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Universidad de Puerto Rico – Aguadilla
Departamento de Ciencias Naturales
Biol. 3030 – Laboratorio Biología del Desarrollo
Desarrollo de Aves
Introducción
El embrión del pollo (Gallus gallus) es un
modelo
excelente
para
estudiar
embriogénesis y organogénesis de
vertebrados. (Figura 1). El embrión esta
encapsulado en un cascarón solido que
provee una incubadora o un plato de
cultivo natural. El embrión puede ser
visualizado mediante un hueco en el
cascaron
y
manipularse
con
herramientas, drogas o constructos de
genes y continuar el desarrollo in ovo
para determinar los efectos de las
manipulaciones.
Experimentos de cut and paste han sido
realizados y han sido usados exitosamente Figura 1 - Pollo (Gallus, sp) luego de desarrollo
para determinar que tejido induce a quien completo (21 dias).
al controlar el desarrollo de órganos o para
determinar el efecto de una molecula determinada sobre el desarrollo. Se pueden hacer
experimentos de ganar o perder funciones, electroporacion, granulos impregnados en proteínas
o inhibidores o con células secretando algún factor.
Recursos genómicos para el pollo están aumentando rápidamente, Su genoma ya fue
secuenciado. Hay recursos para microarrays y catalogos de genes que se expresan en el
embrión. El genoma es 1/3 el tamaño de humano y raton (1x10^9 nucleotidos). Es mas
compacto porque faltan intrones y las regiones reguladoras son mas pequeñas. Sus
interacciones para gastrulación y organogénesis son altamente conservadas con mamíferos.
Huevos fecundados son bastante fáciles de
conseguir
y con una incubadora
humidificada (39oC) sin CO2, microscopio
de disección, herramientas de diseccion y
pipetas . Los huevos se pueden almacenar
entre 4-16C hasta una semana antes de
usarse. Una vez comenzada la incubación,
el desarrollo se puede hacer mas lento
para conseguir la etapa deseada en un
momento deseado. El huevo se puede
tapar luego de manipularlo y seguir
incubándolo.
Aves están dentro del grupo de los
vertebrados amnióticos (reptiles, aves y Figura2 - Huevo de aves, note la membrana amniótica.
1
mamíferos). Estos tienen un embrión que tiene un amnios o saco de agua. El huevo amniótico
se caracteriza por un grupo de
membranas
que
juntas
capacitan al embrión para
sobrevivir en tierra seca.
(Figura 2). Anfibios y peces no
necesitan esto porque su
desarrollo temprano ocurre en
agua. El amnios (de donde
obtiene el nombre) se forma
temprano en el desarrollo
embrionario y le permite al
embrión flotar en un ambiente
fluido
evitando
su
deshidratación. El saco vitelino
que es una segunda membrana, Figura 3 – Ruta del ovulo durante fecundaciǿn.
provee nutrientes y para el
desarrollo de un sistema circulatorio. El alantoide se desarrolla en la parte posterior para
almacenar desechos. EL corión contiene vasos sanguíneos que intercambiaran gases con el
exterior. En la mayoría de reptiles y aves el embrión y sus membranas están contenidas en un
cascaron duro donde el embrión se desarrolla fuera del cuerpo de la madre.
Desarrollo temprano en aves
La fecundación del huevo de gallina es interna, ocurre en el oviducto antes de que la capa de
albumina y el cascarón sean secretados para cubrirlo (figura 3). El huevo es telolecitico (como
en peces) con una pequeño disco citoplasmico (el blastodisco) flotando sobre una gran
cantidad de vitelo.
La segmentación, es meroblastica discoidal, como en la mayoría de los peces. Esta ocurre
solamente en el blastodisco, que es de un tamaño de 2-3 mm de diámetro y esta localizado en
el polo animal del huevo. El primer surco divisional aparece centralizado en el blastodisco,
divisiones posteriores forman una blastodermo de una sola capa de células. Siendo
segmentación meroblástica, los
surcos no llegan hasta el vitelo,
por lo que las células están
contiguas una con la otra y con el
vitelo subyacente (Figura 4). La
división continua hasta formar un
tejido blastodermal de 5-6 capas
de células de grosor. Las células
están unidas por uniones tight.
Entre el blastodermo y el vitelo
se
encuentra
la
cavidad
subgerminal, que se crea
cuando el blastodermo absorbe
agua de la albumina y secreta un
fluido para separarse del vitelo.
