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¿IMITAN LAS CÉLULAS CANCERÍGENAS LA ESTRATEGIA DE LAS
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS PARA SER INMORTALES?
Investigadores principales:
Dra. Matilde Ester Lleonart Pajarín
Hospital Universitari Vall d’Hebron
Dr. Zhao-Qi Wang
Internacional Agency for Research on Cancer, Lyon
Dr. David Hugh Beach
Oncology Laboratory at the WIBR, UCL, London
Duración:3 años
1. Resumen
Las células embrionarias poseen un genoma normal en contraposición con las
células cancerígenas, que poseen un genoma con múltiples mutaciones. Sin
embargo, ambas crecen indefinidamente y son, por tanto, inmortales.
Objetivo
La finalidad de este proyecto es investigar si los genes expresados por las
células madre embrionarias son capaces de burlar la senescencia en células
primarias (por ejemplo, MEF). Dado el similar comportamiento en términos
de inmortalidad de las células madre embrionarias y las células cancerígenas,
hipotetizamos que genes expresados por células madre embrionarias
pudiesen desempeñar un papel importante en procesos proliferativos como el
cáncer.
Genes característicos de células madre se descubrirán al llevar a cabo una
búsqueda genética, de los cuales determinaremos si poseen un papel
relevante en tumores humanos. Este proyecto posee importantes aplicaciones
en cáncer que podrán abrir el campo a nuevas aplicaciones en terapia génica.
Metodología
Células primarias MEF se infectarán con una biblioteca de cDNA procedente
de células embrionarias murinas. Para ello emplearán los vectores
retrovirales MaRx. Tras la infección, las células MEF se sembrarán a baja
densidad y los clones proliferativos emergerán a las 3-4 semanas. Los clones
se aislarán, se extraerá el DNA, RNA y se amplificará por PCR el fragmento
clonado. Dicho cDNA se clonará en vectores retrovirales, con los cuales
infectaremos a su vez células primarias y de tal modo procederemos a su
completa caracterización.
Resultados esperables
Nuevos genes serán identificados y exhaustivamente caracterizados. Dicha
caracterización revelará futuras herramientas moleculares para tratar y
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combatir el cáncer mediante la inhibición de las posibles proteínas
oncogénicas resultantes.
2. Resultados
Células madre embrionarias son células inmortalizadas cuya tasa proliferativa
es comparable a las células carcinogénicas. Por tanto, hemos estudiado la
expresión de genes característicos de células madre embrionarias, en células
primarias. Con este propósito se ha llevado a cabo una búsqueda genética
infectando células MEF con una biblioteca de cDNA de células madre
embrionarias. Esto ha dado lugar a la identificación y caracterización de
varios genes. Uno de ellos, la proteína ribosomal Rplp1, pertenece al tipo de
proteínas ribosomales del grupo P. Nuestros resultados han mostrado que
Rplp1 incrementa tanto la expresión del promotor de E2F como la expresión
de su principal diana, la ciclina E, en MEF. Por tanto, nuestro estudio ha sido
pionero en demostrar que la sobreexpresión de una única proteína ribosomal,
Rplp1, es causa y no consecuencia de inmortalización celular. Además, la
coexpresión de Rplp1 con un mutante del gen rasVal12, contribuye a la
transformación en células NIH3T3 tal y como hemos comprobado por la
aparición de colonias en soft agar. Es importante observar que la expresión
de Rplp1 aumenta en diferentes líneas celulares (MEF, NIH3T3) tras la
expresión de un mutante negativo del gen p53 (p53R175H). Por tanto, la
mutación de p53 puede facilitar la inmortalización in vitro mediante la
inducción de Rplp1. Es interesante el hecho de que Rplp1 en mRNA y proteína
están sobreexpresados en diferentes tipos de tumores humanos, un
descubrimiento que puede abrir nuevos campos terapéuticos en cáncer.
Hemos de resaltar que la expresión de las proteínas P –que aparte de Rplp1
incluye Rplp0 y Rplp2– pueden ser un indicador pronóstico clave en subtipos
histológicos específicos de tumores ginecológicos.
