los p
piRNAs ((PIWI-interacting
g RNAs).
)
Los siRNAs, miRNAs y piRNAs poseen entre 20-30 nt.
RNAs no codificantes
 Las primeras evidencias de la existencia de los siRNA datan de
l
los
años
ñ
80 del
d l siglo
i l pasado,
d cuando
d un grupo de
d científicos
i tífi
liderados por el biólogo molecular Rich Jorgensen trabajaban en
la obtención de petunias más coloridas.
Sobreexpresión
del gen que
codifica para
chalcona sintasa
(fenómeno de cosupresión).
RNAs no codificantes
 Resultados sumilares al fenómeno de co-supresión en plantas, se
observaron en 1992 al insertarse en el hongo Neurospora crassa
copias adicionales del gen al-1 (esencial en la biosíntesis de carotenoides)
con la intención de p
producir colonias con un color naranja
j más intenso.
Un tercio de las colonias quedaron blancas.
g ((represión
p
–
El fenómeno observado fue denominado “Quelling”
Romano y Macino, 1992).
RNAs no codificantes
 En 1995 Sue Guo y colaboradores presentaron un trabajo en el cual
utilizaban la técnica de RNA antisentido para silenciar el gen par-1
par 1 de
Caenorhabditis elegans. En sus experimentos observaron que tanto
el RNA antisentido como el RNA sentido (control) llevaban al
silenciamiento del gen en estudio (Guo y Kemphues,
Kemphues 1995).
1995)
Fire y colaboradores creyeron en la hipótesis del dsRNA:
imaginaron que los experimentos de Guo eran paradojales
exactamente debido a una contaminación de las moléculas de RNA
sentido con RNA antisentido, generando dsRNA que llevaban al
silenciamiento génico.
RNAs no codificantes
 En 1998 Andy Fire y Craig Mello mostraron que las inyecciones de
dsRNA eran más efectivas que la ssRNA en la generación de los
fenotipos mutantes
mutantes.
Sin sonda
sonda mex-3: wild type
sonda mex-3: antisense
sonda mex-3:dsRNA
gen mex
mex--3
RNAs
Inyectados
Sonda
para
hibridación
In situ
Hibridación in situ de
embriones en el estadio de
4 células.
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.
ANDREW FIRE, SIQUN XU, MARY K. MONTGOMERY, STEVEN A. KOSTAS, SAMUEL E. DRIVER & CRAIG C. MELLO. Nature 1998; 391: 806-11
RNAs no codificantes
Premio Nobel en Fisiología (12 de octubre de 2006)
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
Stanford Universityy School
of Medicine
Stanford, CA, USA
Universityy of Massachusetts
Medical School Worcester,
MA, USA
RNAs no codificantes
 El iRNA es activado por la presencia de dsRNA.
 Como otros sncRNA (miRNA y piRNA) se asocian a complejos
proteicos que contienen actividad nucleasa.
 Estos sncRNAs son complementarios a mRNA targets, lo que
impide la traducción de los mismos.
Alguna de sus funciones naturales son:
- Timing del desarrollo.
- Diferenciación celular.
- Proliferación celular.
- Muerte celular.
- Control del metabolismo.
- Disminución de la actividad de transposones.
- Defensa antiviral.
RNAs no codificantes
Mecanismo de los siRNA
En la célula, la presencia de dsRNA (genomas virales o sus intermediarios,
transposones, transcriptos muy estructurados) activa una maquinaria
ribonucleasa.
Así, la endonucleasa Dicer hidroliza el dsRNA a intervalos de 21-25
nucleótidos.
nucleótidos
Luego, estos pequeños fragmentos de dsRNA son capturados por la
proteína Argonauta (AGO), la cual retiene una de las dos cadenas
(h b guía)
(hebra
í ) en ell centro de
d un complejo
l j denominado
d
i d RISC (RNA(RNA
induced silencing complex) conformado por Dicer, Argonauta y una
dsRNA binding protein (TRBP en humanos). La otra cadena (hebra no
guía) es eyectada del complejo.
Posteriormente, RISC usa la hebra guía para encontrar un ssRNA
perfectamente complementario y cataliza el corte del blanco.
El RNA blanco es liberado y el complejo RISC es reciclado en otro
corte.
RNAs no codificantes
RNAs no codificantes
Mecanismo de los miRNA
Los miRNA, a diferencia de los siRNA, son codificados por el gDNA.
