Download Trabajo de Investigación

Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
Trabajo de Investigación
Bacterias halofilas extremas deteriorantes en anchoita salada
Autores: Lic. en Biología Félix, Mónica María; , Med. Vet y Bacterióloga Ramirez, Elida Elvia;
Ing. Qca. Yeannes , María Isabel
RESUMEN
En anchoita ( Engraulis anchoita) salada-maduradas, que poseen una actividad de agua (aw)
de 0,75 a 0,80 se han encontrado bacterias halófilas . E l objetivo de este trabajo fue
determinar la potencial capacidad deteriorante de los grupos bacterianos encontrados. Se
realizaron estudios microbiológicos en 100 muestras de anchoíta salada-madurada. E l 71 % de
las colonias halladas fueron halófilas extremas y el 29 % estrictas. De acuerdo a sus
características bioquímicas se ha reconocido un 31% de Halococcus sp.; 15% de Haloferax
spp. 5% de Halobacterium spp. y 7% de Haloarcula spp., el resto se encuentra aún sin
identificar. De las bacterias halladas un 30% tienen actividad proteolítica, 30% lipolítica y 15%
proteolítica y lipolítica. La presencia de estas bacterias podría llevar a modificaciones
irreversibles y no deseables en distintas características sensoriales como olor, color y textura,
que limitarían la vida útil de estos productos. La importancia de esta limitación estará dada por
el número, las características de las mismas y las condiciones de almacenamiento del
producto.
Palabras clave: anchoíta- productos salados- aislamiento e identificación- bacteria halófilasdeterioro- vida útil.
ABSTRACT
In salting-ripening product of Engraulis anchoita , with water activity (aw) from 0.75 to 0.80,
halophilic bacteria were founded. The aim for this work was to determine the potential spoilage
capacity of bacteria found. Microbiology studies were carried out on 100 samples. 71 % of
strains found were extremely halophilic bacteria and 29 % was strict halophilic bacteria. In
accordance with microbiological characteristic were identifying 31% of Halococcus sp.; 15% of
Haloferax spp. 5% of Halobacterium spp. y 7% of Haloarcula spp . The 42% remain since was
not identified. On total bacteria found, 30% have lipolitic activity, 30 % proteolitic activity and
15% possess both, lipolitic and proteolitic activity. The presence of these microorganisms can
cause irreversible and undesirable changes on sensory characteristics that color, smell and
texture. This activity will be limit shelf life of these products. The importance of this limitation will
be give for number, characteristic of these bacteria and storage condition of product.
Key words: anchoíta- productos salados- aislamiento e identificación- bacteria halófilasdeterioro- vida útil.
Recibido: 16/05/2007
Aceptado:
10/10/2007
Introducción:
La anchoita (Engraulis anchoita) es la especie de pescado menos explotada del Atlántico
Sudoccidental (SAGPyA, 2005). Más del 90% de su captura se destina a la elaboración del
producto salado y madurado y el 95 % de ésta producción es exportada como producto
intermedio (“commodity”) prncipalmente a España, Italia y Marruecos. Este producto posee
valores de actividad de agua (aw) de 0,75 a 0,80 (Filsinger y Yeannes, 1994; Yeannes, 1996,
Yeannes, 2006). Estos valores sólo permiten una actividad microbiana reducida a grupos de
bacterias y hongos halófilos ya que el desarrollo de la flora deteriorante o patógena
potencialmente presente en éste producto marino no es posible (Huss,y Valdimarson, 1990).
ISSN 1668-1940
1
Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
En estos productos se han encontrado bacterias halófilas moderadas, estrictas y extremas
(Ramirez et al., 1997; Ramirez y col, 2000; Czerner y Yeannes, 2007).
Las bacterias, mohos y las levaduras halófilos son contaminantes naturales de la sal (Connell,
1990; Huss y Valdimarson, 1990, Felix, 2006). De acuerdo a la procedencia de la sal los
recuentos y especies en estos microorganismos podrán variar y su presencia tiene importancia
desde el punto de vista del proceso ya que pueden provocar deterioro y en algunos casos
toxicidad del producto final por formación de histamina (Paredi y Yeannes, 1987; Ramirez y
col., 1994; Hernandez Herrero et al., 1999).
