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Clinical Chemistry 57:4
670–674 (2011)
Estudio de Caso Clı́nico
Concentraciones Incrementadas de Ciclosporina en
ausencia de la Administración de dicho medicamento
Andreas Peter1*, Maria Shipkova2, Eberhard Wieland2, Erwin Schleicher1 and Ingo Müller3
CASO
Una niña de 9 años de edad fue admitida en nuestro
hospital con leucodistrofia matacromática juvenil (deficiencia de arilsulfatasa A). Los sı́ntomas de esta enfermedad de almacenamiento lisosomal, tales como
decremento en el desempeño escolar y habilidades
motoras comprometidas, habı́an iniciado un año antes. Se le sometió a un trasplante de medula de un
donador de médula ósea no familiar compatible
después de tener las condiciones con fludarabina, treosulfán y tiotepa, junto con timo globulina, una globulina anti mocito de globulina. El acondicionamiento
fue bien tolerado y el periodo post trasplante tuvo una
duración de una hora, con excepción de un periodo
febril. La profilaxis de injerto contra huésped (GvHD)4
consistió de 3 dosis de metotrexato en combinación
con el inicio de ciclosporı́na diariamente. Una dosis
(CsA) de 3 mg por Kg–1 por dı́a–1. Las concentraciones
de CsA canalizadas fueron monitoreadas con el inmunoensayo conjugado de anticuerpos (ACMIA) para
CsA (Dimensión; RxL; Siemens). Las concentraciones
de CsA entraron al intervalo terapéutico después de
tres dı́as, y la dosis se ajustó para alcanzar las concentraciones mı́nimas de 120 –150 ␮g/L (Fig. 1). La paciente recibió CsA por 16 semanas. Durante este periodo
la concentración de CsA se midió 31 veces, con resultados de 98 a 219 ␮g/L (media, 156 ␮g/L). Cuatro semanas después del trasplante, la paciente desarrollo
una leve GyHD de la piel, la cual desapareció inmediatamente después de iniciar un tratamiento de prednisolona. Debido a que los linfocitos B estaban ausentes o bajos poco después del trasplante, la paciente
recibió inmunoglobulinas por 5 meses (Fig. 1). La pro-
1
Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, Path
biochemistry and Clinical Chemistry, University of Tübingen, Tübingen, Germany; 2 Central Institute for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Klinikum Stuttgart, Stuttgart, Germany; 3 Department of General Paediatrics,
Haematology, Oncology, University Children’s Hospital, Tübingen, Germany.
* Dirigir correspondencia al autor a: Department of Internal Medicine, Division of
Endocrinology, Metabolism, Pathobiochemistry and Clinical Chemistry, University of Tübingen, Otfried-Müller-Str. 10, 72076 Tübingen, Germany. Fax ⫹497071-294582; e-mail andreas.peter@med.uni-tuebingen.de.
Recibido para publicación Abril 14 de 2010. Aceptado para publicación Septiembre 7 de 2010.
4
Abreviaturas no estándar: GvHD, profilaxis de injerto contra huésped; CsA,
ciclosporina A; ACMIA, inmunoensayo magnético conjugado de anticuerpos.
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PREGUNTAS A CONSIDERAR
1. ¿Fue suspendida realmente la terapia de CsA?
2. ¿Puede explicar el retraso en la eliminación de drogas
el incremento continuo de concentraciones de CsA?
3. ¿Qué pruebas pudieron haberse realizado para identificar cualquier interferencia analı́tica potencial?
ducción de inmunoglobulinas endógenas inició solamente en la última fase de reconstitución inmune. Seis
semanas después se suspendió la terapia de CsA, se detectó todavı́a una concentración de 147 ␮g/L en la sangre completa. Aunque se suponı́a que la paciente no
recibirı́a CsA y los padres habı́an negado que se le administrara CsA o cualquier otra droga no prescrita, se
obtuvieron concentraciones de CsA entre 116 y 174
␮g/L dentro de los siguientes 4 meses.
