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CAPÍTULO 2.1.20.
FIEBRE DEL NILO OCCIDENTAL
RESUMEN
El virus de la fiebre del Nilo Occidental (WNV) es un miembro del género Flavivirus de la familia
Flaviviridae. El arbovirus se mantiene en la naturaleza a través de las aves y los mosquitos;
numerosas especies de aves y de mosquitos permiten la replicación del virus. En muchas especies
de aves, la infección por el WNV no produce síntomas evidentes mientras que en otras, como el
cuervo americano (Corvus brachirhynchos) y el arrendajo azul (Cyanocitta cristata), la enfermedad
es generalizada y mortal. Entre los mamíferos, la enfermedad clínica se presenta sobre todo en los
caballos y los humanos.
Los síntomas clínicos de la infección por WNV en los caballos derivan de la encefalitis inducida por
virus o encefalomielitis. Las infecciones dependen de la transmisión por los mosquitos y son
estacionales en climas templados, alcanzando el máximo a comienzos de otoño en el Hemisferio
norte. Los caballos afectados presentan frecuentemente una ataxia benigna o grave. Los síntomas
pueden variar desde una ligera descoordinación hasta la postración. Algunos caballos muestran
debilidad, fasciculación muscular y problemas en los nervios craneales. La fiebre no es una
característica normalmente presente en la enfermedad de los caballos.
Identificación del agente: Generalmente los tejidos de las aves contienen concentraciones más
altas del virus que los de los caballos. El cerebro y la médula espinal son los tejidos preferidos para
el aislamiento del virus en los caballos. En las aves, el riñón, el corazón, el cerebro o el intestino
pueden proporcionar aislamientos del virus. Los cultivos celulares (por ejemplo, de riñón de conejo
o de células Vero) se usan frecuentemente para el aislamiento del virus. El WNV es citopático en
sistemas de cultivo susceptibles. Se pueden detectar el ácido nucleico vírico y los antígenos víricos
en los tejidos de animales infectados mediante la reacción en cadena de la polimerasa de
transcripción inversa (RT-PCR) o por inmunohistoquímica, respectivamente. El método más
sensible para identificar WNV en tejidos equinos es un procedimiento de RT-PCR con formato
anidado.
Pruebas serológicas: Los anticuerpos se pueden identificar en el suero equino comediante el
enzimoinmunoensayo con IgM de captura (ELISA con IgM de captura), inhibición de la
hemaglutinación (IH), ELISA con IgG o neutralización por reducción de calvas (PRN). Los métodos
ELISA y PRN son los que se utilizan con mayor frecuencia para identificar los anticuerpos contra el
WNV en suero de las aves. En algunas pruebas serológicas, se pueden encontrar reacciones
cruzadas del anticuerpo con flavovirus relacionados, tales como el virus de la encefalitis de St.
Louis o el virus de la encefalitis japonesa.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Están disponibles una vacuna de
WNV inactivada con formalina derivada de cultivos de tejidos, una vacuna de WNV con vectores
de canarypoxvirus vivos, una vacuna de ADN del WNV y una vacuna quimérica para uso en
caballos.
A. INTRODUCCIÓN
El virus de la fiebre del Nilo Occidental (WNV) es un arbovirus zoonósico transmitido por mosquitos que
pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae (26). El género Flavivirus incluye el virus de la encefalitis
japonesa (véase el capítulo 2.1.7), el virus de la encefalitis de St. Louis, el virus del valle de Murray, el virus
Usutu y el virus Kunjin, entre otros (6). El WNV tiene un ámbito geográfico amplio que incluye partes de Europa,
Asia, África, Australia (virus Kunjin) y América del norte, central y del sur. Se cree que las aves migratorias son
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las responsables de la dispersión del virus, incluyendo la reintroducción del WNV desde las áreas endémicas a
las regiones que experimentan brotes esporádicos (6). El WNV se mantiene por un ciclo de transmisión entre
mosquito-pájaro-mosquito, mientras que los humanos y los caballos se consideran hospedadores finales. El
análisis genético de los aislamientos de WNV divide las cepas en dos clases. Los aislamientos de la estirpe 1 se
encuentran en África central y del norte, Israel, Europa, India, Australia (virus de Kunjin) y América del norte y
central, Colombia y Argentina. Las cepas de la estirpe 2 son endémicas en África central y del Sur y en
Madagascar, con co-circulación de las estirpes de ambos virus en África Central (3,7). Ha habido una descripción
reciente de la estirpe 2 en Hungría. Mientras que los brotes recientes en humanos y en equinos se deben a virus
de la estirpe 1, las cepas de ambas estirpes han estado implicadas en la enfermedad de los humanos y de los
animales.
