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locus GH: nuevas hormonas Hugo A. Barrera Saldaña Universidad Autónoma de Nuevo León Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica y Medicina Molecular Laboratorio de Genómica y Bioinformática. El locus HORMONA DEL CRECIMIENTO DEL GENOMA HUMANO (hGH) HIPOFISIS GH1 CD79b PLACENTA CSHL CSHA GH2 CSHB TCAM 17q24.2 Chen et al., Genomics 1989 4(4):479-97. BIOLOGÍA MOLECULAR DEL locus hGH GH-N CSH-L CSH-1 GH-V CSH-2 Genes 50kb Tejidos % RNAm Proteínas 3 0.01 1 22 kDa ? 22 kDa < 0.001 20kDa 25 kDa 20 kDa 22kDa 26 kDa 17.5 kDa 24 kDa 0.5 22kDa HORMONAS CONTRIBUIDAS POR EL locus hGH CD79b GHN CSHL CSHA GHV CSHB TCAM GH-N: Regula crecimiento y procesos metabólicos después del nacimiento GH-V: Regula el crecimiento y metabolismo del feto, en reemplazo de la GH-N CSH: En madre, anti-insulina y lipolítica para energía fetal y somatotrópica en éste REGULACIÓN GÉNICA EN EL locus hGH PLACENTA HIPÓFISIS Inhibidor hipofisiario Potenciador placentario Promotor 2 kb 2.3 kb CONTROL DE LA EXPRESIÓN TEJIDO-ESPECÍFICA GH-N CSH-L CSH-A GH-V Hipófisis GH-N CSH-L CSH-A GH-V Placenta CSH-B CSH-B EVOLUCIÓN ANTES DE GENÓMICA COMPARATIVA EXPANSIÓN DE REGIONES INTERGÉNICAS CD79B GH CSH CSH CSH TCAM IGM IGL Locus Humano CD79B GHN CSHL CSHA GHV CSHB TCAM ABORDAJE GENÓMICO COMPARATIVO ENCYCLOPEDIA OF DNA ELEMENTS VERTEBRADOS MAMÍFEROS PLACENTARIOS PRIMATES Proyecto ENCODE ≈ 20 FAMILIAS GÉNICAS • Bien estudiadas • Gran cantidad de datos • Secuencias para comparar NO INCLUYE A FAMILIA GH NATURE. Vol 447, June 2007, 799 – 816. EL ENIGMA DEL locus hGH Excepción evolutiva: ¡En vez de unigénico, pentagénico! ¿Cómo se adquirieron los genes? ¿Por qué surgieron las nuevas hormonas? ¿Cómo y cuándo surgió la especificidad tisular? ¿Cuáles son las diferencias entre las proteínas? ¿Y cuál su rol en el éxito evolutivo de nuestra especie? TODO COMENZÓ CAZANDO GENES GH Regiones Inter-génicas I II III Promoter IV V Promoter I II Intergénicas Genes 2,560 pb Gen 2 11,496 pb 1,700 pb 5,077 pb III Gen 1 IV V Y LUEGO CAZANDO loci GH DE PRIMATES ESTREPSIRRINOS GH Gálago Senegal Adkins, R.M., 2001. Mol Biol Evol 18, 55-60. Multiplicación de genes PLATIRRINOS GH Ψ Ψ Ψ GH GH Ψ Ψ Tití común Wallis, O. C. y Wallis, M., 2006. J Mol Evol V63(5): 591-601. CERCOPITECOIDEOS GHN CSH1 Expansión de regiones IGs GHV CSH2 CSH3 CSH4 Mono rhesus González-Álvarez, R. et al.2006. Gene 380, 38-45.. HOMINOIDEOS CD79B GHN CSHL Locus humano Homo sapiens CSHA GHV CSHB TCAM “MINERÍA DE UN TESORO”: BACs GHs DE PRIMATES Origen de los BACs = Children’s Hospital Oakland Research Institute. Oakland USA --- Secuenciación = Genome Quebec, Canadá. MAPEO Y SECUENCIACIÓN DE LOS BACS GHs Homo sapiens Locus GH HOMINOIDEOS Pan troglodytes CHORI251-1 Gorilla gorilla CHORI255-1 Pongo abelii CHORI253-3 CERCOPITECOIDEOS Chlorocebus pygerythrus CHORI252-2 Chlorocebus pygerythrus CHORI252-83J13 Macaca mulatta CHORI250-1 CHORI250-6 Papio anubis RPCI4-1 PLATIRRINOS Saimiri boliviensis CHORI245-3 Callicebus moloch LBNL-7 Callithrix jacchus CHORI259-2 Aotus nancymaae CHORI258-2 ESTREPSIRRINOS Lemur catta LBNL-4 RECONSTRUYENDO HISTORIA EVOLUTIVA EMERGIENDO LOS PRIMEROS loci GHs CD79B Lemur GH Ψ Ψ Ψ GH GH Ψ Ψ TCAM Similitud a Hs Enh ≈ 88% Tití común (Callithrix jacchus) GHN