DISCUSIÓN
La introducción de CsA a la medicación en trasplante
redujo dramáticamente la incidencia de rechazo agudo
y la mejora del injerto a largo plazo ası́ como la supervivencia de la paciente (1 ). Las concentraciones de CsA
en sangre, sin embargo, debieron de ser monitoreadas
por rutina por varias razones, incluyendo un estrecho
indicador terapéutico (nefrotoxicidad), absorción altamente variable, metabolismo extensivo vı́a el citocromo P450 de la enzima CYP3A4, eliminación
metabólica (hepática), numerosas interacciones de
drogas relacionadas tanto con CYP3A4 como con la
bomba de eflujo celular P-glicoproteı́na [codificada
por el gen ABCB1, el casete de unión ATP, la subfamilia B (MDR/TAP), el miembro 1; formalmente
conocido como MDR1)], el riesgo de un pobre cumplimiento debido a la administración potencial a lo largo
de la vida y dificultades en distinguir clı́nicamente los
efectos adversos de un efecto farmacológico inadecuado (bajo inmunosupresión). Muchos de los centros
de trasplante, incluyendo el nuestro, usan la concentración mı́nima de sangre completa para ajustar la
dosificación de CsA.
Muchos laboratorios utilizan inmunoensayos
para cuantificar la concentración de CsA en sangre
Estudio de Caso Clı́nico
Figura. 1. Evolución temporal de la concentración de CsA en sangre completa medida con el ensayo de CsA de
ACMIA, la dosis diaria de CsA administrada y la cuenta de linfocitos B.
completa. Éstos son atractivos para los laboratorios debido a que pueden ser automatizados, tienen bajos costos de inicio, no requieren un equipo altamente calificado y permiten un servicio de 24 horas (2, 3 ). El
inmunoensayo, sin embargo, tiene mayores inconvenientes, incluyendo los grados de variación del metabolito de reactividad cruzada y las interferencias que
producen resultados falsamente mayores o menores
que aquellos obtenidos con procedimientos cromatográficos que resuelven los metabolitos de la droga
parental (4, 5 ). En la actualidad, están accesibles para
cuantificación de concentraciones de CsA en sangre
completa 1 RIA (DiaSorin) y seis inmunoensayos no
isotrópicos diferentes: inmunoensayo de polarización
fluorescente (TDx/FLx:Abbot), técnica de inmunoensayo de enzima multiplicada (EMIT V-Twin; Siemens), ACMIA (Dimensión RxL, Siemens), inmunoensayo de donador de enzima clonada
(Microgenetics/Roche Modular), inmunoensayo quimioluminiscente de micropartı́culas (ARCHITECT;
Abbot Laboratories) y inmunoensayo quimioluminiscente (ADVIA Centaur; Siemens). Con excepción del
ensayo ACMIA, todos los inmunoensayos requieren de
un manual de pasos pre tratamiento lo que causa una
alta imprecisión.
En nuestra paciente, las concentraciones de CsA
en sangre complete permanecieron en el intervalo terapéutico, aún meses después de suspender la terapia. El
promedio de vida de eliminación de CsA de las primeras 19 horas puede prolongarse en pacientes adultos
mayores y pacientes con disfunción hepática. Debido a
que nuestra paciente tenı́a solamente 9 años con una
función del hı́gado dispareja, sospechamos un problema analı́tico. Para probar sobre en relación a po-
sibles agentes solubles interferentes, analizamos el
plasma de la misma muestra. Debido a que la CsA se
acumula en células rojas de sangre, la concentración de
CsA pudo haber sido menor en el plasma que en la
sangre completa. En 10 de nuestros pacientes con trasplante de médula, la media (SD) en porcentaje de la
concentración de CsA en plasma fue del 16% (7%) en
relación a la de la sangre completa, un hallazgo acorde
con los resultados publicados (6 ). En la muestra de esta
paciente, sin embargo, la señal de CsA en ACMIA fue
del 40% mayor en plasma que en sangre completa, sugiriendo que una sustancia interferente presente en el
plasma era responsable de los resultados medibles
(falso-positivo) de CsA por ACMIA. De hecho, no se
detectó CsA cuando analizamos las muestras de la paciente con otro inmunoensayo (inmunoensayo de quimioluminiscencia; Siemens) o por espectrometrı́a en
tándem de masa por cromatografı́a lı́quida.