El WNV se ha reconocido como un patógeno humano en África durante la primera mitad del siglo XX. Aunque se
han descrito varias epidemias de fiebre por el WNV, antes de 1996, era rara la encefalitis como consecuencia de
la infección humana por el WNV, pero, desde entonces, los brotes de encefalitis del Nilo Occidental se han
descrito en los humanos en Rumania, Rusia, Israel, Norteamérica, Francia y Túnez (4, 11, 13, 15, 33). Durante
los años 1960, la encefalitis del Nilo Occidental en los caballos se describió en Egipto y Francia (25, 35). Desde
1998, se han descrito brotes de encefalitis equina por el WNV en Italia, Francia, Canadá, EE.UU., Israel y
Marruecos (8, 14, 19, 21). En el hemisferio occidental, el virus se extendió ampliamente desde una pequeña
región de la costa Este del estado de Nueva York hasta incluir la mayor parte de los estados lindantes con
EE.UU., como Canadá y México, las islas caribeñas, América Central, Argentina, Colombia y Venezuela (10, 18,
21, 30). Excepto en EE.UU. y Canadá, la introducción del virus en el hemisferio occidental no se ha caracterizado
por grandes brotes de la enfermedad o por una elevada mortalidad en ninguna especie, posiblemente como
consecuencia de la exposición a los flavivirus endógenos que circulan en esas regiones.
El periodo de incubación de la encefalitis equina por el WNV después de la transmisión por el mosquito es de 3–
15 días. Una rápida viremia de baja titulación precede la aparición clínica (5, 25). La encefalitis por el WNV tiene
lugar en un porcentaje pequeño de caballos infectados; la mayor parte de los infectados no exhibe síntomas
clínicos (21). La enfermedad en los caballos se caracteriza frecuentemente por ataxia leve o grave. Además, los
caballos pueden mostrar debilidad, fasciculación muscular y problemas en los nervios craneales (8, 21, 22, 27).
La fiebre no siempre está presente. El tratamiento es de mantenimiento y los síntomas pueden solucionarse o
progresar hasta la postración terminal. La tasa de mortalidad es de aproximadamente uno de cada tres caballos
afectados clínicamente. El diagnóstico diferencial incluye otras encefalitis arbovíricas (por ejemplo la
encefalomielitis equina venezolana, del este o del oeste y la encefalitis japonesa), la mielitis equina por protozoos
(Sarcocystis neurona), el herpesvirus-1 equino, la enfermedad de Borna y la rabia.
La mayoría de las especies de aves, puede resultar infectadas por el WNV y la evolución clínica de la infección
es variable. Los pollos y los pavos son resistentes. Se han detectado brotes de enfermedad neurológica fatal en
aves de los zoológicos de EE.UU. y en gansos domésticos en Israel y Canadá (1, 28, 33). El WNV se ha
detectado como enfermedad esporádica en un número pequeño de otras especies, incluyendo las ardillas, las
ardillas listadas, los murciélagos, los perros, los gatos, los renos, las ovejas, las alpacas, los caimanes y las
focas, coincidiendo la enfermedad con periodos intensos de actividad vírica. La mayoría de las infecciones en los
humanos se producen por el contagio natural de los mosquitos, pero se han descrito infecciones adquiridas en el
laboratorio. En los casos clínicos sospechosos, las muestras de diagnóstico de todos los animales,
particularmente aves, deberían manejarse con un nivel 3 de contención siguiendo procedimientos de laboratorio
adecuados (véase el capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de
microbiología y en las instalaciones de los animales) (24). Se ha confirmado la transmisión del WNV en humanos
por la transfusión sanguínea, por los transplante de órganos y por la leche.
