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TRABAJO PRÁCTICO 1 – BIOLOGÍA CELULAR
LA MICROSCOPIA CONFOCAL COMO HERRAMIENTA EN BIOLOGÍA CELULAR
La biología celular emplea múltiples estrategias para conocer a fondo el origen, la evolución y
las propiedades de la célula. Algunas de estas son el fraccionamiento subcelular mediante
centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis y la microscopia entre otras.
La microscopía confocal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional,
permite eliminar la señal de fluorescencia que está fuera de foco de una muestra
semitranslucida. Otra ventaja es que se pueden obtener de forma no destructiva secciones
ópticas de distintos planos de la muestra. Las secciones ópticas obtenidas contienen la
información para poder realizar posteriormente un análisis tridimensional: cuantificación y
análisis volumétrico de la colocalización, distribución de fluorescencia etc. para la observación
de la parte interna de una muestra.
Las principales aplicaciones de la microscopía confocal son entre otras:
1-Análisis de colocalización: Se puede analizar la co-expresión de proteínas u otro tipo de
moléculas en una misma célula, usando hasta 4 fluorocromos diferentes. La co-localización
permite determinar si una molécula de interés se expresa simultáneamente en una misma
región y se pone de manifiesto mediante la visión de la mezcla de colores de los diferentes
fluorocromos. Puede ser utilizado tanto en cultivos celulares como en secciones de tejidos y
“whole mount”.
2-Inmunofluorescencias y detección de sondas fluorescentes: Mediante ensayos
multicolores basados en el uso de hasta 4 fluorocromos acoplados a anticuerpos específicos se
pueden estudiar distintos procesos celulares como apoptosis y proliferación celular,
localizaciones celulares y subcelulares, estudios de difusión, expresión de proteínas, entre
otros. Se basa en la interacción Ag-Ac y la emisión de fluorescencia.
3-Hibridación in situ fluorescente (FISH): Mediante el uso de sondas de RNA acopladas a
fluorocromos se puede estudiar la expresión génica en un tejido.
4-Series Z (Reconstrucciones 3-D): La microscopia confocal permite obtener múltiples planos
focales del mismo preparado. Esa pila de imágenes puede ser posteriormente procesada en
forma digital lo que permite generar una imagen bidimensional calculada (proyección) o una
representación reducida en 3 dimensiones de la muestra con el software apropiado. Las Series
Z realizan una serie de capturas en los diferentes planos de la muestra que posteriormente
pueden ser integrados para obtener una reconstrucción 3D de la muestra. El número de cortes
y calidad de la reconstrucción 3D depende del grosor de la muestra por lo que no es adecuada
para muestras/células con bajo volumen.
5-Time Series (Series Temporales): Permite analizar células in vivo y en tiempo real mediante
la captura de imágenes de la preparación a intervalos definidos (ms, seg, min) y así generar
una película que permita observar la evolución de la muestra en el intervalo de tiempo definido.
6-FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching). El método de Recuperación de
Fluorescencia Tras Fotoquemado es una técnica que permite observar el movimiento
intracelular mediante quemado de la fluorescencia de una zona o molécula de interés. Un área
específica de la muestra se quema mediante la acción del laser confocal, la pérdida y
recuperación de fluorescencia es utilizada entonces para determinar como se recupera esta
fluorescencia que se relaciona con la difusión y/o desplazamiento de la molécula
“fotoquemada”
7-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) La técnica FRET (Transferencia de
Energía por Resonancia Fluorescente) es una técnica que permite estudiar la interacción entre
dos moléculas (proteínas, lípidos o ácidos nucleicos). Permite caracterizar con enorme
precisión la distancia entre 2 moléculas. Se basa en la presencia de 2 moléculas fluorescentes:
un donante y un aceptor. La molécula “donante” puede ser excitada a una longitud de onda
específica y a su vez provocar la excitación de la molécula “aceptora” que a su vez emitirá una
fluorescencia detectable. Esto permite analizar la interacción entre moléculas.