Otro gen identificado por su habilidad de burlar la senescencia replicativa en
MEF es CIRP. Hemos demostrado que la sobreexpresión de CIRP aumenta la
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fosforilación de ERK1/2 y el tratamiento con un inhibidor de MEK disminuye la
proliferación celular causada por la sobreexpresión de CIRP. En
contraposición, la inhibición de CIRP mediante RNAi disminuye la proliferación
celular, implicando la inhibición de P-ERK1/2. Nuestras investigaciones son la
primera evidencia de que la activación de P-ERK1/2 –un mecanismo que se
activa con la sobreexpresión de un mutante del gen rasVal12 para inducir
senescencia prematura– es capaz de burlar la senescencia replicativa.
Nuestras investigaciones muestran además que CIRP funciona estimulando la
síntesis general de proteínas, aumentando los niveles de fosforilación de S6 y
4E-BP1 y resultando un efecto global de la sobreexpresión de CIRP en MEF,
que se traduce en un incremento de la actividad quinasa de los complejos
ciclinaD1-cdk4. Es de gran interés que CIRP se sobreexpresa en RNA y
proteína en diversos tumores humanos, un descubrimiento con perspectivas
en cuanto a aplicabilidad clínica.
Por otro lado, con la idea de descubrir nuevos genes supresores de tumor,
hemos llevado a cabo una búsqueda genética para estudiar los genes cuya
pérdida de función provoca inmortalización. El estudio se ha enfocado a la
caracterización exhaustiva de SAHH (S-adenosylhomocysteine hydrolase). La
inactivación de SAHH confiere resistencia a la parada inducida tanto por p53
como por p16INK4A. Además, hemos demostrado que la inactivación de SAHH
inhibe la actividad transcripcional e impide la activación del gen supresor de
tumor p21Cip1 tras el tratamiento con agentes que dañan el DNA. Dado que la
inhibición de SAHH modula senescencia en células primarias, también
estudiamos la expresión de SAHH en tumores humanos. La expresión del
mRNA de SAHH se pierde en un 50% de los tipos de tumores de un total de
206 pacientes con los cánceres más frecuentes (colon, mama, pulmón, riñón,
etc.). Además, en otros pacientes la proteína SAHH aparece sobreexpresada;
lo cual puede indicar dos tipos diferentes de regulación para este potencial
gen supresor de tumor.
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Por otro lado, la sobreexpresión de rasG12V en células primarias induce
senescencia prematura (senescencia inducida por oncogenes). Basados en
este tipo de senescencia, hemos sobreexpresado en células mamarias
humanas –parcialmente inmortalizadas– una biblioteca de microRNA y de
RNAi (RNA interferentes) para identificar mediadores de la senescencia
inducida por rasG12V. Hemos descubierto que la inhibición únicamente del gen
supresor p21Cip1 burla la senescencia inducida por rasG12V. Además hemos
identificado un total de 28 microRNA que producen el mismo efecto, de entre
los cuales hay una gran mayoría que pertenecen a la familia del 106b. De
forma evidente hemos demostrado que la mayoría de estos 28 microRNA son
capaces de burlar la senescencia inducida por oncogenes debido a la
inhibición, indirecta en la mayoría de los casos, de p21Cip1. Nuestros datos
establecen un papel clave para p21Cip1 como inhibidor del ciclo celular en la
proliferación celular en el modelo celular de HMEC (Human mamalian
epithelial cells) y extendemos el repertorio de microRNA que modulan la
actividad de este gen supresor de tumor.
3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados
finales obtenidos
Mediante el uso de sistemas genéticos complejos que incluyen el diseño y uso
de bibliotecas de cDNA, hemos caracterizado varios genes implicados en
senescencia/inmortalización cuyo papel es clave en cánceres humanos:
Rplp1, CIRP, SAHH. Hemos descubierto que la sobreexpresión de Rplp1 y
CIRP burla la senescencia replicativa en células primarias, provocando
inmortalización celular. Estas proteínas se comportan como proteínas
oncogénicas (Artero-Castro et al., 2009a; Artero-Castro et al., 2009b). Por el
contrario, dado que la inhibición de SAHH provoca inmortalización, SAHH es
un posible gen supresor de tumor (Leal et al., 2008).
