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Índice de Trabajos en Extenso
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. IDENTIFICACIÓN DEL POLIMORFISMO EN EL GEN DE LA COLÁGENA TIPO 2
ALFA 1 EN PACIENTES CON OSTEOARTRITIS
GALVEZ-ROSAS ARTURO1, GONZALEZ-HUERTA NORMA CELIA1, DUARTESALAZAR CAROLINA1, REYES MARÍN BALTASAR1, RAMON-GALLEGOS EVA2,
MIRANDA-DUARTE ANTONIO1.
1
Instituto Nacional de Rehabilitación S.S. Servicios de Genética, Reumatología, Radiología e
Imagen. Calzada México-Xochimilco 289, Col. Arenal de Guadalupe, Delegación Tlalpan,
C.P.14389, México D.F. Tel. 59991000 ext. 19406,19411, E-mail: art690615@yahoo.com.mx.
2
Lab. De Citopatología Ambiental. Depto. De Morfología. ENCB-IPN. Carpio y Plan de Ayala
S/N. Col. Sto Tomas. CP 11340. e-mail: evaramong@yahoo.com.mx
INTRODUCCIÓN.
La osteoartritis (OA) se define como una enfermedad degenerativa de varias
articulaciones sinoviales como en la mano, columna, cadera, y rodilla (1). Existen dos
categorías de la enfermedad en la que el paciente no tiene antecedentes que expliquen
el desarrollo de la OA denominada primaria o idiopática y la secundaria que son
aquellos casos en los cuales existe un antecedente previo que permite su identificación
como factor desencadenante (2). La OA es una enfermedad multifactorial, con una
fuerte carga genética aunque los genes involucrados son aun desconocidos. La
identificación de los factores genéticos asociados con la severidad de la OA
potencialmente deben incrementar la prevención de la inestabilidad y también deben
ser usados para un diagnóstico temprano o el monitoreo de la enfermedad (3). El gen
de la colágena tipo II alfa 1 (COL2A1) es un gen relativamente grande y complejo, es de
30 Kb y contiene 54 exones; se considera como un gen candidato que podría
relacionarse con la OA, dado que la colágena es la proteína estructural más abundante
del cartílago hialino, y una disrupción en este podría alterar las propiedades tensiles del
cartílago (4). Por otra parte, se han encontrado algunas mutaciones en las cadenas
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Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C.P. 02090, México, D. F.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. alfa-1 de COL2A1 que se relacionan a la patogénesis de OA familiar raras y además
tiene sitios polimórficos que se pueden utilizar como marcadores (5). Los marcadores
genéticos son segmentos de DNA con una localización identificable en un cromosoma y
su herencia puede ser rastreada (6). Un polimorfismo es una secuencia corta DNA que
difiere entre individuos sanos sin tener un efecto en el detrimento en el organismo y
puede ser usado como un marcador genético, como en este caso se usaron los
fragmentos largos de restricción polimórfica (RFLPs), para proveer una nueva visión
dentro de la heterogeneidad de los desordenes articulares (7).
OBJETIVO.
Evaluar la frecuencia en la distribución de los polimorfismos de la COL2A1 en
pacientes con y sin OA.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Se realizó un estudio de casos y controles en el Instituto Nacional de
Rehabilitación (INR) en pacientes con OA de rodilla y pacientes sin OA, que fueron
clasificados radiologicamente de acuerdo a la escala Kellgren/Laurence y a quienes se
les tomó una muestra de sangre periférica. Utilizando ADN genómico de pacientes y
controles se amplificó la región del polimorfismo del gen de la colágena localizado
dentro del intrón 23 por la técnica de PCR. Las condiciones empleadas fueron dNTP’s
200
µM,
amortiguador
1X
,
MgCl2
3
Mm,
los
iniciadores
5’-
GGGAAGTGGAGTCCTTGTGG-3’ y 5’-TTCCGGGAGCACCCTAAGG-3’ y 2 U de taq
DNA polimerasa en un volumen final de 50 µL (8). Las condiciones de amplificación
fueron; 94°C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos a 94°C por 45 segundos, 58°C por 45
segundos y 72°C por 60 segundos, obteniendo un producto de amplificación de 331 pb.
Los productos de amplificación se digirieron toda la noche a 37º con la enzima de
restricción Pvu II, y la digestión dio dos bandas de 211 y 120 pb. Posteriormente se
analizaron los polimorfismos encontrados en ambos grupos.
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Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C.P. 02090, México, D. F.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. RESULTADOS.
La distribución por género y los datos demográficos se muestran en las tablas 1 y
2.
Tabla 1.- Distribución por género en pacientes con osteoartritis y controles.
total
Femenino
Masculino
n
n
%
n
%
Casos
38
28
73.7 10
26.3
Controles
50
39
78.0 11
22.0
Tabla 2.- Datos demográficos en pacientes con osteoartritis y controles.
CASOS
CONTROLES
Media
(DS)
Media
(DS)
p
Edad
56.7
(1.5)
54.04
(1.0)
0.14
Talla
1.58
(0.14)
1.57
(0.01)
0.73
Peso
68.2
(1.6)
68.0
(1.2)
0.93
IMC
27.3
(0.44)
27.31
(0.051)
0.99
IMC= indice de masa corporal
La clasificación radiológica de casos y controles se muestra en la tabla 3 donde
se puede observar que los casos muestran un grado mayor o igual a 2 y los controles
un grado menor a 2.
Algunos ejemplos de los RFLPs de la COL2A1 se muestran en la figura 1. En los
RFLPs una letra mayúscula indica la ausencia del sitio de restricción, y una letra
minúscula indica la presencia. En éste caso la letra P fue usada para la enzima de
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. restricción PvuII, donde un homocigoto “PP” da una banda de 331 bp, un homocigoto
“pp” da dos bandas de 211 y 120 bp, y el heterocigoto “Pp” da tres bandas de 331, 211
y 120.
