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Investigación clínica de transplante de neuronas derivadas y diferenciadas de células
madre neurales en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Parte I.- Enfermedad de Parkinson
Dr. Michel Levesque. Universidad de California Los Ángeles y Neurogeneration
Laboratories. Los Angeles C A
Dr. Francisco Velasco Campos. Hospital Ángeles del Pedregal, México, D. F.
Correspondencia:
Dr. Francisco Velasco Campos
Torre de Especialidades Quirúrgicas
Consultorio 780
Periférico Sur 3707
México, D. F. 10700
Tel: 5652 8661
Fax: 5135 3630
E-mail : slanfe@prodigy.net.mx
I.- Resumen: Patrocinador y Estudio
Título del Proyecto
Patrocinador
Productos de Investigación
Propósito y plan de Investigación
II.- Descripción del Estudio
Clasificación del estudio
Duración del estudio
III.- Antecedentes
Publicaciones de estudios Clínicos
A: Enfermedad de Parkinson y transplantes intracerebrales
B: Neuronas fetales dopaminérgicas
C: Transplantes autólogos de médula suprarrenal
D: Conclusión
Publicaciones de Estudios Clínicos Recientes
(Véase anexo I)
Estudios Preclínicos
Células madre del sistema nervioso central (SNC) del hombre
Propagación de células madre humanas in Vitro
Diferenciación de células madre del SNC en neuronas dopaminérgicas in
Vitro
Transplante de células madre del SNC humano
Nuestros estudios preclínicos
Conclusión de nuestros estudios preclínicos
Bibliografía
IV.- Objetivos del Estudio
Objetivo
Visión del Estudio
Nombre y propuesta del uso de las células diferenciadas
V.- Protocolo de Investigación
1. Criterios de inclusión
Diagnostico de Enfermedad de Parkinson (EP) que incluye al menos 2
de los siguientes síntomas:
Temblor postural o de reposo
Rigidez con rueda dentada
Bradicinesia
Reflejos posturales anormales
Respuesta al tratamiento con L-DOPA exógena con mejoría de al menos
33% de la severidad de los síntomas
2. Criterios de Exclusión
Parkinsonismo secundario a trauma, infección, tumor cerebral, enfermedad
cerebro vascular, fármacos o toxinas.
Falta de respuesta a L-DOPA a lo largo de la historia de la EP
3. Riesgo cardiovascular > II para cirugías
Otras enfermedades neurológicas
Embarazo
Criterios de Eliminación
B. Protocolo de Estudio
1.- Selección de pacientes
2.- Evaluación pre transplante
3.- Toma de biopsia de las células madre antólogas
4.- Procedimiento de microtransplante
5.- Seguimiento y estudio post operatorios.
C. Clinimetría
1.- Base de datos de las evaluaciones.
D. Evaluación Estadística
VI.- Manual del Investigador
A. Resumen
1.- Antes de transplantarse las células deben ser evaluadas para:
B. Procedimiento Básico: aislamiento de células madre humanas, propagación y
diferenciación
1.- Aislamiento de Células Madre Adultas Antólogas (CMAA)
2.- Preservación y multiplicación de CMAA
3.- Inducción de diferenciación de las células madre en neuronas
dopaminérgicas
C. Manejo del Tejido Humano y las células
D. Caracterización del Producto
1.- Seguridad
2.- Identidad y Pureza del Tejido
3.- Potencial
4.- Estabilidad
E. Pruebas Finales, Especificaciones y Certificación del Producto
1.- Células
2.- Esterilidad del transplante
Patrocinador del Estudio
Dr. Michel Levesque
8670 Wilshire Blvd. Suite 201
Los Angeles, California, 90211
Producto a Investigar
Este estudio investiga el uso de transplantes autólogos de células derivadas de
células madre neurales en el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson (EP)
Alcance del plan de investigación
El estudio incluye 48 pacientes
Descripción del Estudio
A.- Clasificación: Es un estudio de investigación clínica prospectiva, Fase I/IIa,
para evaluar la seguridad y eficacia de transplante autólogo de células dopaminérgicas
diferenciadas de células madre neurales humanas, colocadas estereotáxicamente en
estructuras estriatales de pacientes que sufren de enfermedad de Parkinson.