CD79B • completamos regiones y genes flanqueantes CSH1 GHV CSH2 CSH3 CSH4 Mono Rhesus IGL Hum2 IGL Rhes3 hipófisis placenta TCAM X (Macaca mulatta) Tejido de Expresión • completamos regiones y genes flanqueantes (Lemur catta) CD79B Similitud a Hs Elem P ≈ 83 % Enh ≈ 78% TCAM GH • completamos regiones faltantes hipófisis placenta RESOLUCIÓN DE CONFLICTOS EN locus GH DEL CHIMPANCÉ Ensamblaje en siete genes por el NCBI GH GH GAP CSH CSH GAP CSH GAP GH GAP CSH GAP GAP GAP CONFLICTO CONFLICTOS RESUELTOS ENSAMBLAJES Y ANOTACIÓN: PARTICULARIDADES CD79B GHN CSHA Locus Chimpancé (Pan troglodytes) HOMINOIDEOS CSHB GHV CSHC TCAM • sec. totalmente curada • 5 genes RESOLUCIÓN DE CONFLICTOS EN locus GH DE ORANGUTÁN Arreglo de 4 genes CD79b EP GHN ENH EP EP CSH1 GHV CSH378F ENH TCAM CSH2 CSH348R X PCR –> No se genera amplicón Arreglo de 5 genes CD79b EP GHN ENH CSH1 CSH378F EP ENH EP CSH2 CSH348R PCR –> Generaría amplicón de ~10 Kpb EP GHV ENH CSH3 TCAM RECAPITULANDO: pasos clave en evolución del locus GH CD79B + ↑ Número de genes CD79B GH Ψ TCAM GH Ψ Ψ GH GH Ψ TCAM Ψ ↑ Longitud de regiones IGs CD79B GH CSH CSH CSH TCAM IGM IGL Locus Humano CD79B GHN CSHL CSHA GHV CSHB TCAM Y EMPEZARON A EMERGER MÁS ENIGMAS EVOLUCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GH EN LA PLACENTA EXPANSIÓN GÉNICA CD79B GH EXPRESIÓN DIFERENCIAL TCAM ESTREPSIRRINOS CD79B GH Ψ Ψ Ψ GH GH Ψ Ψ TCAM PLATIRRINOS CD79B GHN CSH1 GHV CSH2 CSH3 CSH4 CERCOPITECOIDEOS CD79B GHN CSHL CSHA GHV CSHB HOMINOIDEOS TCAM TCAM TRANSCRITOS GHs EN PLACENTA DE BABUINO Tejido de Placenta RNA y su caracterización (Agilent Technologies.) Alineamiento / análisis / inferencias RT-PCR Vector de clonación Secuenciación capilar BIOENSAYOS in vitro DE NUEVAS HORMONAS Enzymatic digestion. PCR subclonación Plasmidos con genes GH-N Cél. HeLa Actividad Biológica Cél. 3T3L1 / Nb2 Transfección Mauricio Salinas Santander LA GH ANCESTRAL Y LAS NUEVAS HORMONAS GH-N ESTREPSIRRINOS PLATIRRINOS CERCOPITECOIDEOS HOMINOIDEOS GH? y Ψ GH-V CSH y Ψ LAS HORMONAS DE loci GHs EN HOMINOIDEOS GH-N HOMINOIDEOS (Gorilla Gorilla) HOMINOIDEOS (Pan troglodytes) HOMINOIDEOS (Homo sapiens) GH-V CSH GHs HIPOFISIARIAS DE PRIMATES Δ aa vs. Hs Hs - 0 Pt - 1 Mm - 5 Cj - 17 Lc - 64 MODELAJE COMPARATIVO DE GHs HIPOFISIARIAS HUMANO CHIMPANCÉ DIFERENCIAS VS. HUMANO RHESUS POSITIVO TITÍ NEGATIVO LEMUR NEUTRO ALINEAMIENTO DE LAS SECUENCIAS AMINOACÍDICAS hGH-N * * * * cGH-N hGH-V hCSH-L hCSH-1 hCSH-2 cGH-V cCSH-B cCSH-C cCSH-D hGH-N * cGH-N hGH-V hCSH-L hCSH-1 hCSH-2 cGH-V cCSH-B cCSH-C cCSH-D DETERMINANTES EN LA FUNCION GHs → Ile4, Glu56, Arg64, Ile179 CSHs → Val4, Asp56, Met64, Met179 BASADO EN DATOS EXPERIMENTALES (Goffin et al., 1996) ENIGMA EVOLUTIVO: loci vs anatomía?-fisiología? GENES: PEQUEÑAS DIFERENCIAS, GRANDES CAMBIOS • FOXP2 Sonidos vocálicos y consonánticos • MCPH1, ASPM, CENP Controla el tamaño del cerebro • HAR1 Desarrollo de la corteza cerebral • SIGLEC11 Expresión específica en el cerebro The Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium. Nature, 2005 • Iram Rodríguez Sánchez • Antonio Alí Pérez • Pieter de Jong • Mike Wallis • Genome Quebec ACADEMIA MEXICANA DE CIENCIAS Y A UDS POR SU ATENCIÓN AYUDA DE “PEPENA” DE PROYECTOS GENÓMICOS BACs -- SECUENC. OBTENIDAS SECUENC. REPORTADAS Programas Bioinformáticos