Tabla 3.- Grado radiológico de pacientes con osteoartritis y controles.
Grado
Casos
n
Controles
%
n
%
0
0.0
0.0
27
54.00
1
0.0
0.0
23
46.00
2
15
39.47
0.0
0.0
3
12
31.58
0.0
0.0
4
11
28.95
0.0
0.0
La asociación de cada alelo con la enfermedad fue analizado por separado
comparando individuos que portan una copia (Pp, heterocigoto) o dos copias (PP, pp,
homocigoto). La distribución de la frecuencia de los genotipos para el polimorfismo del
gen de la COL2A1 sugiere una diferencia significativa entre estos dos grupos.
1
2 3 4
5 6 7
8 9 10 11 12 13 14
300 pb
200 pb
100 pb
pp Pp PP PpPpPp Pp PpPPpp
Figura 1. Gel de agarosa al 1.5% de los cortes con la enzima de restricción Pvu II. En el
carril 1 esta el marcador de peso molecular, en el 2 se colocó el blanco de reactivos, en
los carriles 3 y 4 plásmido pBR322 sin y con enzima de restricción respectivamente, 5
un control y del 6-14 muestras de pacientes.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. Los resultados sugieren que el genotipo “Pp” de la COL2A1 está asociado con la
enfermedad con una razón de momios (OR , IC 95%) de 1.85 (0.68 a 5.07)(tabla 4).
Tabla 4.- Riesgo para desarrollar OA en presencia de los polimorfismos del gen
COL2A1 en homocigotos y heterocigotos.
Caso
n
Controles
%
n
%
OR
(IC 95%)
PP
21
55.26
34
68.00
0.58
(0.22-1.52)
Pp
15
39.48
13
26.00
1.85
(0.68-5.07)
pp
2
5.26
3
6.00
0.87
(0.06-8.03)
PP= Homocigoto sin el sitio de restricción, Pp= Heterocigoto,
pp= Homocigoto con el sitio de restricción.
DISCUSIÓN.
Varios factores se deben combinar para desarrollar OA de rodilla, y se reconoce
que una combinación de factores genéticos y medio ambientales están involucrados en
la patogénesis y naturaleza de la OA,
a pesar de que la OA es una enfermedad
poligénica con una fuerte carga genética los genes involucrados aun son desconocidos.
Este trabajo está enfocado en la identificación de marcadores que podrían predecir el
curso de la enfermedad, siendo uno de los primeros estudios que se realiza en
población mexicana donde todavía no se conoce la frecuencia de los polimorfismos.
Los resultados de estudios previos son controversiales, ya que algunos autores
no encuentran asociación (8,9) y otros reportan asociaciones con OA y el gen COL2A1
(10).
En este estudio al analizar los polimorfismos del gen de la COL2A1 se observó
que la presencia del polimorfismo “p” independiente que se haya determinado “Pp” o
“pp”, confiere un mayor riesgo (OR = 1.75) en comparación con la ausencia del sitio
“PP”. Al analizar por separado los polimorfismos, el homocigoto para el sitio (pp) o la
ausencia (PP) no confieren asociación, pero la forma heterecigota “Pp” muestra que
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. puede ser un factor de riesgo con una OR de 1.85, lo cual indica que existe una
probabilidad de casi 2 veces de desarrollar OA de rodilla. Eso debe indicar que la
asociación de OA de rodilla con el genotipo Pp en los casos es debido a una función
particular de la variante del gen COL2A1. Nosotros creemos que en esta muestra la
relación del polimorfismo Pp con OA no está influenciada por variables que se
relacionan con su desarrollo como la edad e IMC y que estas variables se distribuyen
igual entre casos y controles.
El polimorfismo examinado esta localizado en secuencias intrònicas y
representan cambios en los nucleótidos que podrían tener un papel funcional. Existen
varias posibles explicaciones sobre como los polimorfismos de una secuencia no
codificante puede actuar. Estos podrían estar ligados a mutaciones exònicas causando
una variación en la secuencia
de aminoácidos, o podría estar ligado a elementos
reguladores que afectan los niveles de expresión
a través de la regulación
transcripcional. Finalmente el polimorfismo podría dar origen a un nuevo sitio de
procesamiento, reduciendo la cantidad de RNAm procesado correctamente (6).
BIBLIOGRAFÍA.
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Índice de Trabajos en Extenso
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. 4.-Hamerman. The Biology of osteoarthritis. The new England journal of medicine.
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5.-Prockop D J, Ala-Kokko L, Mclain D A, Can mutated genes cause common
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and related research. 2002;403:108-117.
7.-Priestley L, Fergusson C, Ogilvie D, Wordsworth P, Smith R, Pattrick M, Doherty M,
Sykes B: A limited association of generalized osteoarthritis with alleles at the type II
collagen locus: COL2A1, Br J Rheumatol 1991, 30: 272-275.
8.-Vikkula M, Nissila M, Hirvensala E, Nuotio P, Palotie A Aho K, Peltonen L: Multiallelic
polymorphism of the cartilage gene: no association with osteoarthrtis, Ann Rheum Dis
1993,52:762-764.
9.-Aerssens J, Dequeker J, Peeters J, Breemans S, Boonen S. Lack of association
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VDR, COL1A1, and
COL2A1 in postmenopausal women. Arthritis Rheum 1998;41:1946-1950.
10.-Meulenbelt I, Biykerk C, De Wildt SC, Miedema HS, Breedveld FC, Pols HA, et al.
analysis of three polymorphism of the COL2A1gene and association with generalized
radiological osteoarthritis. Ann Hum Genet.1999;63:393-400.
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