La eficacia clínica será evaluada por neurólogos expertos en movimientos
involuntarios a través de mediciones de puntaje motor validadas y estandarizadas. El
estado funcional del metabolismo será evaluado a través de estudios de imagen
utilizando Tomografía de Emisión de Positrones con inyección de (18 f) DOPA.
B.- Duración del Estudio: Se estima que el estudio se realice en 24 meses y
podría continuarse si los objetivos del estudio se alcanzan en esos pacientes.
Antecedentes:
En términos generales, el transplante neural incluye tomar una muestra de tejido
nervioso (las células) de un sitio del donador donde normalmente se localizan y
colocarlas en cualquier sitio del cerebro del huésped, directamente o después de
manipulaciones in Vitro. Recientemente, el transplante de células al sistema nerviosos
se ha convertido en una realidad. Menos de un siglo ha pasado desde el primer
experimento de transplantar tejido al sistema nervioso central (SNC) en animales. Más
de 1000 pacientes en los Estados Unidos y 2000 pacientes en todo el mundo han sido
transplantados con diferentes tejidos neurales, incluyendo glándula adrenal y
fragmentos de tejido cerebral de fetos humanos. Abundante información sobre las
implicaciones terapéuticas de transplantes al SNC ha sido publicada.
Recientemente células madre del SNC se han descubierto y caracterizado. Células
madre pluripotenciales del SNC y sus derivados (neuronas diferenciadas y células
gliales) representan una población ideal para terapias celulares. El desarrollo de técnicas
para diferenciar células madre del SNC en neuronas de tipos específicos, abrirán nuevas
perspectivas para la terapia de células transplantadas para una variedad de
enfermedades del SNC, que incluye la EP
A: Estudios Clínicos Publicados
1.- EP y Transplante Intracerebral.
La EP es una enfermedad degenerativa caracterizada por una perdida importante
de células en la substantia nigra. La perdida de células dopaminérgicas en la substantia
nigra da como resultado una degeneración del sistema dopaminérgico nigroestriatal que
regula la función motora. A su vez esto ocasiona trastornos motores que consisten en
lentificación de movimientos voluntarios, temblor, congelamiento de la marcha, e
inestabilidad postural. A la fecha no hay tratamiento curativo para la EP.
El conocimiento moderno de la patogénesis de la EP indica que una restauración
funcional exitosa de estos pacientes puede lograrse reponiendo la molécula de
dopamina en las áreas donde esta disminuida o ausente por daño del tejido cerebral.
Este concepto ha sido la base de los intentos de reponer dopamina donde es necesario, a
través de transplantar células productoras de dopamina en el estriado (núcleo caudado o
putamen) que esta degenerado. Los transplantes han sido de tejido fetal rico en
neuronas dopaminérgicas, como el mesencéfalo ventromedial, médula de glándula
suprarrenal y neuronas dopaminérgicas de cerebros de cerdo. La habilidad de los
transplantes intracerebrales para inducir recuperación de la función de los cerebros
dañados que reciben el transplante, radica en una multitud de mecanismos tróficos,
neurohumorales y sinápticos que pueden permitir al tejido transplantado promover la
restauración de la función en el cerebro enfermo.
Los transplantes ejercen su efecto de varias maneras:
a. secreción de factores troficos o migración de elementos transplantados al
cerebro huésped.
b. difusión del neurotransmisor liberado por el injerto.
c. regeneración de elementos neurales (espinas dendriticas por ejemplo) en el
cerebro huésped.
d. establecimiento de conexiones reciprocas entre el injerto y el huésped.
e. integración anatómica en el circuito neural donde se ha colocado el injerto.
Aún no se ha determinado hasta donde los implantes intracerebrales pueden
integrarse funcionalmente al cerebro del huésped, particularmente en el hombre y es
sujeto de numerosas investigaciones clínicas. La probabilidad de una integración
extensa pudiera ser mayor para pequeños injertos o células neurales en suspensión. La
reinervación de esos injertos pequeños y sólidos puede depender de una disponibilidad
inmediata de vascularización o contacto con líquido cefalorraquídeo. Hay evidencia de
que los injertos pueden revascularizarse muy rápidamente, tal vez en término de horas,
especialmente las células en suspensión (Leigh y Cols, 1994).
2.- Neuronas dopaminérgicas provenientes de fetos.
