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ANTICUERPOS
Variabilidad para el reconocimiento de infinidad de ags
Constante capacidad para generar mecanismos efectores
Ag
HUMORAL
CELULAR
NK
LB memoria
LT citotóxico
LT ayudador
Opsonización
Activación de C´
Neutralización de antígenos
Hojas β antiparalelas
Barril β
Dominios
Secuencias conservadas con motivos recurrentes, plegados
en subunidades globulares compactas, capaces de interactuar
en complejos macromoleculares
Dominios constantes: 110 aa
Dominios variables: 126 aa
Interacciones entre dominios de diferentes cadenas polipeptídicas
Cada una de las unidades funcionales de los anticuerpos son
dominios dimerizados
Un monómero de Ig comprende cuatro cadenas polipeptídicas
unidas por interacciones hidrofóbicas y estabilizadas por
uniones disulfuro
F(ab)’2
pepsina
papaina
ToY
REGION VARIABLE
Determinar la variación en las regiones variables generadas
frente al mismo antígeno:
Número de aa diferentes observados en una posición
Frecuencia de la mayoría de aa comunes en la misma posición
Hipervariables:
Complementarity Determining
Regions
CDR1, CDR2, CDR3
Menos variables: Framework Regions (FRs)
L
V
5´
J
Κ λ
VL
CL y CH
Menos de 20 genes
VL y VH
Cientos de genes
Recombinación somática
C
3´
V
D
J
5´
C
γµδεα
3´
ISOTIPOS
CL : k , λ
VH
CH :α1 , α2
γ1 , γ2 , γ3 , γ4
δ
ε
µ
IgA
IgG
IgD
IgE
IgM
Regiones C de L y H
Individuos misma especie
Determinantes de región variable
SELECCIÓN CLONAL
Virgen
IgM
Baja afinidad
Estímulo agco continuado
Cambio de isotipo
Hipermutación somática
Generación de memoria
IgG
Alta afinidad
Maduración
afinidad
L
V
5´
J
Κ λ
C
3´
V
D
Cambio de
isotipo
J
5´
VL
CL
CL y CH Menos de 20 genes
VL y VH Cientos de genes
Recombinación somática
C
γµδεα
VH
CH
3´
CAMBIO DE UNA BASE NITROGENADA
• Nuevo puente de H
• Nueva interacción hidrofóbica
• Altera la flexibilidad de unión al ag (mutado menos
4 - 5 A°.
• Aumentar el contacto directo, disminuyendo la
capa de solvatación
Efecto aditivo en la fuerza de unión
Aumento en la afinidad
Mayor afinidad
Mayor avidez
•La respuesta del Sistema Inmune a los antígenos
es policlonal
Cuales son los mecnismos efectores de
los anticuerpos in vivo?
Activación del complemento
Opsonización
SISTEMA DE COMPLEMENTO
1. Grupo de proteínas que circulan de forma inactiva.
2. Actúa como un sistema en cascada (zimógeno).
3. Hace parte de la inmunidad innata y adaptativa.
4. Es un mecanismos efector del sistema inmune.
5. Ataca membranas biológicas.
6. Los genes que codifican las proteínas se encuentran
distribuidos en casi todos los cromosomas.
VIAS DE ACTIVACION DEL COMPLEMENTO
VIA CLÁSICA DEL COMPLEMENTO: C1
Modelos de IgM en forma plana (a) y en forma de
araña (b)
Activación de complemento por via
clásica
Hidrólisis de C3 por C3 convertasa
C3 nativo
C3 activado
Anafilotoxina
Opsonina
Activación de Complemento por vía Alterna
FORMACION DEL CAM
Anafilotoxina
Complejo poli-C9
Lesiones de C' en GR
FUNCIONES DEL COMPLEMENTO
1. Daño de la membrana y lisis celular.
2. Opsonización.
3. Inflamacion.
4. Anafilotoxinas.
5. Limpieza de complejos inmunes.
6. Activación de linfocitos B.
C1-inhibidor
Proteína de unión a C4b / Factor I
Factor H / Factor I
DAF ; CD55
Proteína S
Factor de restricción homologo y CD59
y CD59
E.coli intactas
Bacterias muertas por lisis C'
FAGOCITOSIS
• Proceso mediante el cual una célula internaliza y digiere
material particulado de más de 1µm de diámetro.