Debido a la presencia de infecciones latentes por el WNV, los criterios de diagnóstico deben incluir una
combinación de evaluación clínica y pruebas de laboratorio.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Cultivo
Las muestras para el aislamiento del virus incluyen el cerebro y la médula espinal de caballos encefalíticos
(21, 22); para tener éxito, se debe utilizar una variedad de tejidos de aves incluyendo el corazón, el cerebro
o el hígado (28). En general, los aislamientos del virus se obtienen más fácilmente de las muestras aviares.
Los virus pueden propagarse en cultivos celulares susceptibles, tales como riñón de conejo (RK-13) y
células de riñón de mono verde africano (Vero), o en huevos de pollo embrionados. Es menos probable que
las inoculaciones intracerebrales de ratones recién nacidos produzcan aislamientos del virus en tejidos de
mamíferos que los métodos de cultivos celulares. Puede necesitarse más de un pase en cultivos celulares
para observar el efecto citopático (EC). La confirmación de los aislamientos de WNV se logra mediante
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tinción indirecta con anticuerpos fluorescentes de cultivos infectados o mediante métodos de detección del
ácido nucleico (véase más adelante)
b)
Métodos inmunológicos
La tinción inmunohistoquímica (TH) de tejidos aviares fijados con formalina es un método fiable para la
identificación de la infección por el WNV en las aves. En las aves infectadas, el cerebro, el corazón, el riñón,
el bazo, el hígado, el intestino y el pulmón son a menudo tejidos positivos a la TH. El éxito de la detección
en las aves positivas aumenta con el examen de muestras múltiples. La especificidad de la identificación
(por ejemplo, específica de flavivirus o específica de WNV) depende de la selección del anticuerpo detector.
Los tejidos del cerebro y la médula espinal de caballos con encefalitis por el WNV son positivos de modo
irregular a la prueba de la TH; aproximadamente el 50% de los casos de encefalitis equina por el WNV
producen resultados negativos falsos. La imposibilidad de identificar antígenos de WNV en el sistema
nervioso central equino no excluye la infección.
c)
Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
La detección del ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
(RT-PCR) aumenta significativamente la identificación de tejidos infectados por el WNV, particularmente
cuando se aplica la PCR anidada en muestras frescas, sin fijar, de cerebro y de médula espinal de caballos
(16). El método de la RT-PRC anidada para detectar ácido nucleico de WNV que codifica una porción del
gen E se describe a continuación. Este método se desarrolló utilizando un aislamiento de Norteamérica
1999 y ha resultado eficaz para detectar ARN del WNV en tejidos animales durante brotes recientes en
Norteamérica. El virus de la encefalitis de St. Louis no se detecta por este método. Los virus del Nilo
Occidental de la estirpe 1 de la República Popular de China, Francia, Egipto, Israel, Italia, Kenia, México y
Rusia muestran una secuencia de nucleótidos muy conservada en la región diana, independientemente de
la especies de origen (17). El análisis de la información de la secuencia para la cepa de la estirpe 2 de
Uganda 1937 (Banco de Genes M12294) en la región marcada por los cebadores de la PCR indica que no
es de esperar que ocurra la amplificación de las cepas de la estirpe 2 del WNV. No se han examinado otros
virus del serogrupo de la encefalitis japonesa. Los métodos no anidados, incluyendo la PCR en tiempo real,
tienen menos riesgo de contaminación cruzada en el laboratorio y pueden aplicarse con éxito a las
muestras de tejidos de aves (17). Se ha descrito una RT-PCR en tiempo real para detectar el ácido nucleico
del WNV (29). Para estandarizar los métodos moleculares sobre el WNV se ha llevado a cabo un estudio de
eficacia basado en tejidos fijados con formalina que ha sido publicado (20). Los tejidos escogidos para la
PCR son los mismos que los escogidos para los intentos de aislamiento del virus.

Procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa anidada por transcripción inversa (RT-nPCR)
La RT-nPCR aquí descrita incluye varios procedimientos: extracción de ARN, transcripción inversa para
generar ADN a partir de ARN y el primer paso de la PCR, el segundo paso de la PCR utilizando cebadores
"anidados" y, finalmente, la detección de un amplicón de tamaño apropiado por electroforesis en gel. Las
regiones del gen de la proteína E de EON de 445 pb (pares de bases) y 248 pb se amplifican en el primer
paso y en los procedimientos de anidación, respectivamente. Los kits y los reactivos descritos a
continuación se proponen como un ejemplo. Pueden existir productos equivalentes de otras fuentes. Se
requiere un cuidado extremo en el manejo de todo el material y es esencial la inclusión de los controles
adecuados para asegurar los resultados precisos. Las precauciones que hay que tomar se han descrito en
el capítulo 1.1.5. Validación y control de calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa
utilizados para el diagnóstico de enfermedades Infecciosas. Se debe procesar y analizar por duplicado cada
muestra de diagnóstico para aumentar la confianza en los resultados de la prueba. Se deben tomar las
precauciones oportunas cuando se manejen reactivos de riesgo como el bromuro de etidio.