Hay evidencia clínica que muestra que las neuronas dopaminérgicas obtenidas del
mesencéfalo ventral de fetos humanos pueden sobrevivir y funcionar cuando son
transplantadas a pacientes con EP. Desafortunadamente, la recuperación funcional de
los pacientes transplantados ha sido solo parcial y la eficiencia y reproducibilidad de los
resultados no ha sido consistente.
Las primeras publicaciones de transplante de neuronas dopaminérgicas fetales
fueron muy alentadoras. Un estudio de Inglaterra en el que 12 pacientes fueron
transplantados con tejido fetal de un solo donador al núcleo caudado (Hitchcock y Cols,
1989), mostró mejoría de los pacientes a partir de la primera semana; la dosis de LDOPA se redujo en 29% en los primeros 3 meses y 24% en los siguientes 3 meses. El
seguimiento de 9 pacientes mostró 29% de mejoría en la escala de evaluación de
Webster a los 3 meses y 42% a los 6 meses. Otras publicaciones mostraron mejoría
similar (Fredd et al, 1989).
Al final de la década de 1980, cuando los transplantes con tejido humano se
iniciaron, se estimó que más de 500 paciente con EP habían sido transplantados con
tejido fetal. Se han publicado los resultados de 2 series de transplante fetal, realizados
en los Estados Unidos. Fredd y Cols evaluaron 7 pacientes, seguidos por periodos de 12
a 46 meses después de transplantes fetales mesencefálicos (Freed y Cols., 1998). Dos de
esos pacientes tenían transplantes unilaterales en el núcleo caudado y el putamen y 5
tenían transplantes bilaterales solamente en el putamen. Se observo una mejoría
moderada en los pacientes y la dosis de L-DOPA se pudo disminuir substancialmente.
La mejoría fue independiente de usar o no inmunosupresores. En la otra serie (Spencer
y Cols, 1992), la mejoría fue modesta. Los resultados menos impresionantes en ésta
serie podrían deberse a una criopresentación del tejido fetal transplantado y que este
provenía de fetos de mayor edad. Una conclusión importante de estos estudios fue que
el transplante de tejido fetal mesencefálico rico en dopamina podría inducir una mejoría
terapéutica significativa y persistente de la función en los pacientes con EP (Lang y
Lozano, 1998).
La limitación de los transplantes de células fetales es de índole práctica y ética
relacionada con la obtención y preservación de tejido fetal proveniente de humanos. El
gran número de neuronas dopaminérgicas de fetos que son necesarias para obtener
efectos terapéuticos restringe las indicaciones de técnicas de transplante fetal a centros
médicos muy especializados. Con la técnica actual de transplante se estima que entre 5
y 20% de las neuronas transplantadas sobrevive. Por lo tanto, células de 3 a 5 fetos
proveen finalmente solo 100,000 a 150,000 neuronas dopaminérgicas sobrevivientes
(Lindvall 1997).
Los experimentos en animales han mostrado una disminución en la muerte celular
inducida por recuperadores de radicales libres y factores neurotróficos pueden aumentar
2-3 veces la sobrevida de las neuronas dopaminérgicas (Sinclair y Cols, 1996, Zawada y
Cols, 1998, Schierle y Cols, 1999). La utilización de estas substancias en los protocolos
clínicos en humanos, podrían aumentar el número de neuronas de transplante que
sobrevivan y por lo tanto disminuir el número de células que se deben transplantar para
tener efectos terapéuticos adecuados. La investigación actual se enfoca en desarrollar
técnicas que mejoran la sobrevida y crecimiento de neuronas dopaminérgicas
transplantadas.
3.- Injertos antólogos de células de médula suprarrenal.
Blacklund y su grupo de Estocolmo iniciaron el transplante intracerebral en
humanos, basados en experimentos de grupo de investigación en Lund, Suecia. En sus
experimentos, suspensiones de células se colocaban estereotáxicamente en el núcleo
caudado. Aunque los resultados no fueron espectaculares, probablemente porque los
injertos contenían solamente neuronas sin células gliales asociadas, abrieron el camino
para otras investigaciones
Ignacio Madrazo y sus colaborador en ciencias básicas Drucker Colin, publicaron
una serie de 54 pacientes con EP quienes mejoraron significativamente de sus síntomas
algunos meses después que fueron transplantados con médula suprarrenal autóloga en
el núcleo caudado derecho, en un abordaje transventricular (Madrazo y Cols, 1987). El
éxito de ésta operación aparentemente fue el haber transplantado fragmentos de médula
suprarrenal y posteriormente injertos fetales en la superficie del núcleo caudado en
contacto con el líquido cefalorraquídeo ventricular, que mantenía viable el tejido
implantado hasta que se establecía la neovascularización. Allen y Cols en la
Universidad de Vanderbilt y Jiao y Cols en Beijín publicaron series de pacientes con
EP avanzada que mejoraron con transplante antólogo semejante al descrito por
Madrazo.
