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TRABAJO PRÁCTICO N°1
Introducción al diagnóstico virológico Parte 1: Toma de muestra. Utilidad de los
animales de experimentación. Consideraciones éticas en el uso de animales de
experimentación.
OBJETIVOS:
1-Conocer y comprender las normativas para una correcta toma de muestra, su
acondicionamiento y envío al laboratorio.
2-Conocer las distintas vías de inoculación en un animal de experimentación.
3-Comprender la importancia del uso de animales de laboratorio en el campo de la
ciencia así como reconocer las posibles alternativas metodológicas desarrolladas
recientemente.
4-Discutir la importancia de aplicar normas bioéticas en el uso de animales de
experimentación. Comprender la importancia del concepto de bienestar animal.
TEORÍA
1- CONSIDERACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA, ACONDICIONAMIENTO Y
TRANSPORTE DE MUESTRAS DESTINADAS A ANÁLISIS VIROLÓGICO.
"La correcta toma de muestras, una buena conservación y un correcto transporte son factores
importantes en la futura investigación y análisis de las muestras destinadas a estudios
virológicos."
LA TOMA DE MUESTRA
En caso de sospechar de un virus, cómo agente etiológico del caso que se nos
presente, para realizar el diagnóstico correcto, debemos tomar muestras clínicas del
animal afectado. El diagnostico presuntivo y el conocimiento de la patogenia de la
enfermedad, así como el de sus repercusiones orgánicas, nos indicarán que tipo de
muestras debemos extraer y cuando.
La definición del momento y forma de recolección, transporte y conservación de
la muestra son esenciales para el resultado del estudio. La recolección de la muestra
debe considerar inicialmente dos factores: el sitio u órgano lesionado y el virus
presuntamente responsable. Para aislamiento viral se precisa mantener la partícula viral
viable, por lo que la forma de obtención y manejo de la muestra es fundamental;
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frecuentemente se utilizan medios de transporte especiales y su traslado al laboratorio
debe hacerse en frío, utilizando un sistema de refrigeración adecuado que asegure el
transporte a bajas temperaturas, a fin de minimizar las pérdidas de "viabilidad" de las
partículas virales. Las muestras más comúnmente utilizadas son: trozos de órganos,
hisopados oculares, nasales y vaginales, raspado faríngeo, contenido intestinal, líquido
cefalorraquídeo (LCR), líquido de vesículas, orina, materia fecal, lavaje uterino, lavaje
prepucial, sangre (anticoagulada con heparina como anticoagulante de elección)
dependiendo, como se mencionó anteriormente, de la sospecha clínica. Otra
consideración importante a tener en cuenta si se busca aislar el agente viral a partir de
sangre anticoagulada es que la viremia (presencia de virus en el torrente sanguíneo) es
un evento fugaz, y normalmente el pico se coincide con la aparición de pirexia (fiebre)
en el animal, por ello, el momento para realizar la toma de muestra en este caso, será
al principio de la infección, en lo posible en los picos de fiebre.
Otras técnicas de diagnóstico viral no necesitan el virus viable pues se basan en
la detección del virión o de sus componentes estructurales, cuya mayor estabilidad
facilita la realización del estudio. En este caso, también se suelen utilizar las mismas
muestras que para aislamiento viral (dependiendo siempre del cuadro clínico y del
presunto diagnóstico).
Por otro lado, cuando se desean tomar muestras para determinar anticuerpos, es
decir muestras para serología, entonces son necesarias dos muestras de suero del
mismo animal, una extraída al comienzo de la sintomatología y otra entre dos y tres
semanas después, cuidando de individualizar los animales muestreados, a fin de
determinar y comparar el nivel de aumento de anticuerpos (Figura 1) por técnicas como
inhibición de la hemaglutinación, ELISA, etc., que desarrollaremos en el próximo trabajo
práctico.