Son transcriptos a partir de genes como pri-miRNAs de 65-70 nt
conteniendo una estructura de loop.
El pri
pri-miRNA
miRNA es llevado al citoplasma y procesado por el complejo
Drosha-DGCR8 para generar un pre-miRNA.
Luego, Dicer cliva el pre-miRNA produciendo un miRNA dúplex.
Así, Argonauta toma la hebra guía y busca complementariedad con el
mRNA (usualmente en el extremo 3´)
Dado que la complementariedad suele ser imperfecta, no se produce
una actividad de corte. Aún no está bien descripto el mecanismo, pero se
cree que el mRNA se despoliadenila y eso lo marca para su degradación.
RNAs no codificantes
Mecanismo de los siRNA y miRNA
Annu. Rev. Biophys. 2013. 42:217–39
RNAs no codificantes
Mecanismo de los miRNA
Annu. Rev. Biophys. 2013. 42:217–39
RNAs no codificantes
Mecanismo de los piRNA
La biogénesis de los piRNA (24-31 nt) aún no ha sido completamente
dilucidada.
Se sabe que están involucrados en el silenciamiento de los
transposones en las líneas germinales de los animales.
Los precursores de los piRNA son ssRNAs y no participa Dicer.
En el silenciamiento de los elementos móviles controlados por piRNAs
actúan
ú
l
las
proteínas
í
PIWI Aubergina
PIWI,
A b
i
(AUB) y Argonauta
A
3 (todas
( d
perteneciente a la familia de Argonautas),
RNAs no codificantes
Mecanismo de los piRNA
Biogenesis of small RNAs in animals.
Kim VN, Han J, Siomi MC. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2009 Feb;10(2):126-39.
RNAs no codificantes
NATURE|Vol 457|22 January 2009|doi:10.1038/nature07755
RNAs no codificantes
Proteínas involucradas
DICER
E d
Endonucleasa
l
d dsRNA
de
d RNA
Familia: RNAsa III
Localización: citoplasma
Sustrato: longdsRNAs y pre-miRNAs
Productos: dsRNAs de 21-25 pb con
extremos protruyentes 3´ (2 nt).
También posee dominio helicasa
RNAs no codificantes
Proteínas involucradas
AGO
Proteína multidominio
Dominio RNAsa H (actividad slicer)
Localización: citoplasma
Sustrato: híbridos siRNA/mRNA o
miRNA/mRNA
Productos: mRNA hidrolizado (si era
siRNA/mRNA) a 10-11 nt del 5´ del
siRNA.
RNAs no codificantes
Proteínas involucradas
DROSHA
E d
Endonucleasa
l
d dsRNA
de
d RNA
Familia: RNAsa III
Localización: Núcleo
Sustrato: pri-miRNAs
Estructura desconocida
Requerimiento: DGCR8 (PASHA en
invertebrados)
Productos: dsRNAs de 21-25 pb con
extremos protruyentes 3´ (2 nt).
RNAs no codificantes
Proteínas involucradas
Existen otras proteínas involucradas, variando en identidad y tipo
según la especie de organismo.
Entre
E
t ellas,
ll
actúan
tú
un grupo de
d polipéptidos
li é tid
d
denominados
i d dsRBD
d RBD
(dsRNA binding domain protein).
Estas p
proteínas colaboran con Dicer y Drosha en la captura
p
del
dsRNA que desencadena el mecanismo de la interferencia. .
Algunas de estas proteínas son Loqs o R2D2.
RNAs no codificantes
Biogénesis de los endo-siRNA y exo-siRNA
Biogenesis of small RNAs in animals.
Kim VN, Han J, Siomi MC. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2009 Feb;10(2):126-39.
RNAs no codificantes
Mecanismos de silenciamiento
¿Cómo se puede aplicar el
conocimiento del mecanismo
de interferencia de RNA?
RNAs no codificantes
Aplicaciones de los siRNA
El mecanismo natural de interferencia mediado por dsRNA ha sido
explotado desde los inicios del siglo XXI para silenciar genes.
El silenciamiento génico o knockdown consiste en el ingreso de dsRNA
en una célula
él l para disparar
di
ell mecanismo
i
d interefencia.
de
i t
f
i
Este procedimiento puede ser transitorio (a través del ingreso directo de
dsRNA o de un transgén
g
que lo exprese)
q
p
) o estable ((en este caso es
necesario modificar el gDNA).