4.- Conclusiones
El transplante de células secretoras de dopamina al estriado de pacientes con EP
es una operación de tratamiento de la EP. Las fuentes de células que han sido utilizadas
tienen varios problemas críticos que incluyen: Sobrevida de las células dopaminérgicas
transplantadas, rechazo inmunológico, posible vector de transmisión de enfermedades y
restricciones éticas. Para hacer del transplante un tratamiento viable se requiere la
obtención de células de una fuente que no represente los problemas antes mencionados.
Células madre del SNC podrían ser una fuente para diferentes tipos de neurona que
pudieran necesitarse para el transplante intracerebral.
B.- Estudio Clínico Publicado (véase anexo)
El grupo del Dr. Levesque en el Centro Médico “Cedars-Sinai” de Los Angeles
California, iniciaron la investigación de obtener células madre neuronales de los
mismos pacientes a través de una craneotomía, lográndose aislar exitosamente esas
células de los pacientes con EP. Estas células se multiplicaron en cultivos in Vitro y
posteriormente se lograron diferenciar como neuronas secretoras de dopamina.
El Comité Institucional del Centro Médico “Cedars-Sinai” aprobó el estudio
inicial como Fase I (Apéndice B), así como el llevar a cabo el transplante autólogo de
células madre diferenciadas como neuronas dopaminérgicas en el tratamiento de un
paciente con EP en 1999. la FDA (Food and Drug Administration) aprobó un estudio
Fase II, dependiendo de la implementación de contar con facilidades para procesar las
células madre obtenidas del cerebro de los pacientes a quienes se va a transplantar, con
las medidas de seguridad necesarias. Actualmente existe un laboratorio contratado en
California USA para procesar las muestras de tejido.
C.- Estudios Preclínicos.
1.- Células madre del SNC.
Una fuente renovable de células madre humana facilitaría significativamente
estudios clínicos básicos para trasplantes al cerebro. Lo más importante es que el uso de
esas células podría virtualmente eliminar la necesidad del uso de tejido proveniente de
embriones humanos, en tratamientos encaminados a restaurar la función neurológica
mediante transplantes intracerebrales de células neuronales. El mayor obstáculo para el
desarrollo de estudios de transplantes neuronales del laboratorio al área clínica es el
origen del tejido a transplantar. Además de los aspectos morales y éticos que hay en
relación a la obtención de tejido fetal humano, otras limitaciones como la edad de
desarrollo del embrión, su almacenamiento, viabilidad y posible contaminación
bacteriana ó viral deben mantenerse rigurosamente controlados, lo que hace
prácticamente imposible una cirugía electiva. A mayor abundamiento, se necesitan
varios fetos par conformar tejido para un solo transplante, con lo que se agrega el
problema de transplantes heterogéneos del tejido donado y aumenta la posibilidad de
rechazo inmunológico o contaminación. Por esta razón, se han buscado fuentes alternas
de tejido de donador.
En el aislamiento de células madre putativas de tejido embrionario (Davis y
Temple, 1994) y de roedores adultos (Reynolds y Weiss, 1992, Lois y Alvarez Buylla,
1993, Gritti y Cols 1996, Suhonen y Cols, 1996), se ha logrado con el uso de factores de
crecimiento administrados junto con las células transplantadas. De esta manera las
células mare del SNC se renuevan multiplicándose y tiene el potencial de diferenciarse
en diferentes formas de células neurales. Así, a través de un grupo relativamente
reducido de células se pueden obtener un número ilimitado de neuronas en el
laboratorio.