Figura 1: Evolución de la viremia y respuesta inmune durante una infección viral
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CONSIDERACIONES GENERALES QUE DEBES RECORDAR
a) La posibilidad de aislar el virus es mayor durante el período inicial de la enfermedad,
cuando el título del virus es más alto.
b) La mejor muestra es la que proviene de un animal vivo o de uno sacrificado
recientemente.
c) Los virus dependen para su replicación de células vivas por lo tanto no deben
extraerse muestras de zonas necróticas, con exudado purulento, o fuerte olor porque
ello es debido a la infección bacteriana.
d) Las muestras deben conservarse a 4°C o por debajo de – 40°C (hielo seco o
nitrógeno líquido).
e) De ser posible las muestras deben remitirse en un medio de transporte adecuado
para el diagnóstico virológico. Los medios para bacteriología no sirven y los hisopos de
madera resultan tóxicos.
f) El uso de envases apropiados para recoger y remitir muestras garantiza la
bioseguridad del proceso.
g) Para el diagnóstico serológico la primera extracción se hará al observar los primeros
síntomas de la enfermedad y la segunda extracción 20- 30 días después.
"Cuando la situación lo permita, lo ideal es extraer muestras para aislamiento
viral, al mismo tiempo que se extraen muestras destinadas a la evaluación de la
respuesta inmune (muestras destinadas a serología) ya que de este modo
obtenemos una información más completa en relación al proceso patológico y a
la respuesta del animal a la infección viral."
En la tabla que verás a continuación, se presentan diversos ejemplos de tomas
de muestra relacionadas a diferentes virus.
Tipo de muestra
Toma de
muestra
Ejemplos
Hisopados oculares
Hisopados nasales
In vivo
In vivo
rinotraqueitis Infecciosa Bovina
parainfluenza e influenza en diferentes especies
Contenido de vesícula
Lavaje esofágico
Lavaje traqueo-bronquial
Secreciones genitales
Contenido intestinal
In vivo
In vivo
In vivo
In vivo
In vivo
Biopsias de piel,
In vivo
fiebre aftosa, estomatitis vesicular
Fiebre aftosa
Virus Sincicial Respiratorio Bovino( BRSV)
Virus de la Leucemia Bovina
Diarreas neonatales en diferentes especies (Rotavirus,
Coronavirus)
fiebre aftosa, papilomatosis bovina, Viruela aviar
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colgajos, costras,
papilomas, etc.
Muestras de Sangre
entera anticoagulada
Muestras de sangre sin
anticoagulante
Trozos de órganos:
pulmón
Trozos de órganos:
intestino
Trozos de órganos:
sistema nervioso central
In vivo
virus de la leucemia bovina
In vivo
estudios serológicos de virus
En necropsia
parainfluenza bovina, influenza en distintas especies, virus
sincicial respiratorio, diarrea vírica bovina, rinoneumonitis
equina, laringotraqueítis infecciosa aviar, etc.
En necropsia
diarrea vírica bovina, peste porcina clásica, etc.
En necropsia
rabia, encefalitis vírica bovina, encefalitis equina
TRANSPORTE DE MUESTRAS POTENCIALMENTE INFECCIOSAS
Una vez que hayamos elegido la muestra adecuada para nuestro caso, debemos
considerar que es de suma importancia respetar los protocolos de bioseguridad para el
transporte de muestras biológicas infecciosas utilizando el sistema de embalaje triple. El
embalaje triple consiste en cubrir la muestra con envases sucesivos, el primario debe
ser impermeable a líquidos, luego el segundo envase debe tener aislación térmica y el
tercer envase debe de ser lo suficientemente rígido para sostener a los demás (Figura
2). La identificación correcta comprende la rotulación en la base del recipiente que
contenga el material a analizar, es decir que, en el caso de ser un tubo, no debe
colocarse en la tapa sino en el tubo propiamente dicho, rotulando luego los sucesivos
envases, de la misma forma que rotulamos el envase primario. En la medida de lo
posible, la muestra debe ser remitida cuanto antes al laboratorio.
Figura 2: Esquema de un sistema de embalaje triple
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2- UTILIDAD DE LOS ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO
VIROLÓGICO.
El uso de animales de laboratorio fue durante muchos años el único método de
cultivo y aislamiento viral. Se inoculaban animales potencialmente sensibles a
determinado virus, con dosis y vías de inoculación adecuadas. Entre los animales de
experimentación utilizados podemos mencionar: primates, hamsters, ratones, ratas,
conejos, hurones, pollos, coballos, etc. Actualmente el uso de animales juega, en la
mayoría de las veces, un papel menor en el diagnóstico virológico, pues esta técnica se
ha reemplazado por otras metodologías menos cuestionadas a nivel ético, como los
cultivos celulares y cultivos en huevos embrionados (temas que desarrollaremos en los
prácticos siguientes). Sin embargo, en la actualidad algunos laboratorios siguen
utilizando ratones lactantes para el aislamiento de algunos virus como; virus de la rabia,
togavirus y flavivirus, en cuyo caso el uso de animales supone una necesidad para
estos casos en concreto. Además el uso de los animales aún está muy difundido en el
área de la investigación, sobre todo en el estudio de los mecanismos de patogenicidad
y respuesta inmune, así como en la producción de anticuerpos policlonales en grandes
cantidades.