Extracción del ARN vírico
Se extrae el ARN total de entre 50 y 100 mg de tejido utilizando el reactivo Trizol® (Life Technologies,
Grand Island, NY, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrae también ARN total del
stock control de virus WNV que contiene 10-100 dosis infectivas de cultivo de tejido (DICT50) por 100 µl de
volumen.
•
Trascripción inversa y primera fase de PCR
Cebadores de la primera fase:
1401: 5’-ACC-AAC-TAC-TGT-GGA-GTC-3’
1845: 5’-TTC-CAT-CTT-CAC-TCT-ACA-CT-3’
i)
Se suspenden las muestras de ARN extraído en 12 µl de ARNasa libre de agua.
ii)
Se incuba a 70°C durante 10 minutos.
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iii)
Se añaden 2 µl de cada muestra de ARN a 48 µl de mezcla para RT-PCR que tiene una composición
final de:
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCl
2.0 mM MgCl2
0,8 mM del conjunto de deoxinucleósidos trifosfato (dNTP)
25 unidades de RT de M-MLV (transcriptasa inversa del virus Moloney de la leucemia murina)
1.25 unidades de inhibidor de la ARNase
1.25 unidades de AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.)
37.5 pmol de los cebadores de la primera fase.
Incluir controles "sin ARN" usando 2 µl de ARNasa libre de agua en vez de ARN desnaturalizado.
iv)
Se incuban los tubos de reacción a 45°C durante 45 minutos.
v)
Se incuban los tubos de reacción a 95°C durante 11 minutos.
vi)
Amplificación por PCR durante 35 ciclos.
Desnaturalización a 95°C durante 30 segundos,
Anillamiento del cebador a 55°C durante 45 segundos,
Extensión del cebador a 72°C durante 60 segundos (al ciclo 35, extensión del cebador a 72°C durante
5 minutos).
vii)
Se mantienen las muestras a 4°C hasta la segunda fase de la PCR.
•
Segunda fase (anidada) de PCR
Cebadores de la segunda fase:
1485: 5’-GCC-TTC-ATA-CAC-ACT-AAA-G-3’
1732: 5’-CCA-ATG-CTA-TCA-CAG-ACT-3’
i)
Para cada muestra y el control, se añade 1,5 µl del producto amplificado de la primera fase a 48,5 µl
de mezcla PCR con una composición final de:
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCl
2,0 mM MgCl2
0,8 mM del conjunto de deoxinucleósido trifosfato (dNTP)
1,25 unidades de AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.)
37,5 pmol de cada uno de los cebadores anidados.
ii)
Se incuban los tubos de reacción a 95°C durante 11 minutos.
iii)
Amplificación por PCR durante 35 ciclos:
Desnaturalización a 95°C durante 30 segundos,
Anillamiento del cebador a 55°C durante 45 segundos,
Extensión del cebador a 72°C durante 60 segundos (al ciclo 35, extensión del cebador a 72°C durante
5 minutos).
iv)
Se mantienen las muestras a 4°C o –20°C hasta la electroforesis.
•
Análisis de los productos de PCR por electroforesis en gel
i)
Se prepara una solución al 2,5% de agarosa NuSieve® 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland, Maine,
EE.UU.) en 0,045 mM de Tris/borate, pH 8,6, 1,5 mM EDTA (ácido etilén diamino tetra-acético) (1 ×
TBE buffer). Se hierve la agarosa en un calentador o con microondas hasta su disolución completa. Se
enfría la agarosa a 45–55°C. Se añaden 5,0 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por 100 ml
de agarosa caliente y se vierte la agarosa con un peine. Se deja solidificar y se retira el peine.
ii)
Se añade 5,0 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por 600 ml de tampón 1 × TBE de
depósito. Se coloca el gel en el aparato y se llenan los depósitos de tampón.