Anticuerpos humano anti animal y anticuerpos
con la menor afinidad heterofilia son la causa más
común de interferencias en ensayos inmunológicos. El
pre tratamiento de la muestra de plasma de la paciente
con un Tubo de Bloqueo heterofı́lico (Scantibodies
Laboratory), que puede remover interferencias en
pruebas producidas por estos anticuerpos, eliminó la
señal de falso positivo de CsA en plasma para el ensayo
de ACMIA. En muestras de otros pacientes con y sin
terapia de CsA, la medición de éste no fue afectada por
el tratamiento del Tubo de Bloqueo Heterofı́lico. Este
resultado demostró que los anticuerpos interferentes
causaron los altos valores de CsA en el ensayo de ACMIA. Dichas interferencias pueden causar tanto la desviación positiva como negativa de la concentración
verdadera, dependiendo de la naturaleza del anticuClinical Chemistry 57:4 (2011) 671
Estudio de Caso Clı́nico
erpo y el principio del ensayo (7 ). Posiblemente, la
timo globulina proporcionada en la fase de condicionamiento indujo los anticuerpos humano anti animal.
La timo globulina contiene un antitimocito IgG de
conejo, lo que pudo haber inducido anticuerpos que, a
pesar de la diferencia en las especies, reconoció los anticuerpos de ratón anti-CsA usados en el ensayo de ACMIA. La homologı́a de secuencia de proteı́nas de
moléculas de IgG de diferentes especies animales es
considerable y la reactividad cruzada de los anticuerpos
anti animal entre especies no ocurre (8 ). Ningún otro
anticuerpo animal terapéutico ha sido administrado a
esta paciente. El ensayo de inmunoensayo por quimioluminiscencia de ADVIA Centaur, que también utiliza
anticuerpos anti-CsA monoclonales de ratón, no fue
afectado por la interferencia. Aún cuando se usó el
mismo anticuerpo, las interferencias pueden ser
especı́ficas para la plataforma. Recientemente fue reportado un caso de interferencia en un ensayo de anticuerpos dirigido únicamente hacia el complejo de
anticuerpo-enzima. (9 ).
Dichos anticuerpos se desarrollan generalmente
alrededor de las dos semanas de tratamiento y pueden
persistir por 30 meses (8 ). La prevención de esta complicación incluye la humanización de anticuerpos terapéuticos, el uso solo de fragmentos de anticuerpos o la
PEGilación. Además, la terapia concomitante inmunosupresora por si misma disminuye el desarrollo de anticuerpos endógenos. Creemos que los anticuerpos interferentes comenzaron a surgir en nuestro caso
después de la reducción de la dosis de CsA, un incremento concomitante de la cuenta de linfocitos B (Fig.
1) y producción de anticuerpos endógenos. De hecho,
la interferencia en el ensayo no fue detectable en una
muestra de plasma tomada y congelada antes del tratamiento de CsA y la primera medición después de la
segunda dosis que reveló una baja concentración de
CsA en la sangre completa. Estos resultados demostraron que la interferencia no estaba presente en un
inicio. Debido a que la reconstitución inmune (cuenta
de linfocitos B) procedió como se esperaba y a la luz de
la GyHD inicial en la paciente con una enfermedad no
maligna, no se redujo la dosis de CsA más pronto, a
pesar de la constante en altas concentraciones. El desarrollo de la GyHD, sin embargo, sugiere que las concentraciones de CsA pudieron haber sido sobreestimadas, al menos por algún tiempo durante el tratamiento.
Hasta el momento, solo existe un caso de medición
falso-positiva de CsA con el ensayo inmunológico de
ACMIA descrito en la literatura (10 ). En ese caso el
HPLC detectó un pico interferente con un tiempo de
retención cercano al de CsA, pero el pico no fue identificado. Nuestro caso demuestra la importancia tanto
de una evaluación cuidados y el conocimiento del método. Una distribución inusual de concentraciones de
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PUNTOS PARA RECORDAR
• Continuamente las altas concentraciones de CsA
después de suspender la droga pueden ser causadas por
un anticuerpo interferente, tal como un anticuerpo humano anti animal inducido por aplicación terapéutica
de IgG de conejo.
• Los anticuerpos interferentes pueden causar resultados
falso-positivo o falso-negativo en los inmunoensayos.