Células madre del SNC han sido aisladas tanto de cerebro de embriones como de
adultos humanos (Svendesen y Cols1997, Chalmers-Redman y Cols, 1997, Vescovi y
Cols, 1999, Kukekov y Cols, 1999). Estas células sobreviven cuando son transplantadas
a cerebro de roedores y se diferencian en neuronas y células gliales sin formación de
tumores subsecuentes (Svendsen y Cols 1997, Vescovi y Cols 1998, Fricker y Cols
1999). Células madre del SNC humano mantienen una estabilidad funcional
sorprendente en cuanto a sus características de crecimiento, dependencia de factores de
crecimiento y potencial para mantener su diferenciación necesaria que permanece sin
cambios después de varios subcultivos (Vescovi y Cols, 1999, Fricker y Cols 1999,
Carpenter y Cols 1999). Mas aún, la expresión de antígenos neurales tardíos, tales como
proteínas del neuro-filamento y el desarrollo de propiedades electrofisiológicas
características muestran que aún las células procesadas pro células madre, que han
permanecido en cultivo por mucho tiempo, alcanzan una maduración neuronal
completa. Las células madre y las neuronas diferenciadas que provienen de ellas
representan una oportunidad única de control de algunos parámetros críticos en los
transplantes terapéuticos.
2.- Propagación de células Madre Humanas in Vitro.
En los roedores, células madre del SNC se encuentran en diferentes sitios del
tejido nervioso (Palmer et al 1999), que incluyen áreas donde no hay neurogénesis
detectable, tales como el nervio óptico y medula espinal. En el hombre, la localización
de las células madre permanece en su mayoría desconocida. Las células madre fetales
se han aislado de diversas áreas incluyendo la médula espinal (Vascovi y Cols 1999,
Carpenter y Cols 1999), mientras que células madre en el cerebro adulto se han aislado
del hipocampo, áreas sub ependimarias y neo corteza (Kukekov y Cols, 1999 y
Levesque y Cols 2001). Las células madre continúan proliferando in Vitro en presencia
de factores de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y factor de crecimiento de la
epidermis. (EGF) (Svendsen y Cols 1997, Kukekov y Cols, 1999, Vescovi y Cols,
1999) o factor inhibidor de leucemia (LIF) (Carpenter y Cols 1999, Ficker y Cols
1999). Varios laboratorios han cultivado células madre humanas in Vitro, sin cambios
aparentes en el crecimiento de las células y su potencial de diferenciación en periodos
prolongados de observación (Carpenter y Cols 1999, Vescovi y Cols, 1999). Estamos
conscientes que podrían ocurrir cambios genéticos en las células madre del SNC de
humanos, que alteren el crecimiento y diferenciación celular, como se ha reportado en
las células madre de roedores (Palmer y Cols 1997).
3.- Diferenciación de las células Madre del SNC en Neuronas Dopaminérgicas in
Vitro
Una de las grandes ventajas de utilizar células madre para los transplantes, es que
la diferenciación celular se puede programar y ajustar modificando las condiciones de
crecimiento. Desafortunadamente es poco lo que se sabe de los mecanismos
moleculares que median la diferenciación de las células madre en neuronas
dopaminérgicas. Una proporción muy pequeña de células madre humanas se diferencia
en neuronas dopaminérgicas (tirosina-hidroxilasa positivas ó TH +) después que se han
retirado del cultivo los factores de crecimiento a inicia la diferenciación. Srandson y
Cols (1997) reportan menos de 0.01% del total de neuronas se convierten en TH+ in
Vitro. El tratamiento de las células madre con una combinación de IL-1b, IL-11 y
GDNF (neurofactor de crecimiento derivado de células gliales) aumenta la velocidad de
formación de neuronas en el cultivo de células (Carpenter y Cols, 1999).
Los estudios de Levesque y Cols han mostrado que el tratamiento de células
madre del SNC humano crecen como “neuroesferas” en el cultivo y la adición de acido
retinoico, dibutiril cAMP, FGF8 y GDNF resulta en diferenciación celular hacía
neuronas dopaminérgicas. Sin tratamiento menos del 1% se diferencian en células TH+
y después del tratamiento 5-30% de las células fueron identificadas con TH+ (solicitud
de patente en trámite).
Se conoce mejor el procedo de diferenciación de las células dopaminérgicas de
las células madre del SNC en roedores. El desarrollo y la sobrevida de neuronas
dopaminérgicas de la substancia nigra dependen de la expresión del receptor Nurr 1 de
la hormona orphan nuclear en estas células. Una sobre expresión Nurr 1 en las células
madre estimula la diferenciación dopaminérgica cuando las células se exponen a un
medio acondicionado de glia (Wagner y Cols 1999).