Las etapas del proceso de salado y madurado de anchoíta ( Engraulis anchoita ) se presentan
en la Figura 1 (Yeannes, 1991; Yeannes, 1996). En la misma se puede observar que existe una
etapa de salado la que es realizada mediante deshidratación osmótica con salmuera
sobresaturada y el ejemplar entero, llegando a un equilibrio salino y una Aw (actividad de agua)
de 0,82- 0,87 (Yeannes, 1991, Yeannes, 2006). Posteriormente con el ejemplar descabezado y
eviscerado se realiza una nueva adición de sal en los tambores, intercalando con capas de
anchoíta en forma de “corona”, llegando el producto a otro equilibrio salino alcanzando valores
de 0,75 (Zugarramurdi y Lupìn, 1977; Yeannes, 1991, Yeannes, 2006). El producto es
prensado para acelerar el proceso e impedir el acceso de aire en el interior evitando la
rancidez, llegando luego de 6 a 8 meses, dependiendo de la temperatura, a la maduración .
Resulta importante determinar las características de las bacterias presentes y su efecto
sobre el producto salado- madurado de anchoíta ( Engraulis anchoita ), por lo que el
objetivo de este trabajo fue determinar la incidencia de estas bacterias en el
producto y la potencial capacidad deteriorante de los grupos bacterianos
encontrados.
Materiales y Métodos:
Muestreo
Se efectuaron tomas de muestras en saladeros de la ciudad de Mar del Plata, Argentina. Se
analizaron 100 muestras de Engraulis anchoita salada-madurada para la determinación de
bacterias halófilas extremas y estrictas. Las muestras que se tomaron corresponden a los 15
cm superiores de los barriles hacia el final de la maduración (Figura 1).
ELABORACION
DE FILETES
ISSN 1668-1940
2
Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
Figura 1. Diagrama de Flujo del proceso de salado y madurado de anchoíta ( Engraulis
anchoita )
Preparación de la muestra
Se tomaron 10 g de muestra y se cortaron estérilmente en trozos pequeños con cuchillo y se
colocaron en 90 ml de caldo sal estéril, homogenizando por agitación, (dilución 10 -1 ), se
realizaron diluciones hasta 10 -3 (ICMSF 1989). Se sembró 0,1 ml en superficie por triplicado y
se incubó a 37º C por el término de 12-14 días en medio Gibbons (Bergey, 1989).
Identificación y caracterización
Se realizó observando las características de las colonias, tomando en cuenta su capacidad de
producir pigmentos debido a la presencia de carotenoides (bacteriorrodopsinas y
bacteriorruberinas) ( Rodríguez Valera y Barraquero, 1982) . Se consideró resultado positivo la
aparición de colonias rosado-rojo.
La morfología celular se analizó por medio de la técnica de coloración de Gram, (Merck, 1994).
Se realizaron las siguientes pruebas: movilidad, oxidasa, ureasa, catalasa, indol, utilización de
citrato, reducción de nitrato, fermentación de hidratos de carbono, producción de ácido
sulfhídrico, hidrólisis de gelatina, decarboxilación de aminoácidos (lisina, ornitina, arginina) y
pruebas con agar hierro triple azúcar (Mc Faddin, 1980), hidrólisis de tween 80 (ICMSF, 1989) y
antibiograma (Daguet y Chabbert, 1977).
ISSN 1668-1940
3
Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
Se determinaron sus características proteolíticas y lipolíticas (F.I.L-I.D.F 73, 1974).
Mediante el análisis de halofilismo según (Bergey, 1989) realizado a concentraciones salinas
desde 0 hasta 20% de ClNa se determinó el tipo de bacteria hallada de acuerdo a sus
requerimientos de sal.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
S e determinó que el 71% de las colonias halladas fueron halófilas extremas (3,0- 5,0 M ; 1830% ClNa) y 29 % halófilas estrictas (1,5- 4,0 M ; 9-24% ClNa). Estos resultados corroboran los
obtenidos con esta misma especie, previamente por Ramirez y col. (1997) y actualmente por
Czerner y Yeannes (2007); son similares a los obtenidos por Hernández-Herrero y col (1999)
en Engraulis encrasicholus y por Vilhelmsson y col. (1997) en Clupea harengus.