• En amebas y otros organismos, este es un proceso
utilizado para la nutrición.
• En mamíferos, para remoción de mo, células muertas, detritos
tisulares, agregados proteicos y cuerpos extraños.
CÉLULAS FAGOCÍTICAS
•Neutrófilos: Maduran por 6 días de precursores en médula ósea, circulan
en sangre periférica pocas horas, entran a los tejidos, mueren por apoptosis
y son removidos por macrófagos residentes.
•Mastocitos: Células residentes del tejido en regiones perivasculares.
Principalmente en pulmón, piel e intestino.
•Mo/MØ: Mo sanguíneos migran a los tejidos donde se diferencian en MØ,
cuyo fenotipo depende del microambiente tisular. MØ inflamatorios difieren
de los residentes tisulares.
•Células dendríticas: Residentes de tejidos y migran a órganos linfoides
secundarios.
FASES DE LA FAGOCITOSIS
• Marginación Leucocitaria
• Quimiotáxis
• Reconocimiento
• Adhesión
• Fagocitosis
• Degranulación
• Muerte Intracelular
Migración
Selectinas
Integrinas
Diapédesis
Quimiotaxis:
Estímulo
inflamatorio
Movimiento celular dirigido a favor
de un gradiente de concentración
de un agente quimiotáctico
RECONOCIMIENTO Y ADHESION: Mediado por receptor
Receptor de manosa
Receptores
LPS
Antígeno
R-Fc
Receptores
complemento
Opsoninas
Opsonización: Recubrimiento
de antígenos para facilitar la
fagocitosis
FAGOCITOSIS
Ingestión de los antígenos por las células fagocíticas
OPSONIZACION: Proteínas de fase aguda
ENDOCITOSIS MEDIADA POR RECEPTOR
Formación del fagosoma
Endocitosis
Formación del
fagosoma
Formación del
Fagolisosoma
Degranulación
DEGRANULACION: Contenido de los gránulos de los neutrófilos
GRANULOS
AZUROFILOS
GRANULOS
ESPECIFICOS
GRANULOS DE
GELATINASA
Proteínas solubles
Proteínas microbicidas
Mieloperoxidasa
Lizosima
Defensinas
Lisosima
Otras Enzimas
Hidrolasas ácidas
lisosomales
Elastasa
Proteínasa 3
Colagenasa
Gelatinasa
Otras Proteínas
Lactoferrina
Proteínas Especificas
Complemento CR3
Quimiocinas
Receptores para:
Otras proteínas
Gelatinasa
CD63
CD11b/CD18
Complemento CR1
FCγRIII
ESTALLIDO RESPIRATORIO
El estallido respiratorio resulta en el consumo de oxígeno
intracelular, produciéndose peróxido de hidrógeno, halógenos
oxigenados y radicales superóxido e hidroxilo.
Ácido
hipoalogenoso
Oxígeno molecular
NADPH oxidasa
OCL+
Productos Intermediarios
Reactivos del Oxígeno
ROI
Peróxido de H
H2O2
Anión superóxido
2O2+
2H+
H2O
Superóxido
dismutasa
Aumento de pH
Activación enzimas
+
O2
Mieloperoxidasa
+
Cl- (ión halogenuro)
PRODUCCION DE OXIDO NÍTRICO
L-Citrulina
L-Arginina
+
NO+ (Óxido nítrico)
Liberación citocinas
pro-inflamatorias
y endotoxinas
Óxido Nítrico sintetasa (NOS)
Endotelial (eNOS)
Neural (nNOS)
Calcio independiente (iNOS)
NO: Radical libre en estado gaseoso que difunde al fagolisosoma y es
citotóxico para bacterias, virus, protozoos y células tumorales.