iii)
Se mezcla 15 µl de cada muestra y cada control con 5 µl de solución de carga de gel (por ejemplo,
Sigma G-2526, St Louis, MO, EE.UU.) Se incluye un ADN marcador de 100 pb (por ejemplo, Life
Technologies, Grand Island, NY, EE.UU., producto 15268-019, rango 100–1.500 pb) en al menos un
pocillo del gel. Se cargan las muestras en los pocillos de agar y se inicia la electroforesis a 65–
75 voltios hasta que el colorante de gel de carga se desplace aproximadamente dos tercios de la
longitud del gel.
iv)
Se visualiza y fotografía el gel con iluminación ultravioleta.

Interpretación de la prueba
Para que la prueba de la PCR sea válida, los controles positivos han de mostrar la banda de tamaño
adecuado (248 pb). Los controles de “no ARN” no deberían tener bandas. Se considera que las muestras
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son positivas si hay una banda del mismo tamaño que la del control positivo. Las muestras por duplicado
deberían mostrar la misma reacción. Si existe disparidad, se debería repetir la prueba, comenzando con la
extracción del tejido. Si se requiere una validación posterior, el producto de la PCR final anidada se puede
secuenciar y comparar con las secuencias publicadas de WNV en el Banco de genes.
2.
Pruebas serológicas
Se pueden identificar los anticuerpos en el suero equino mediante el enzimoinmunoensayo de captura con IgM
(ELISA de captura con IgM), inhibición de la hemoaglutinación (IH), ELISA con IgG o neutralización por reducción
de calvas (PRN) (2, 12). El ELISA de captura con IgM descrito a continuación es particularmente útil para
detectar los anticuerpos resultantes de la exposición natural a WNV. Generalmente, los anticuerpos IgM
específicos de EON equino son detectables desde los 7 y 10 días hasta 1–2 meses después de la infección. La
mayoría de los caballos con encefalitis EON dan positivo a la prueba de ELISA de captura con IgM a la vez que
se observan los primeros síntomas clínicos. Los anticuerpos neutralizantes de WNV son detectables en el suero
equino 2 semanas después de la infección y pueden persistir durante más de 1 año. Los métodos de PRN y HI
son los más utilizados normalmente para la identificación de los anticuerpos de WNV en suero de aves. En
algunos ensayos serológicos, se pueden encontrar reacciones cruzadas entre los anticuerpos con flavivirus
relacionados, como el virus de la encefalitis de St. Louis o el virus de la encefalitis japonesa. La prueba de NRC
es las más específica de las pruebas serológicas de WNV; cuando sea necesario, se pueden probar en paralelo
títulos de anticuerpo del suero contra flavivirus relacionados. Finalmente, se debe considerar la historia de la
vacunación de WNV en la interpretación de los resultados serológicos, particularmente en la prueba de NRC y
ELISA con IgG. El ELISA de captura con IgM se puede utilizar en especies de aves u otras especies siempre que
se disponga de anticuerpos de captura específicos de la especie (por ejemplo, IgM anti-pollo). La prueba de PRN
se aplica a cualquier especie, incluyendo a las aves.
a)
ELISA de captura con IgM equina
Se pueden preparar antígenos de WNV y controles negativos para el ELISA de captura con IgM a partir de
cerebro de ratón (véase el capítulo 2.5.7), cultivos de tejido, o líneas celulares recombinantes (9). En
Norteamérica hay marcas comerciales de reactivos de prueba de WNV. Se puede obtener un suero control
equino caracterizado, aunque no sea un estándar internacional, de los Laboratorios de los Servicios
Veterinarios Nacionales, Ames, Iowa, EE.UU. Se deberían preparar antígenos del virus y antígenos control
en paralelo para su uso en el ELISA. Las preparaciones del antígeno deben titularse con sueros control
para optimizar la sensibilidad y especificidad del ensayo. Las muestras de suero equino se prueban a una
dilución de 1/400 y las muestras de líquido cerebroespinal equino se prueban a una dilución de 1/2 en el
ensayo. Para asegurar la especificidad, cada muestra de suero se prueba para controlar la reactividad tanto
con el antígeno del virus como con el antígeno control.

