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Trabajo Fin de Grado
MARCADOR DE BRECHA
MEDIANTE MICROFOTOGRAFÍA
SOBRE CÉLULAS EPIDÉRMICAS
CULTIVADAS EN PETRI PARA
DETERMINAR EL EFECTO DE
ELECTROTERAPIA
Marina De Andrés Zamora
Grado en Ingeniería Electrónica y Automática Industrial
Estructura
 Proyecto de investigación biomédica
 Proyecto de ingeniería
 Análisis de los resultados
 Conclusiones
 Preguntas, dudas…
Motivación del proyecto
 Colaboración entre la Universidad Politécnica y el Laboratorio del
Servicio de Bioectromagnetismo del Hospital Universitario Ramón y
Cajal de Madrid.
 Automatización de una etapa de análisis y procesamiento de imágenes
de microscopía. Técnica experimental laboriosa, monótona y subjetiva.
 Solución eficaz y objetiva. Ahorro de tiempo al personal especializado y
perfeccionamiento de las técnicas utilizadas.
Investigación biomédica en Electroterapia
 Objetivo del estudio de investigación.
•
Nivel biológico
 ¿Qué es la Electroterapia?
 Aplicación de energía electromagnética al organismo.
 0 Hz - 1.000 Hz (baja frecuencia)
 450.000 - 600.000 Hz (alta frecuencia)
 Transferencia Eléctrica Capacitiva Resistiva (TECR)
 TEC: Transferencia Eléctrica Capacitiva
 TER: Transferencia Eléctrica Resistiva
Protocolo de investigación empleado
1.
Cultivo o siembra de células epiteliales.
•
•
•
Queratinocitos humanos.
Placas Petri. Una semana.
Cultivos control y cultivos tratado.
2. Realización del surco en la monocapa.
• Micropipeta P1000 o P200.
• Longitud del surco: ~ 2 ó 3 cm.
Protocolo de investigación empleado
3. Dibujo de marcas guía en las placas Petri
Protocolo de investigación empleado
4.
Realización de imágenes de microscopia a las cero horas
•
•
•
Microscopio Nikon. Objetivos 10x.
Cámara Nikon D90.
Seis imágenes por placa  Seis puntos.
Protocolo de investigación empleado
5.
Electro-Estimulación de las placas Petri
•
•
•
6.
Electrodos conectados en serie.
50 ó 100 µA/mm2 aplicados en pulsos de cinco minutos cada, aprox., 4 horas.
Experimentos a cuatro, seis, doce o veinticuatro horas.
Obtención de imágenes de microscopía post-tratamiento
/ Siguiente estimulación
Problemática a resolver mediante procesamiento de imágenes
 Estado de la técnica antes de automatizarla.
 Medida de un área sobre microfotografías
Objetivos del proyecto de ingeniería
 Diseño y búsqueda de algoritmos de procesamiento de imágenes para
un determinado tipo de microfotografías.
 Interfaz Gráfica de Usuario de uso lo más simple e intuitiva posible.
 Procesamiento por directorios o carpetas.
 Rapidez, precisión y generación/extracción de valores numéricos.
Herramientas para el procesamiento de microfotografías
Instituto Nacional de
Salud Mental (NIMH)
MATrix LABoratory
Image Processing Toolbox
CMEIAS (Center for
Microbial Ecology
Image Analysis System)
Algoritmos de segmentación y procesamiento
 Algoritmo empírico
 Algoritmo de segmentación por textura
Algoritmos de segmentación y procesamiento
Algunos ejemplos…
…Los algoritmos también cometen errores
Interfaz de aplicación biomédica.
 Posibilidad de intercambiar, de manera sencilla, el
algoritmo seleccionado para el procesamiento.
 Procesar automáticamente carpetas de
microfotografías.
 Uso fácil e intuitivo.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
Interfaz de aplicación biomédica. Excel.
Herramientas y técnica para el análisis estadístico de datos
 ANOVA Simple
 Distribución t de Student
Análisis de resultados.
Experimentos estimulados a 50 µA/mm2
 Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.
 Time = 4 horas
•
•
•
Variable dependiente: Th
Numero de observaciones: 164
Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT
Casos
Media
0
78
58,52
1
66
58,78
Análisis de resultados.
Experimentos estimulados a 50 µA/mm2
 Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.
 Time = 6 horas
•
•
•
Variable dependiente: Th
Numero de observaciones: 69
Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT
Casos
Media
0
36
42,99
1
33
46,66
Análisis de resultados.
Experimentos estimulados a 50 µA/mm2
 Porcentaje de cicatrización a un tiempo T.
 Time = 6 horas
•
•
•
Variable dependiente: (0h-Th)/0h*100
Numero de observaciones: 69
Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT
Casos
Media
0
36
26,61
1
33
25,07
Análisis de resultados.
Experimentos estimulados a 100 µA/mm2
 Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.
 Time = 6 horas
•
•
•
Variable dependiente: Th
Numero de observaciones: 209
Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT
Casos
Media
0
106
51,68
1
103
54,47
Análisis de resultados.
Experimentos estimulados a 100 µA/mm2
 Porcentaje de cicatrización a un tiempo T.
 Time = 6 horas
•
•
•
Variable dependiente: (0h-Th)/0h*100
Numero de observaciones: 209
Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT
Casos
Media
0
106
27,64
1
103
24,52
Conclusiones proyecto de investigación
 En general, no existen evidencias de diferencias significativas al
comparar los experimentos control con los tratado.
 Una inhibición de la emigración de las células epidérmicas puede afectar
favorablemente al proceso general de cicatrización de heridas cutáneas, al
evitar problemas originados por el cierre prematuro de la epidermis con
respecto a la dermis. Cierre en falso.
 Posible tendencia a que existan diferencias significativas en los experimentos
estimulados a 100 µA/mm2. A partir de esta intensidad por unidad de
superficie, la temperatura aumenta y las células sufren hipertermia.
Tiempo
(h)
I/sup
50 µA/mm2
6
100 µA/mm2
Variable dependiente
Razón F
Valor - P
Porcentaje de brecha
0,94
0,3348
Porcentaje de
cicatrización
0,13
0,7166
Porcentaje de brecha
2,24
0,1362
Porcentaje de
cicatrización
2,37
0,1252
Conclusiones proyecto de ingeniería
 Logro de la automatización de la etapa.
 Aplicación informática que facilita el análisis y el




procesamiento de imágenes de microscopía.
Implementación de un método medida preciso y objetivo.
Herramienta intuitiva y de fácil uso.
Importante ahorro de tiempo, pudiendo procesar y analizar
una cantidad determinada de microfotografías en pocos
minutos.
Aporte al gran mundo que engloba lo relacionado con la
investigación y el desarrollo.
Publicitación del Congreso de INDIBA
FIN
Rueda de preguntas, dudas…
…¡¡GRACIAS!!