En este punto las células Figure 4 - Segmentacion meroblastica discoidal
profundas
del
centro
del
2
blastodermo están sueltas y muertas. La zona superficial forma un área pelucida del grosor de
una célula.
La zona periferal del blastodermo donde siguen unidas las células forma el área opaca. Entre
la área opaca y la pelucida hay una capa de células conocida como la zona marginal. Células
de esta zona son importantes en determinación del destino final en el desarrollo.
Gastrulación
Al momento de salir el huevo, el blastodermo ya esta compuesto por unas 50000 células. La
mayoría de la zona pelucida esta superficial forman una capa superior conocida como
epiblasto. Luego de salir el huevo, una parte del epiblasto engrosa formando la hoz de Koller
posterior al área pelucida. Entre esta y el área opaca se encuentra la zona marginal posterior
(PMZ), un grupo de células que sale de la hoz y migran anterior. Tambien células anteriores el
epiblasto se delaminan pero siguen unidas al epiblasto para formar las islas del hipoblasto
(grupos de 15-20 celulas) que luego darán lugar al hipoblasto primario. Celulas que crecen
anterior a la hoz se combinan con el hipoblasto primario y forman el hipoblasto secundario o
el endoblasto. El blastodermo ahora tiene dos capas (epiblasto e hipoblasto) y un espacio
entre estas que es el blastocele. Todo el embrión se derivara del epiblasto. Parte de las
membranas accesorias extraembrionicas (saco vitelino) se derivan del hipoblasto. Este
también produce señales químicas que especifican migración del células del epiblasto. Las
tres capas germinales y el amnios, corion y alantoides salen del epiblasto.
La gastrulación en aves (reptiles y mamíferos) ocurre en la línea primitiva, el equivalente al
blastoporo en anfibios. Esta línea surge de la hoz de Keller y del epiblasto sobre este. Las
células
según
convergen en la línea
se
forma
una
depresión o el surco
primitivo, que sirve
de entrada para la
células que migran
hacia
las
capas
internas del embrión.
Asi el surco primitivo
es
homologo
al
blastoporo y la línea
primitiva lo es al labio
dorsal. En la parte
anterior de la línea
se forma una zona
mas ancha y gruesa,
el nudo de Hensen, o Figure 5 - Gastrulación - note la linea primitiva, el nudo de Hansen y la TEM
nudo
primitivo.
(Figura 5). En este se
encuentra una depresión tipo embudo que permite la migración hacia el interior de las células
que formaran el notocordio y el plato precordal. El nudo de Hensen es equivalente
funcionalmente hablando al labio dorsal (anfibios) y al disco embriónico (peces); en otras
palabras el organizador.
3
La línea primitiva establece la mayoría de los ejes corporales del embrión en aves. Se extiende
posterior a anterior, las células migran entrando por el lado dorsal y se mueven al ventral, y ella
separa lados izquierdo y derecho. El corte de la línea es dorso/ventral, la parte anterior
(Hansen) da lugar a notocordio, mesodermo precordal y las somitas mediales. Células que
migran por la parte medial del surco dan lugar la parte lateral de las somitas, corazón y riñones.
Células que migran por la parte posterior de la línea darán lugar a mesodermo. Células q
migran luego del mesodermo, permanecen fuera pero cerca de la línea formaran placa neural y
las mas distantes formaran epidermis.
Según las células entran por la línea primitiva sufren la transformación epitelio-mesenquimal.
La lamina basal se rompe, la linea se alarga hacia la región de la futura cabeza. Por extensión
convergente la línea se sigue alargando, mientras se alrga, se reduce su ancho, división celular
aporta mas células. El hipoblasto secundario migra anterior desde la zona marginal.
Por lo general las identidad de las tres capas germinales es establecida antes de gastrular,
pero aquí su especificación depende de influencias inductivas durante y después de la
migración por la línea primitiva. Células que migran por la parte anterior de la línea primitiva
llegan al blastocele y migran anterior para formar endodermo (creciente germinal), mesodermo
cefálico y notocordio. Células que migran mas posterior en la línea primitiva formaran
mesodermo. Y ectodermo? (figura 5).
Preparación para manejo de embriones
Incubación
Huevos fecundados se mantienen a temperaturas de 13-16C antes de incubarlos. Se incubaran
de 38-39C hasta las etapas deseadas en una incubadora humidificada. Huevos se colocan
sobre su lado (horizontal). Si se sacan de la incubadora y se dejan a temperatura de salón se
reduce la velocidad del desarrollo.