Procedimiento de la prueba
i)
Las placas ELISA de 96 pocillos con fondo liso (por ejemplo Immulon 2HB, Dynex Technolgoies,
Chantilly, VA, EE.UU) se revisten con 100 µl por pocillo de IgM anti-equina diluida en 0,5 M de tampón
carbonato, pH 9,6, de acuerdo con la dilución sugerida por el fabricante para uso como anticuerpo de
captura.
ii)
Se incuban las placas durante la noche a 4°C en una cámara húmeda. Las placas revestidas se
pueden almacenar durante varias semanas.
iii)
Antes de usarlas, se lavan las placas dos veces con 200-300 µl/pocillo de solución salina tamponada
con fosfato 0,01 M, pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST).
iv)
Se bloquean las placas añadiendo 300 µl/pocillo de leche en polvo desnatada al 5% recién preparada
en PBST y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se retira
la solución de bloqueo y se lavan las placas tres veces con PBST.
v)
Se diluyen los sueros problema y control 1/400 (el líquido cerebroespinal se diluye 1/2) en PBST y se
añaden 50 µl/pocillo de cada muestra a pocillos duplicados (total de cuatro pocillos por muestra) sobre
la placa. Se incluyen los controles de suero positivo y negativo preparados de la misma forma que las
muestras.
vi)
Se cubren las placas y se incuban 75 minutos a 37°C en una cámara húmeda.
vii)
Se retira el suero y se lavan las placas tres veces en PBST.
viii) Se diluye el virus y los antígenos negativos de control en PBST y se añaden 50 µl de antígeno vírico a
un conjunto de pocillos de sueros problema y sueros control, y se añaden 50 µl de antígeno normal al
segundo conjunto de pocillos de sueros prueba y control.
ix)
Se cubren las placas y se incuban durante la noche a 4°C en una cámara húmeda.
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x)
Se retiran los antígenos de los pocillos y se lavan las placas tres veces en PBST.
xi)
Los anticuerpos monoclonales anti-Flavivirus conjugados con peroxidasa de rábano1 se diluyen en
PBST de acuerdo con las indicaciones del fabricante y se añaden 50 µl por pocillo.
xii)
Se cubren las placas y se incuban a 37°C durante 60 minutos.
xiii) Se retira el conjugado y se lavan las placas seis veces en PBST.
xiv) Se añaden 50 µl/pocillo de substrato ABTS recién preparado (ácido 2,2’-azino-di-[3-etilbenzatiazolina]-6-sulfónico) con peróxido de hidrógeno (0,1%) y se incuba a temperatura ambiente
durante 30 minutos.
xv)
b)
Se mide la absorbancia a 405 nm. Una muestra problema se considera positiva si su absorbancia en
los pocillos que contienen el antígeno del virus es al menos dos veces la absorbancia del suero control
negativo en los pocillos que contienen el antígeno del virus y al menos dos veces la absorbancia de la
muestra probada en paralelo en los pocillos que contienen el antígeno control.
Neutralización por reducción de calvas (aplicable a sueros de cualquier especie)
La prueba de PRN se lleva a cabo en cultivos celulares Vero en recipientes de 25 cm2 o en placas de
6 pocillos. Los sueros se pueden analizar a una dilución final de 1/10 y 1/100 o se pueden valorar para
establecer un punto final. A continuación se ofrece una descripción de la prueba llevada a cabo en
matraces de 25 cm2 utilizando 100 unidades formadoras de placas o calvas (PFU) del virus.
Previamente a la prueba, el suero se inactiva por calor a 56º C durante 30 minutos y se diluye en medios
(por ejemplo 1/5 y 1/50). Se prepara una dilución de virus (200 UFP por 0,1 ml) en medios que contengan
10% de complemento de cobaya. Se mezclan volúmenes iguales de virus y de suero y se incuban a 37°C
durante 75 minutos antes de inocular 0,1 ml en monocapas de cultivos celulares confluentes. El inóculo se
absorbe durante 1 hora a 37°C, y después se añaden 4,0 ml de medio primario de cobertura. Este medio
primario está formado por dos soluciones que se preparan separadamente. La solución I contiene 2 ×
Solución Salina Básica de Earle sin rojo fenol, 4% de suero bovino fetal, 100 µl/ml de gentamicina y 0,45%
de bicarbonato sódico. La solución II está formada por agar noble al 2%, que se esteriliza y mantiene a
47 C. Se ajustan a 47°C volúmenes iguales de las soluciones I y II y se mezclan inmediatamente antes de
su uso. La prueba se incuba durante 72 horas a 37°C. Se aplica a cada recipiente 4,0 ml de un segundo
medio de cobertura, preparado como se indicó anteriormente, pero conteniendo también rojo neutro al
0,003%. Después de otra incubación durante la noche a 37°C, se evalúa el número de calvas ocasionadas
por el virus en cada matraz. Los títulos de punto final se basan en la reducción al 90% en comparación con
recipientes con virus control, que deberían tener alrededor de 100 calvas.