El proceso de salazón y maduración implica una proteólisis y las bacterias extremadamente
halófilas que son la flora predominante al final del proceso de maduración, encuentran un
sustrato adecuado para su desarrollo . Estas bacterias pertenecen al Dominio Archaea junto
con otros microorganismos extremófilos. Taxonómicamente están incluidas en el Orden
Halobacteriales que comprende una sola familia Halobacteriaceae, con varios géneros
(Kamekura y col., 1997; Ventosa, et al., 1999). Se desarrollan en los medios lentamente a
diferencia de la mayoría de las bacterias y forman colonias de color naranja a rojo debido a los
carotenoides que protegen a las células de los efectos de la luz, dando en el producto y la
salmuera circundante una típica coloración rojiza, que les ha valido la denominación de
“bacterias halofílicas rojas ” (Huss y Valdimarson, 1997; Ramirez y col., 1997; Ramirez y col.,
2000).
De acuerdo a la metodología utilizada se reconoció un 31% de Halococcus sp.; 15% de
Haloferax spp, 5% de Halobacterium spp y 7% de Haloárcula spp, quedando hasta el momento
sin determinar el porcentaje restante.
Se determinó que un 30% de las bacterias halladas tienen actividad proteolítica, un 30%
actividad lipolítica y un 15% capacidad proteolítica y lipolítica. La capacidad proteolítica de las
mismas se sumaría a la proteólisis natural de estos productos acelerando el fin de su vida útil.
Se ha determinado sensorialmente que la presencia de las mismas en recuentos que superan
el 10 5 UFC/g determina en el producto un fuerte olor a putrefacción (sulfhidrico- amoniacal)
(Gram y Huss, 1996).
Asimismo la capacidad lipolítica colaboraría con el aumento de los ácidos grasos y la rancidez
dado que este producto de acuerdo a su Aw se encuentra en un rango de gran actividad
oxidante.
. La importancia de la limitación de la vida útil por estos grupos bacterianos estará dada por el
número, las características de las mismas y las condiciones de almacenamiento del producto.
Conclusiones
La presencia de estas bacterias lleva a modificaciones irreversibles y no deseables en las
características sensoriales: olor, color y textura, pudiendo limitar la vida útil de estos productos.
ISSN 1668-1940
4
Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
Bibliografía:
Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. 1989. Sec. 25 Archaeobacteria. Grupo III .
3:2171-2233.
Czerner, M.; Yeannes, M. I. 2007. Evolución de la microflora presente durante el madurado de
anchoita ( E. anchoita ) . XI Congreso Argentino de Ciencias y Tecnología de Alimentos y 2do
Simposio Internacional de Nuevas Tecnologías. Palais Rouge. Buenos Aires. Argentina. 12 al
14 de setiempbre de 2007.
Connell, J. J. 1990 . Quality deterioration and defects in products. En: Control of Fish Quality.
Fishing New Books. Tercera Edición. Londres.
Daguet, G. L. y Chabbert, Y. A .1977. Técnicas en Bacteriología III. Editorial JIMS. Barcelona.
Felix, M.; Ameztoy, I. y Yeannes, M. I. 2006 . Identificación de microorganismos presentes en
sal empleada para procesos de conservación de alimentos. VII Congreso. XXVI Reunión Anual
de la Sociedad de Biología de Rosario. 6 y 7 de diciembre. Rosario. Santa Fe. Argentina.
F.I.L. I.D.F . 73 (1974) . Determinación de microorganismos lipolíticos de la manteca .
Filsinger, B. E. y Yeanne s, M. I. 1994. Anchoíta ( Engraulis anchoíta ) de diferentes épocas
del año salada y madurada. Proceedings del VI Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología
de Alimentos. 1er. Encuentro de Técnicos de Alimentos del Cono Sur. 6 al 9 de abril. Bs. Aires.
Argentina . Pag: 344- 346..
Gram, L. y Huss, H. H. 1996. Microbiological spoilage of fish and fish products. International J.
of Food Microbiol . 33,121-137.
Hernández-Herrero, M. M.; Roig-Sagués, A.X.; Rodríguez-Jerez y Mora-Ventura, M. T.
1999 . Halotolerant and halophilic histamine-forming bacteria isolated during the ripening of
salted anchovies ( Engraulis esncrasicholus ). J. Food Protection , 62, 509-514.
Huss, H. H. y Valdimar son, G. 1990 . Microbiology of salted fish . Fish Tech News. Vol. 10.
N°1. Pg: 3-5.
ICMSF. 1983. Microorganismos de los Alimentos I. Técnicas de análisis microbiológicos. Ed.