Abrir y exponer los embriones.
Para visualizar los embriones, una ventana se abrirá en el cascaron para exponerlos. Se
remueven de la incubadora y se colocan en un nido o plataforma que los sostenga bajo un
microscopio de diseccion. El nido puede ser de algodón en un plato de cristal, o una cama de
plasticina en un plato Petri. Puede ser un carton de huevos o un pedazo de foam. En una
incubadora humidificada el embrión flota dentro del cascaron. La posición se puede ubicar
usando una lámpara para transiluminar el huevo.
Antes de abrir el huevo se le pasa etanol 70%. El embrión debe estar flotando bajo el cascaron.
Para evitar hacerle daño mientras se abre se debe hacer descender. Se inserta una jeringa de
3ml con una aguja 18 por uno de los extremos del huevo y se extraen 3ml de la albumina
acuosa de la parte inferior del huevo. Con una tijera se corta el cascaron . Se puede poner algo
de tape donde se cortara para evitar que fragmento del cascaron caigan en el interior.
En etapas tardías (3 dias o mas) el huevo se puede abrir usando unas pinzas sin filo para
remover cascaron y membrana sobre algún área avascula
Mejorar visibilidad o contraste
a) embriones tempranos (etapas 14, 22
4
b) somitas) inyectar tinta India diluida 1:10 en RInger usando una jeringa de 1ml con una
aguja 26. Pinchar la membrana vitelina externa e inyectar la tinta bajo el embrión.
Moverlo gentilmente.
c) Embriones mas viejos o expuestos en ventanas usar tinte Sulfato Azul Nilo (0.5%) varios
ul sobre el embrión.
Este ejercicio consistirá
en incubar 10-12 huevo
fecundados
en
una
incubadora
portátil
educativa para observar
el desarrollo del ave a lo
largo de 21 días. Esta
incubadora estará en un
área fija durante todo el
proceso, y cada otro día
un grupo de laboratorio
removerá un huevo de Figure 7 - Organogénesis
ellas y lo abrirá. Drenará
parte del liquido y luego
verterá el contenido cuidadosamente en un plato Petri con solución Ringer para observarlo en
microscopia de disección y tratar de identificar todas las partes posibles y documentarlas con
fotos o dibujos. Estas observaciones serán compartidas con el grupo completo para que al
terminar todos tengan el proceso completo.
Hay que ser extremadamente cuidadosos con detalles como puntualidad, disección, limpieza y
disposición de desechos, para evitar contaminación, y malos olores en el laboratorio.
Resultados:
Observaciones,
fotos,
dibujos
y
descripciones del proceso desde que obtiene
el huevo hasta que lo abre, lo drena, y lo
observa en el microscopio de disección.
Debe saber que cosas deben estar ese dia
en el embrión para tratar de identificarlas. En
su libreta de laboratorio anotara, tabulara y
documentara sus
observaciones.
Las
comparará con lo esperando según la
literatura para ese dia.
Materiales:
12 huevos fecundados
incubadora con temperatura y humedada
Etanol 70%
Tape
Goteros
Pipetas
Platos Petri
Figure 8 - Ciclo de vida del pollo
5
Pinzas
Tijeras
Cajas de foam
Microscopia de diseccion
Solucion desinfectante /desodorizante
Solución Ringer.
NaCl
7.20g
CaCl2
0.17g
KCl
0.37g
H2O hasta 1000
Solución PBS
PBS 10X
Na2HPO4
11.5g
NaCl
80 g
KH2PO4
2g
KCl
2g
H2O hasta 1000 ml
Ańadir sal lentamente, ajustar pH a 7.2-7.3 y autoclavear
Solucion salina 0.9%
NaCl 0.9 g
Agua 100ml
Referencias electrónicas
http://chickscope.beckman.uiuc.edu/explore/embryology/
https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Chicken_Development
http://www.vcbio.science.ru.nl/en/virtuallessons/embryology/chicken/
http://www.aces.edu/pubs/docs/A/ANR-1408/ANR-1408.pdf
http://www.vcbio.science.ru.nl/en/virtuallessons/embryology/chicken-slides/
http://www.vcbio.science.ru.nl/en/virtuallessons/embryology/chicken-movies/
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