Cuando se dispone de pequeños volúmenes de muestra pueden ser más adecuadas las pruebas estándar
de microneutralización o de neutralización por reducción de calvas en placas de microtitulación.
REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
En febrero de 2003, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) autorizó una vacuna de WNV
inactivada con formalina y derivada de cultivos de tejidos para aplicación en caballos. En diciembre de 2003 le
siguió la autorización por parte del USDA de una vacuna viva de WNV que utiliza el canaripoxvirus como vector
para uso en caballos. En 2004, Crucell N.V. (Holanda) desarrolló una vacuna inactivada contra el WNV derivada
de una línea celular humana y el Instituto Veterinario Kimron (Israel) obtuvo la autorización comercial en Israel
como vacuna veterinaria para gansos. En julio del 2005, el USDA emitió la primera autorización para una vacuna
con ADN del WNV para animales en EE.UU. La vacuna contiene genes para dos proteínas del WNV y, por tanto,
no contiene el virus completo, ni vivo ni muerto. A finales de 2006 se autorizó por el USDA una vacuna quimérica
basada en un virus de la fiebre amarilla como vector para uso en caballos. Se ha demostrado que estas vacunas
son eficaces y seguras en los caballos vacunados adecuadamente. La vacunación puede ser útil para evitar los
síntomas neurológicos asociados con la infección con el WNV.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se indican en el capítulo 1.1.8. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas presentadas aquí y en el capítulo 1.1.8 son de naturaleza
general y puedan suplementarse con requisitos nacionales o regionales.
1
6
Disponible en centros de Prevención y Control de la Enfermedad, Reactivos de Referencia Biológica, 1600 Clifton Road
NE, Mail Stop C21, Atlanta, Georgia, 30000, EE.UU.
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Capítulo 2.1.20 — Fiebre del Nilo Occidental
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El aislamiento del WNV utilizado para la producción de vacunas debe acompañarse de una documentación
que describa su origen e historial. El aislamiento debe ser seguro en los animales hospedadores a la edad
de vacunación deseada y proporcionar protección después de un inóculo de desafío.
b)
Método de cultivo
El WNV debe propagarse en líneas celulares en las que se sepa que mantienen el crecimiento del WNV.
Las líneas celulares deben estar libres de virus extraños, bacterias, hongos y micoplasmas. La propagación
vírica no debe exceder de cinco pases desde el inoculo del virus original, a menos que los pasos siguientes
demuestren que proporcionan protección en el animal hospedador.
Validación como vacuna
El inóculo original de virus debe estar libre de bacterias, hongos y micoplasmas. Además, debe probarse
mediante la técnica de los anticuerpos fluorescentes que esté libre de virus extraños, incluyendo el
herpesvirus equino, el adenovirus equino, el virus de la arteritis vírica equina, el virus de la diarrea vírica
bovina, los reovirus, y el virus de la rabia. El inóculo original de virus debe estar libre de virus extraños por
ECP y hemoadsorción en la línea celular Vero y en un tipo de células equinas embrionarias.
En un ensayo de inmunogenicidad, el inóculo original de virus debe proteger a los caballos susceptibles
contra una cepa de desafío virulenta en el nivel más alto de pases empleado para la producción. Debe
protegerse de la viremia a una cantidad estadísticamente significativa de caballos vacunados si se compara
con los controles. Deben realizarse estudios de ensayo de campo para determinar la seguridad de la
vacuna.
2.
Método de producción
La línea celular susceptible se inocula en recipientes adecuados. Como medio para producción, se utiliza el
medio mínimo esencial, suplementado con suero bovino fetal (SBF). Se incuba a 37°C.