LIGANDOS UNIDOS POR
MACROFAGOS
OPSONINAS
C3 Y C4
Igs ( IgG, vía receptor Fc)
Proteínas de unión a manosa,
TLRs
FACTORES QUIMIOTACTICOS
Componentes complemento C5a
Trombina
Fibrina
CITOCINAS
GM-CSF, M-CSF
IL-1, IL-3, IL-6, IL-10
TNF
TGF-b
HORMONAS Y OTROS
MEDIADORES
Insulina
Histamina
Lactoferrina
PRODUCTOS SECRETADOS POR
MACRÓFAGOS
ENZIMAS
Lisosima
Hidrolasas ácidas (proteasas, nucleasas,
glicosidasas, lipasas)
Elastasa
Colagenasa
MEDIADORES
IFNs
GM-CSF, M-CSF
IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12
Quimiocinas
COMPONENTES DEL COMPLEMENTO
C1-C9
Properdina
Factores B,D, I, y H
FACTORES DE COAGULACIÓN
Factores V, VII, IX, y X
Protrombina y tromboplastina
ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO
Peroxido de hidrogeno
Anión superoxido
Oxido nitrico
Oxigeno sencillo
Radicales hidroxilos
ACTIVIDAD BACTERICIDA DE LAS CÉLULAS
FAGOCÍTICAS
Como se usan los anticuerpos
in vitro?
ANTICUERPOS
MONOCLONALES
• KOHLER Y MILSTEIN 1975
• LB + CELULA MIELOMICA
• ANTICUERPOS CONTRA UN SOLO
DETERMINANTE ANTIGENICO
Las células de mieloma pierden la capacidad de sintetizar
nucleótidos
Hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa
Síntesis de novo
Hipoxantina
Guanina
Aminopterina
Análogo Ac fólico
Mieloma
pierden
HGPRT
Purinas
Nucleótidos
AMPLIFICACION DE HIBRIDOMAS
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Poblacion de anticuerpos con isotipo e idiotipo idéntico,
generados por un clon único
•Purificar moléculas
•Estudio de la estructura y diversidad de los anticuerpos
•Identificar antígenos: Definir subpoblaciones celulares
•Función celular: Detección de citocinas intracelulares
•Cuantificar: Células que expresan un antígeno o cantidad
de moléculas por célula
Este es un anticuerpo monoclonal o policlonal?
Especificidad
Capacidad de discriminar entre dos moléculas relacionadas,
el antígeno frente al cual está dirigido. ANTICUERPO
Reactividad cruzada
Capacidad de reaccionar con ligandos relacionados con el
Antígeno.ANTIGENO O ANTICUERPO
Especificidad
Reactividad cruzada
Tipo I
Tipo II
Capacidad de dos ligandos
para reaccionar con el mismo
sitio en la misma molécula de
anticuerpo (monoclonales).
Ligando de reacción cruzada
interacciona con todos o una
población heterogenea de
anticuerpos (policlonales)
Afinidad
Multiespecificidad
•Talmadge, D. (1959) Immunological specificity Science
129:1643-1648.
Repertorio limitado de anticuerpos. Cada anticuerpo puede
unir una amplia variedad de antígenos
Animal
Animal
ANTICUERPOS CATALITICOS
Algunos acps tienen la capacidad de acelerar reacciones
enzimáticas porque al unirse a una molécula puede
disminuir la E necesaria para un cambio de estado.
ACPS BIESPECIFICOS Y BIFUNCIONALES
Redireccionar la actividad de las células citolíticas.
ANTICUERPOS HUMANIZADOS
Fusión de células humanas con mielomas animales o con cells
tumorales humanas. Combinación de regiones variables de
ratón con regiones ctes de humano.
Producción de acps
monoclonales humanos en ratón transgénico.
APLICACIONES CLINICAS
• Eliminación de células T de MO antes de transplante (con C’)
• Anti-CD3 en pacientes con transplante de riñón como
tratamiento para reacciones de rechazo.
• En cancer para eliminación de células tumorales.
• Anti LPS para el tratamiento de sepsis.
• Anti IL-6 para TTo de mieloma múltiple
• Anti IgE para tto de alergia
• Anti TNFα para el to de artritis
• Anti VSR en niños
• Enti R- de IL-2 para la prevención del rechazo a los injertos.
• Anti idiotipo en linfoma B
ANTICUERPOS SE CONJUGAN CON:
FLUOROCROMOS
FLUORESCENCIA
ENZIMAS
ELISA
RADIOISOTOPOS
RIA
PARTICULAS DE ORO
MICROSCOPIA
ELECTRONICA