El objetivo de este práctico es familiarizarse con las técnicas de marcación mediante el uso de
marcadores fluorescentes para distintos componentes celulares y el uso del microscopio
confocal.
A partir de un cultivo de células A549 (Línea celular de adenocarcinoma de epitelio pulmonar
humano), para las marcaciones se utilizará:
MitoTracker: Marcador específico de mitocondrias. Se trata de un fluorocromo rojo que difunde
pasivamente por la membrana plasmática para luego acumularse en la mitocondrias de las
células vivas. Esta entrada y acumulación depende del potencial de membrana mitocondrial.
Anticuerpo anti-Lamina B1: La lamina B1 es un tipo de filamento intermedio que forma parte
de la lámina nuclear. Es una proteína clave que participa, entre otros subtipos de laminas, en la
estabilidad nuclear, estructura de la cromatina y en la expresión génica. Se encuentra
localizada al lado de la membrana nuclear interna. Al inicio del ciclo celular, las laminas se
fosforilan lo que provoca el desarmado de la lámina nuclear causando la ruptura de la envoltura
al inicio de la división celular. Mediante el uso de un anticuerpo secundario acoplado a
fluoresceína, se procederá a identificar su localización subcelular y las diferencias entre
células que forman el cultivo de esta línea tumoral en distintos momentos del ciclo celular.
Ioduro de propidio Es una molécula fluorescente que se intercala entre las bases de DNA y es
muy utilizado para determinar viabilidad celular ya que sólo marca los núcleos de células
muertas. También es utilizado como coloración de fondo para marcar los núcleos en un cultivo
o corte histológico cuando se utilizan técnicas inmunocitoquímicas. Cuando está unido a los
ácidos nucleicos la excitación máxima es de 535 nm y la emisión es de 617 nm, por lo que
fluorece en rojo. Al unirse tan específicamente a la cromatina, se puede utilizar también para
diferenciar entre células necróticas, apoptóticas y normales
El trabajo se desarrollará en dos clases de laboratorio consecutivas (2 jueves). Por una
cuestión de organización temporal y posibilidades técnicas del desarrollo del práctico, algunos
pasos deberán ser hechos por los docentes (Día 0).
Día 0:
1.
Incubar las células 30 min en estufa gaseada a 37 ºC con el MitoTracker en una
concentración de 1 µM.
2.
Fijar las células con Metanol por 10 min a -20 ºC
3.
Retirar el metanol y dejar que se sequen
4.
Lavar 3 veces por 5 min cada lavado con PBS+1%Triton X100
5.
Bloquear proteínas inespecíficas incubando 90 min con BSA 2%
6.
Sin lavar agregar el anticuerpo primario anti-lamina B1 (anticuerpo monoclonal,
dilución 1/150) e incubar ON a 4 ºC.
Día 1: Cada grupo recibirá dos cultivos de células A549 (A: con MitoTracker y B: sin
MitoTracker). Proteger todo el tiempo de la luz blanca.
1.
Lavar el anticuerpo primario 3 veces por 5 min cada lavado con PBS+1%Triton X100.
2.
Incubar con anticuerpo anti mouse biotinilado (1/300) 1 h a Temp. ambiente en
agitación.
3.
Lavar el anticuerpo secundario 3 veces por 5 min cada lavado con PBS+1%Triton
X100
4.
Incubar con estreptavidina acoplada a FITC (verde) 1 h a Temp. ambiente en agitación.
5.
Lavar 3 veces por 5 min cada lavado con PBS+1%Triton X100.
6.
Sólo el cultivo B: Incubar con Ioduro de Propidio 3 min. Lavar 3 veces por 5 min con
PBS+1%Triton X100.
7.
Montar los vidrios que contienen las células con Glicerol:PBS (50:50) sobre un
portaobjetos limpio.
8.
Guardar en la heladera en oscuridad hasta llevar al confocal
Día 2:
Observación en el microscopio confocal.