• Para investigar un problema analı́tico potencial, uno
puede hacer lo siguiente: estudios de linealidad en la
dilución, tratamiento de la muestra con un reactivo
bloqueante, precipitación de proteı́nas, ultra fijación,
purificación cromatográfica por inmunoglobulinas,
análisis con un método no afectado (preferiblemente el
método de referencia), un examen cuidadoso de la
historia de la paciente (exposición a productos inmunogenéticos, historia de hiperactividad en el sistema inmunológico y otros). En este caso, la concentración de
CsA en plasma fue medida para detectar interferencias
en el análisis,
• La comunicación entre el laboratorio y el médico es
esencial para resolver esta clase de problemas.
CsA en plasma y sangre completa que no cumple con
las caracterı́sticas farmacoquinéticas o resultados inesperados en una estrategia de muestreo múltiple puede
sugerir interferencia en el ensayo. Si el resultado de una
prueba es inesperado y se sospecha interferencia por
anticuerpos endógenos, se pueden utilizar varias estrategias para detectar una remoción eventual de la interferencia: (a) métodos para detectar o remover interferentes de proteı́na (estudio de dilución de linealidad,
muestreo pre tratamiento con reactivo bloqueante,
precipitación de proteı́nas, ultrafiltración, purificación
cromatográfica de inmunoglobulinas); (b) análisis con
un método no afectado (óptimamente el método de
referencia); y (c) examen cuidadoso de la historia de la
paciente (exposición a productos inmunogenéticos,
historia de hiperactividad en el sistema inmunológico).
Nuestro caso demuestra que dicha interferencia en el
monitoreo de drogas terapéuticas ocurre y puede ser
muy difı́cil de detectar si los resultados son cercanos al
intervalo terapéutico y se correlacionan con la dosis
administrada.
Contribuciones de autor: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con
los siguientes tres requerimientos. (a) contribuciones significativas para
la concepción y diseño, adquisición de datos o análisis e interpretación
de éstos; (b) redacción o revisión del artı́culo en cuanto a su contenido.
Estudio de Caso Clı́nico
Deslinde de los autores de posibles conflictos de interés: Ningún
autor declaró algún conflicto de interés potencial.
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, elección de pacientes
reclutados, revisión e interpretación de datos o preparación o aprobación del manuscrito.
Referencias
1. Ponticelli C. Cyclosporine: from renal transplantation to autoimmune diseases (Ciclosporina: del trasplante renal a la enfermedad autoimmune). Ann
N Y Acad Sci 2005; 1051:551– 8.
2. Johnston A, Holt D. Cyclosporine. In: ME Burton, LM Shaw, JJ Schentag, WE
Evans eds. Applied pharmacokinetics and pharmacodynamics: principles of
therapeutic drug monitoring (Farmacoquinesis aplicada y farmacodinámica:
principios de monitoreo de drogas terapéuticas). 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006. p 512–29.
3. Morris RG, Holt DW, Armstrong VW, Griesmacher A, Napoli KL, Shaw LM. Analytic
aspects of cyclosporine monitoring, on behalf of the IFCC/IATDMCT Joint Working
Group (Aspectos analı́ticos de monitoreo de ciclosporina, En nombre del trabajo
conjunto entre IFCC/IATDMCT. Ther Drug Monit 2004;26:227–30.
4. Morris RG. Immunosuppressant drug monitoring: Is the laboratory meeting clinical
expectations? (Monitoreo de drogas imunosupresoras: ¿El laboratorio está cumpliendo con las expectativas clı́nicas?) Ann Pharmacother 2005;39:119–27.
5. Butch AW. Immunosuppressive drugs: pharmacokinetics, preanalytic variables and analytical considerations. In: A Dasgupta ed. Handbook of drug
6.
7.
8.
9.
10.
monitoring methods: therapeutics and drugs of abuse (Drogas
inmunosupresoras: farmacoquinéticas, condiciones de variables preanalı́ticas
y analı́ticas). 1st ed. Totora (NJ): Humana Press; 2008. p 165–201.
Lepage JM, Lelong-Boulouard V, Lecouf A, Debruyne D, Hurault DL, Coquerel
A. Cyclosporine monitoring in peripheral blood mononuclear cells: feasibility
and interest. A prospective study on 20 renal transplant recipients (Monitoreo de la ciclosporina en células mono nucleares de sangre periférica:
viabilidad e interés. Un estudio prospectivo en 20 receptores de trasplante
renal). Transplant Proco 2007; 39:3109 –10.