Las vías de inoculación en animales de laboratorio son variadas y dependerán
del agente que se quiera aislar. A continuación, en la Figura 3, se presentan algunas
de las más utilizadas:
VÍA DE INOCULACIÓN
VÍA SUBCUTÁNEA
VÍA INTRAPERITONEAL
VÍA INTRADÉRMICA
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IMAGEN REPRESENTATIVA
VÍA INTRAVENOSA
VÍA ORAL
VÍA INTRAMUSCULAR
VÍA INTRACEREBRAL
VÍA INTRANASAL
Figura 3: Vías de inoculación en animales de experimentación
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3- CONCIDERACIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN CON ANIMALES.
NOTA: El siguiente texto no pretende imponerte ni inducirte a que pienses de tal o cual
forma, sino por el contrario, abrir la puerta al debate sobre la bioética en el campo de la
vida animal.
¿CÓMO DEFINIMOS A LA BIOÉTICA?
Existen múltiples definiciones para esta palabra, cada una fundada en una
ideología particular. A continuación desarrollaremos algunas de ellas:
 Real Academia de la Lengua Española. Bioética: aplicación de la ética a las
ciencias de la vida.
 Enciclopedia de Bioética. Bioética: estudio sistemático de la conducta humana en
el ámbito de las ciencias de la vida y del cuidado de la salud, examinada a
la luz de los valores y de los principios morales.
 Eduardo Freire. Bioética: campo de reflexión filosófica, investigación científica
multidisciplinar y debate académico público cuyo objeto fundamental es el
comportamiento moral de los seres humanos respecto a los problemas tanto
globales como locales de salud, alimentación, superpoblación , degradación
ambiental, a la supervivencia y el mejoramiento del bienestar y la calidad de vida
humana y no humana , así como los actos deliberados de intervención directa e
indirecta en los procesos biológicos.
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 Miguel H. Kottow. Bioética: Conjunto de conceptos, argumentos y normas que
valoran y legitiman éticamente los actos humanos que eventualmente tendrán
efectos irreversibles sobre fenómenos vitales. La bioética es más vasta que la
ética médica, porque también se refiere a situaciones, actos y consecuencias
que ocurren fuera del que hacer medico.
 O. E. Chaves C. Bioética: Respeto y protección a la vida, a los valores, dignidad
y autonomía de los seres humanos, a la naturaleza, a su biodiversidad y al
equilibrio ecológico, a la equidad y solidaridad en la atención a la salud del
individuo y la comunidad, a la calidad de vida y la moral en la práctica médica e
investigación médico-biológica, a la cultura y la sociedad.
BIOÉTICA Y ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Si bien la investigación con seres humanos posee un marco referencial bioético
bastante amplio, los aspectos bioéticos involucrados en la utilización de animales de
experimentación en la investigación científica son más recientes y más circunscritos.
Estos aspectos bioéticos cobran inusual connotación pública por parte de distintos
movimientos sociales, entre los que destacan las agrupaciones ecologistas. Ellas
sostienen la prohibición absoluta de usar animales de experimentación, lo que ha traído
serios conflictos con la investigación biomédica que requiere de la realización previa
de ensayos experimentales en animales, antes de ser realizados en seres humanos. En
los últimos tiempos la experimentación animal se acompaña de una muy completa
legislación, en especial en los países con amplio desarrollo en esta esfera, esta
incluye leyes, reglamentos, políticas, lineamientos, comités de ética y códigos
deontológicos, entre otros. Actualmente, la preocupación de las comunidades de
investigadores es encontrar las formas de minimizar el sufrimiento y el sacrificio de los
animales en aras de la ciencia, sin escatimar consideraciones ni costos, para con
aquellos animales que inevitablemente deben ser utilizados en la experimentación, en
especial si se trata de animales con un alto grado de sensibilidad. Para que una
experimentación con animales sea considerada legal y éticamente admisible su
propósito debe estar vinculado a la obtención de un bien mayor, como es la salud
humana o animal. En caso de que los experimentos no estén relacionados con la salud,
sólo se justifican si contribuyen en forma considerable al avance científico en relación a
la constitución y fisiología de los seres vivos, y sería admisible únicamente en caso de
que no existan vías alternativas.