Acribia. España.
IRAM. 1988 . Productos de la Industria Pesquera. Método para la determinación de
Microorganismos Halófilos Extremos. Norma 15.139
Kamekura , M.; Dyall-Smith, M. L.; Ventosa A. y Kates, M. (1997). Diversity of alkaliphilic
halobacteria: proposals for the transfer of Natronobacterium vacuolatum, Natronobacterium
magadii , and Natronobacterium pharaonis to the genus Halorubrum , Natrialba , and
Natronomonas gen. nov., respectively, as Halorubrum vacuolatum comb. nov., Natrialba
magadii comb. nov., and Natronomonas pharaonis com. nov., respectively. Int J Syst Bacteriol
47, 853-857.
Mc Faddin J. F. 1980. Pruebas bioquímicas para la identificación de Bacterias de importancia
clínica. Médica Panamericana. Buenos Aires.
Merck. 1994. .Manual de medios de cultivo .
Paredi, M. E. y Yeannes, M. I. 1987 . Histamina en Productos Pesqueros. Revista de Ciencias
Agrarias. Argentina. 8 (1-2):5-12 (1987).
ISSN 1668-1940
5
Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
Ramirez, E. E.; Ameztoy, I.; Yeannes, M. I. 1994 . Bacterias halófilas como formadoras de
histamina. Proceedings: VI Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 1er.
Encuentro de Técnicos de Alimentos del Cono Sur. 6 al 9 de abril. Centro Cultural San Martín.
Buenos Aires. Argentina.
Ramirez, E; Filsinger, B.; Yeannes, M. I. 1997. Evaluación microbiológica del proceso de
salado y madurado de anchoíta ( Engraulis anchoíta ). X Seminario Latinoamericano y del
Caribe de Ciencia y Tecnología de Alimentos. VII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología
de Alimentos. Costa Salguero. Buenos Aires.
Ramirez, E. E.; Yeannes, M. I.; Lupín, H. M. 2000. Incidencia de hongos halófilos en anchoíta
( Engraulis anchoita ) salada. VI Congreso latinoamericano de Microbiología de Alimentos. II
Simposio Argentino de Conservación de Alimentos. I Congreso Argentino de Microbiología de
Alimentos. Bs Aires, Argentina, 20-24/11.
Rodriguez Valera, F y Ruiz Berraquero, F (1982) Halobacterias. Investigación y Ciencia
39:94-102.
SAGPyA. 2005. Datos estadísticos de capturas de anchoíta ( Engraulis anchoita ). Disponible
en: www.sagpya.gov.ar
Ventosa A.; M. C.; Gutierrez; M.; Kamekura; Dyall-Smith, M. L. . (1999) . Proposal to
transfer Halococcus tukmenicus , H alobactrium trapanicum JCM 9743 and Strain GSL-11 to
Haloterrigena turkmenica gen.nov.,comb. Nov. Int. Journal of Systematic Bacteriology, 49: 131136.
Vilhelmsson, O.; Hafsteinsson, H. y Kristjaánsson, J.K. (1997 ). Extremely halotolerant
bacteria characterisitic of fully cured and dried cod. International J. Food Microbiol . 36, 163170.
Yeannes, M. I. 1991 . HACCP in Anchovy Salting and Marinating. FAO/DANIDA Expert
Consultation on Quality Assurance in The Fish Industry. Lyngby , Denmark , 26 August- 6
September 1991 .
Yeannes, M. I. 1996 . Implementing HACCP at fishery industry level in Argentina . Practical
Experience. Proceedings: Seminar on HACCP Implementation and Training for Developing
Countries Fishery Industries. FAO/DANIDA/NMFS- NOAA. Pascagoula , MS , USA . 28- 30
May. Doc. N° 10. 15 páginas.
Yeannes, M. I. 2006. Aspectos Científicos y Tecnológicos en Preservas de Productos
Pesqueros. Editado en CD por: Facultad de Ciencias Agrarias. .UCA. Centro de Altos Estudios
“Jorge Gándara”. ISBN: 987- 05- 1523- Octubre de 2006.
Zugarramurdi, A. y Lupín, H. 1977 . Estudio sobre el salado de anchoíta II. Dinámica del
Proceso . Rev. Latinoam. Ing. Quim. Quim. Apl. 7: 25-38.
ISSN 1668-1940
6