Data P. Interferentes of heterophilic and other antibodies in measuring of
therapeutic drugs by immunoassays. In: A Dasgupta ed. Handbook of drug
monitoring methods: therapeutics and drugs of abuse Interferencia de
anticuerpos heterofı́licos y otros en la medición de drogas terapéuticas por
inmunoensayo. En: Un Manual de edición dasgupta de métodos de monitoreo de drogas) 1st ed. Totowa (NJ): Humana Press; 2008. p 225–35.
Kricka LJ. Human anti-animal antibody interferences in immunological assays
(Interferencias de anticuerpos humanos anti-animal e ensayos inmunológicos) . Clin Chem 1999; 45:942–56.
Parikh BA, Siedlecki AM, Scott MG. Specificity of a circulating antibody that
interferes with a widely used tacrolimus immunoassay (Especifidad de un
anticuerpo circulante que interfiere cuando se ha usado ampliamente tacrolimus en inmunoensayos). Ther Drug Monit 2010;32:228 –31.
Cattaneo D, Zenoni S, Murgia S, Merlini S, Baldelli S, Perico N, et al.
Comparison of different cyclosporine immunoassays to monitor C0 and C2
blood levels from kidney transplant recipients: not simply overestimation
(Comparación de diferentes ensayos de ciclosporinas para monitorear los
niveles de CO y C2 en sangre de receptors de trasplante: no simplemente
sobreestimación). Clin Chim Acta 2005;355:153– 64.
Comentario
Anthony W. Butch*
La interferencia en inmunoensayo por anticuerpos anti
animal está bien documentada y continúa afectando
los actuales ensayos inmunométricos. La interferencia
de anticuerpos no se limita a 2 clases de inmunoensayos no competitivos; también puede ocurrir en
inmunoensayos competitivos . Los anticuerpos interferentes pueden producir resultados altos y bajos,
dependiendo del formato del ensayo, las especies y/o
especificidad del anticuerpo o los anticuerpos usados. La incidencia de anticuerpos animales varı́a ampliamente a través de estudios y rangos de 0.3 a 4% en
una población no seleccionada. La incidencia en pacientes que reciben inmunoglobulinas animales para
propósitos médicos está en el rango entre 41 y 80%.
El término “anticuerpos anti animal” se usa cuando existe una historia de tratamiento con inmunoglobulinas animales y tienden a ser anticuerpos con alta
afinidad no especı́ficos. En contraste, los anticuerpos
Department of Pathology and Laboratory Medicine, Geffen School of Medicine at
UCLA, Los Angeles, CA.
* Dirigir correspondencia al autor a: Department of Pathology and Laboratory
Medicine, Geffen School of Medicine at UCLA, 10833 Le Conte Ave.,
Mailcode 173216, Los Angeles, CA 90095-1732. Fax 310-206-9077; e-mail
abutch@mednet.ucla.edu.
Recibido para publicación Diciembre 7 de 2010. Aceptado para publicación
Diciembre 14 de 2010.
halterófilos están asociados con una exposición
desconocida de inmunoglobulinas animales y comúnmente desarrollan leve reactividad hacia múltiples
proteı́nas animales. Por lo tanto, la incidencia de anticuerpos anti animal y halterófilos en muestras clı́nicas
excede el 40%, la mayorı́a son anticuerpos con baja
afinidad que no interfieren en el inmunoensayo. Los
fabricantes también agregan agentes bloqueadores en
sus inmunoensayos para ayudar a prevenir interferencia de anticuerpos.