Para el caso de los experimentos que requieren de técnicas invasivas o
intervenciones quirúrgicas, el animal debe ser mantenido inconsciente durante toda su
duración y debe de proveerse de cuidados de asepsia y prevención de infecciones
cuando no se requiera del sacrificio del animal. Si no es necesaria o factible la
supervivencia del animal, deberá dársele muerte por procedimientos que aseguren el
mínimo sufrimiento y un efecto inmediato (eutanasia). Si la naturaleza del experimento
requiere que el animal sobreviva, hay que controlar su estado y evolución posterior, el
cuidado post operatorio debe dirigirse a la reducción al máximo de las molestias y
sufrimiento del animal. En todos los casos, los experimentos deben ser realizados o
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supervisados
por
personas
que
tengan
la
experiencia
el entrenamiento para realizar procedimientos en animales vivos.
apropiada
y
CONCLUSIONES
La pregunta más frecuente en relación a la utilización de animales de
experimentación es ¿Realmente es necesaria?. Resulta innegable que en muchos
casos no puede sustituirse al animal, pero también existen muchísimos otros casos en
los que el sufrimiento y la muerte del animal son totalmente innecesarios, y se les utiliza
porque están al alcance del investigador, es más barato o por falta de creatividad.
La bioética es un asunto estrictamente humano, pero su dominio no excluye a los
animales, que no disponen del sentido de la justicia. Nuestro comportamiento con ellos
no es por tanto moralmente irrelevante en la medida en que se vean afectados por
nuestras acciones.
PRÁCTICA
1- Observaremos con atención el Video Mostrativo gentileza de la Bióloga Florencia
Cassasa, sobre inoculación en ratón y comentaremos posteriormente en grupo las
consideraciones para manipular correctamente un animal.
Procedimiento correcto para manipular un animal:
2- Resolveremos dudas relacionadas con el material teórico del presente TP N°1.
3- Formaremos una mesa de discusión sobre el uso de animales de experimentación:
(20 minutos). Posteriormente formularemos conclusiones al respecto según los puntos
de vista que surjan del análisis
CONCLUSIÓN COMÚN:
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4- Actividad en el Aula Virtual:
Deberás responder el cuestionario correspondiente al TP 1, el cual se subirá a la
plataforma virtual del módulo de virología Año 2015. TODOS deberán responder el
cuestionario. El tiempo del cual disponen para poder completar el cuestionario es
de 6 días (contando desde el Viernes que realizaron el práctico, hasta el miércoles
de la semana siguiente inclusive). Aquel alumno que no haya entregado el
cuestionario en la fecha pactada, no podrá rendir el examen post-práctico
correspondiente al práctico siguiente, y por tanto se tomará a este práctico como
desaprobado.
BIBLIOGRAFÍA
Capítulos de libro. Artículos científicos
- CAAN Y COL. (2005). Principles of molecular virology. 4th edition. El Sevier.
-DE LA TORRE RODRÍGUEZ ALINA, FIGUEROA MEDINA, JUAN M. Y MARTÍNEZ
MUÑOZ, LÁZARA (2001): El código de ética en la experimentación animal no puede ser
letra muerta. Anuario toxicología; Vol(1)
-BEAUCHAMP TL. & JF CHILDRESS (2001): Principles of Biomedical Ethics. 5th Ed.
New York, Oxford University Press.
Páginas web
http://www.facmed.unam.mx/ci/pdfs/etica_consideraciones.pdf
http://anatobioterio.blogspot.com.ar/2011/03/tecnicas-de-inoculacion.html
https://cv2.sim.ucm.es/moodle/file.php/21298/Clases_de_teoria/Tema_6_Virolog_a_gen
eral
http://proteus.dna.uba.ar/ibyme/siles.doc
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203016/contLinea/leccin_11_virus_de_la_rabia.
html.
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