Los cultivos celulares se inoculan directamente con virus activo almacenado de EON, que generalmente
presenta de 1 a 4 pases del inóculo vírico original. Los cultivos inoculados se incuban durante 1–8 días antes de
recoger el medio de cultivo. Durante la incubación, los cultivos se observan diariamente para detectar ECP y la
contaminación bacteriana.
Las vacunas con virus muertos son inactivadas químicamente con formalina o etilenimina binaria y se mezclan
con un adyuvante adecuado.
El casete de expresión de la vacuna con ADN se amplifica en Escherichia coli, usando un vector plásmido
mediante una sección de la espina dorsal plásmida, y se purifica para su formulación como vacuna.
3.
Control del proceso
Los lotes de producción del WNV se deben valorar en cultivos de tejido para la estandarización del producto. Los
lotes de baja titulación se pueden concentrar o combinar con lotes de alta titulación para alcanzar el título
correcto.
4.
Control de lotes
En las muestras de los recipientes finales se comprueba su pureza, seguridad y potencia.
a)
Pureza
Se examinan las muestras para detectar la contaminación bacteriana y fúngica. Para llevar a cabo los
controles de bacterias, se inoculan diez frascos, cada uno de los cuales contiene 120 ml de medio de soja e
hidrolizado de caseína, con 0,2 ml de muestras de diez frascos finales. Los diez frascos se incuban a 30–
35°C durante 14 días y se observan para detectar el crecimiento bacteriano. Para hacer pruebas de
hongos, se inoculan diez frascos, cada uno con 40 ml de medio de soja e hidrolizado de caseína, con 0,2 ml
de muestras de diez frascos finales. Los frascos se incuban a 20–25°C durante 14 días y se observan para
detectar el crecimiento de hongos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.1.20 — Fiebre del Nilo Occidental
b)
Inocuidad
Se pueden llevar a cabo pruebas de inocuidad combinando cobayas, ratones o caballos. Se deberían
realizar estudios de seguridad en el campo antes de que la vacuna reciba la aprobación final.
Generalmente, se emplean dos series, en tres localizaciones geográficas diferentes, y un mínimo de
600 animales. Alrededor de un tercio de los animales debería tener la edad mínima recomendada para la
vacunación (correlacionada con la eficacia). Si el producto final es una vacuna viva modificada, se requieren
pruebas de seguridad adicionales del inóculo vírico original para demostrar la falta de virulencia.
c)
Potencia
Para las vacunas con virus muertos se pueden utilizar pruebas de vacunación serológicas de animales de
laboratorio o de animales hospedadores o pruebas de vacunación desafío para determinar la potencia del
producto final. Para determinar la potencia relativa de un producto, se consideran aceptables ensayos
paralelos en los que se utilizan técnicas de ELISA de cuantificación del antígeno para comparar un estándar
con el producto final. Debe demostrarse que el estándar es protector en el animal hospedador (22). Los
productos víricos vivos se titulan en cultivos celulares para determinar la potencia del producto final. El título
de potencia final a la hora de expedir el producto debería incluir un 0,7 log10 adicional para compensar la
variabilidad de la prueba y un 0,5 log10 para la estabilidad a la fecha de caducidad, respecto a la dosis
protectora mínima establecida en la prueba de inmunogenicidad.
d)
Duración de la inmunidad
Los estudios de duración de la inmunidad se llevan a cabo antes de que la vacuna reciba la aprobación
definitiva. La duración debería ser la misma que la de la estación del mosquito en las áreas infectadas.
e)
Estabilidad
Inicialmente, todas las vacunas tienen una validez de 24 meses. Se deben realizar estudios de estabilidad
en tiempo real para confirmar que las fechas de caducidad son las adecuadas.
f)
Conservantes
Durante la producción se añaden antibióticos, generalmente sulfato de gentamicina o neomicina, que no
deben exceder de 30 µg/ml.
g)
Precauciones (riesgos)
Únicamente se recomienda la vacunación en los caballos de zonas positivas al EON. Los caballos
vacunados pueden desarrollan un título serológico que podría interferir con la capacidad de exportación del
caballo.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase la sección C.4.b.
b)
Potencia
Véase la sección C.4.c.
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*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia para la fiebre del Nilo Occidental (véase el cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la lista actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).
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