Una vez que se sospecha que un resultado de inmunoensayo puede ser discordante, se revisa apropiadamente la historia clı́nica y debe realizarse una discusión con el médico del paciente como parte de la
investigación. Una respuesta no lineal después de la
dilución de la muestra puede ser usada para demostrar
interferencia de anticuerpos: sin embargo, algunos anticuerpos interferentes son lineales sobre la dilución,
por lo que esta prueba no siempre se rige por interferencia de anticuerpos. Como se ilustra en este caso
clı́nico, los tubos bloqueadores de anticuerpos heterófilos se pueden usar para eliminar la interferencia,
aunque esta propuesta no siempre elimina la interferencia. Para casos documentados de exposición a inmunoglobulinas animales, podrı́a producir resultados más
confiables un método de ensayo diferente o un inmuClinical Chemistry 57:4 (2011) 673
Estudio de Caso Clı́nico
noensayo que usa diferentes anticuerpos animales. Es
esencial para los laboratoristas entender las limitaciones del inmunoensayo y trabajar de manera cercana
con el médico cuando los resultados no están de acuerdo con los hallazgos clı́nicos.
Contribuciones de autor: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los
siguientes tres requerimientos. (a) contribuciones significativas para la concepción y diseño, adquisición de datos o análisis e interpretación de éstos; (b)
redacción o revisión del artı́culo en cuanto a su contenido
Deslinde de los autores de posibles conflictos de interés: Ningún
autor declaró algún conflicto de interés potencial.
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, elección de pacientes
reclutados, revisión e interpretación de datos o preparación o aprobación del manuscrito.
Comentario
Michael C. Milone*
La medición de concentraciones de ciclosporina a
(CsA) ha sido desde hace tiempo un reto, debido a
factores como un gran número de metabolitos. Aún la
espectrometrı́a de tándem en masa de cromatografı́a
lı́quida altamente especı́fica puede tener problemas
analı́ticos. El caso reportado por Peter et al. De anticuerpo humano anti ratón (HAMA) que causa interferencia relativa al inmunoensayo de CsA ilustra la naturaleza insidiosa de este tipo interferencia. No fue sino
hasta seis semanas después de suspender la terapia de
CsA que la concentración mayor de lo esperado fue
detectada en esta paciente. Se desconoce cuánta interferencia de eta HAMA contribuyó a la medición de la
concentración en esta paciente mientras estaba recibiendo aún la droga; sin embargo, esto es perfectamente
concebible. El planteamiento para evaluar esta interferencia también demuestra el esfuerzo que en ocasiones
se realiza para confirmar la presencia e identidad de
una sustancia interferente. No veo este esfuerzo como
solo un ejercicio académico. La confirmación de
HAMA tiene implicaciones importantes para otras
pruebas para esta paciente y talvez para otros. Los autores fueron desafortunados para poder confirmar la
presencia de un HAMA bloqueando anticuerpos
heterófilos. Este tratamiento no siempre es exitoso, a
pesar de la presencia de HAMA. El uso generalizado de
inmunoensayos y el incremento de terapéuticas basadas en anticuerpos podrı́a llevar a más problemas de
HAMA, no menos, aún con el esfuerzo de humanizar
los anticuerpos terapéuticos. Desafortunadamente la
mayorı́a de las interferencias de HAMA son probablemente perdidas durante la práctica de rutina de la medicina. Los laboratoristas por tanto deberı́an mantener
vigilancia sobre este importante y potencialmente
problema de tratamiento de por vida. La comunicación
efectiva con los clientes de laboratorio también es
crı́tica, debido a que los proveedores de cuidado de la
salud que directamente se encargan de la salud de los
pacientes parecen ser los primeros en notar el problema cuando el resultado no cabe con su impresión
clı́nica.
Toxicology and TDM Laboratory, Hospital of the University of Pennsylvania,
Philadelphia, PA.
* Dirigir correspondencia al autor a: Toxicology and TDM Laboratory, Hospital of
the University of Pennsylvania, 3400 Spruce St., Philadelphia, PA 19104. E-mail
milone@mail.med.upenn.edu.
Recibido para publicación Enero 12 de 2011. Aceptado para publicación Enero 17
de 2011.
Deslinde de los autores de posibles conflictos de interés: Ningún
autor declaró algún conflicto de interés potencial.
674 Clinical Chemistry 57:4 (2011)
Contribuciones de autor: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con
los siguientes tres requerimientos. (a) contribuciones significativas para
la concepción y diseño, adquisición de datos o análisis e interpretación
de éstos; (b) redacción o revisión del artı́culo en cuanto a su contenido
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, elección de pacientes
reclutados, revisión e interpretación de datos o preparación o aprobación del manuscrito.