Por otro lado, hemos descubierto un total de 28 microRNA que burlan la
senescencia inducida por rasVal12; un efecto que ocurre a través de la
inhibición del gen supresor p21Cip1 (Lleonart et al., 2010).
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Con este proyecto hemos demostrado que la inhibición de CIRP reduce la
proliferación de las células cancerígenas tales como las HeLa y TERA2.
Nuestros resultados han sido recientemente corroborados por Zeng (Zeng et
al., 2009), que ha demostrado que la inhibición de CIRP en líneas celulares
de próstata no sólo impide la supervivencia celular, sino que sensibiliza las
células al tratamiento de agentes quimioterápicos como el cisplatino y la
adriamicina. La posibilidad de que la inhibición de CIRP –una proteína que se
activa en respuesta a estrés y en condiciones de hipoxia– pueda causar in
vivo la reversibilidad tumoral es un reto a alcanzar próximamente en
tratamientos anticáncer.
Por último, Rplp1 se ha revelado igualmente como una proteína oncogénica y
al igual que CIRP se ha observado sobreexpresado en cánceres humanos
tanto en RNA como proteína. Por tanto, la mayor relevancia de nuestros
resultados radica en que la modulación farmacológica de CIRP, Rplp1, SAHH
y/o los 28 microRNA descubiertos puedan representar una nueva estrategia
terapéutica contra el cáncer como recientemente hemos propuesto para
alguno de ellos Lleonart ME, 2009). Nuestra finalidad ahora es diseñar
compuestos químicos que inactiven CIRP, Rplp1 o los microRNA con mayor
potencial oncogénico, lo cual representa un reto en el futuro a medio/largo
plazo. Ya que muchos de los microRNA descubiertos se han asociado a
procesos inflamatorios y metástasis, su inactivación mediante moléculas antimiR representa un campo de perspectivas innovadoras y un reto a seguir en
biología, medicina y terapia en el futuro.
4. Publicaciones
1. A Artero-Castro, J Castellvi, A García, J Hernández, S Ramón y Cajal and
ME Lleonart.
Expression of the ribosomal proteins Rplp0, Rplp1 and Rplp2 in gynecological
tumors Human Pathology ((segunda revisión).
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2. Lleonart ME, Borgoff V, Bishop C, Fessart D, Bergin A-M, Beach DH.
Multiple microRNAs bypass ras-induced senescence.
Oncogene, 2010, 25 Jan.
3. Lleonart ME.
Cold-inducible RNA binding proteins: A new generation of proto-oncogenes.
BBA Rev Cancer, 2010, 1805: 43-52.
4. L López, G Armengol, B Pons, E Argelaguet, ME Lleonart, J Hernández, I
Torres, S Ramon y Cajal.
Regulation of replicative and stress-induced senescence by RSK4, which is
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mediating pathways.
Clinical Cancer Research, 2009, 15(14):4546-53.
5. Artero-Castrob A, Kondoh H, P Fernández-Marcos, Serrano M, Ramón y
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Rplp1 bypasses replicative senescence and contributes to transformation.
Experimental Cell Research, 2009, 315(8):1372-83.
6. Artero-Castroa A, FB Callejas, J Castellvi, H Kondoh, A Carnero, PJ
Fernández-Marcos, M Serrano, S Ramón y Cajal and ME Lleonart.
CIRP modulates life-span in primary MEFs.
Molecular and Cellular Biology, 2009, 29(7):1855-68.
7. Lleonart ME, Artero-Castro A, Kondoh H.
Senescence induction; a possible cancer therapy.
Molecular Cancer. 2009, 8;8(1):3.
8. H Kondoh, ME Lleonart, Y. Nakashima, T. Maruyama, M. Yokode, M.
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M.E., Castellvi J, Ruiz L, Ramon y Cajal S, Carnero A.
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Protection from oxidative stress by enhanced glycolisis, a possible mechanism
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Histology & Histopathology, 2007 Vol. 22(1): 85-90.
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