Otros laboratorios han reportado el efecto del medio acondicionado de glia en la
diferenciación de las neuronas dopaminérgicas (Daadi y Weiss, 1999). El análisis del
desarrollo de neuronas mesencefálicas durante la embriogénesis ha mostrado que el
FGF8 es esencial para el desarrollo de las neuronas dopaminérgicas (Ye et al, 1998).
Desafortunadamente el tratamiento de las células madre con FGF8 (Factor de
Crecimiento derivado de Fibroblastos) no aumenta el número de células TH+ en los
cultivos. Fred Gage y Cols reportan la expansión de células precursoras en presencia de
bFGF que resulta en aumento de diferenciación hacía neuronas dopaminérgicas. De esa
forma los conglomerados de células en los cultivos de células del SNC humano
contienen hasta 18% de neuronas dopaminérgicas.
4.- Trasplante de células Madre del SNC humano.
Experimentos de transplante de células madre progenitoras humanas, han
mostrado una capacidad de mantenerse viables comparable a la del tejido fetal del
embrión de rata (Vescovi y Cols, 1999, Fricker y Cols. 1999). Transplante de células
madre del SNC no tratadas a un modelo experimental de rata con inyección de 6-OH
DOPA, mostraron que solo un número pequeño de neuronas dopaminérgicas se
desarrollan (Svendsen y Cols 1997). Las células transplantadas dieron la prueba de TH+
en menos del 0.01% y aún así el transplante disminuyó la conducta rotatoria inducida
por 6-OH DOPA en 2 de sus animales, cuyos cerebros contenían neuronas TH+ en el
estriado. Estos experimentos sugieren que las células madre del humano tienen la
posibilidad de diferenciarse en neuronas dopaminérgicas dentro del estriado. Podríamos
especular que el transplante de células madre indiferenciadas a los pacientes con EP
podrían resultar en desarrollo de neuronas dopaminérgicas y reducción de los síntomas,
sin embargo, el transplante de neuronas dopaminérgicas ya diferenciadas
probablemente dé mejores resultados.
5.- Nuestros estudios preclínicos.
Los estudios preclínicos que hemos realizado han demostrado que el cerebro
humano del adulto contiene células madre neuronales que pueden ser aisladas y
multiplicadas y diferenciarse in Vitro en neuronas secretoras de dopamina. Estas
neuronas productoras de dopamina sobreviven cuando son transplantadas al animal de
laboratorio y al estriado del humano, lo que las hace un candidato ideal para ser
utilizadas en el tratamiento y posible cura de la enfermedad de Parkinson (EP). A
continuación haremos una descripción detallada de los estudios pre-clínicos que
comprueban que, el uso de células madre neuronales, que se han diferenciado como
neuronas dopaminérgicas, pueden ser útiles para el tratamiento de la EP.
5.1 Aislamiento y cultivo de células madre multipotenciales del SNC del adulto.
Hemos aislado células madre neuronales de cerebros de 16 pacientes adultos: en
2 se aislaron de biopsias de la corteza pre frontal, 12 del hipocampo y 2 de la zona peri
ventricular. Un análisis más detallado se llevó a cabo comparando 3 de las muestras
extraídas del adulto con células madre aisladas de un feto de 21 semanas.
Las células madre del SNC fueron tomadas del hipocampo de 3 pacientes con epilepsia
sometidos a lobectomía temporal y de un feto de 21 semanas. Los especimenes fueron
obtenidos de acuerdo con un protocolo (Comité Institucional de Revisión de
Protocolos de Investigación (IRB) aprobados en el Centro Médico “Cedars-Sinai” de
Los Ángeles Calif. (IRB protocolo #2475 y 2565). Las células madre aisladas del
cerebro de adultos proliferaron in Vitro como “neuroesferas” (Fig. 1, A), expresando
NESTIN Y MUSASHI-1 mRNA (figura 1 B) que son marcadores característicos de las
células madre neurales (Lendahi y col. 1990, Sakakibara y cols, 1996). Las
características de crecimiento de las células madre hipocampales y de la corteza del
adulto fue similar con un tiempo para duplicarse de 4 días aproximadamente (figura 1
C). Las células crecen en presencia de factores de crecimiento básicos (FGF) Factor de
Crecimiento derivado de células Epiteliales(EGF) y Factor Inhibidor de Leucemia
(LIF) que son conocidos como factores de crecimiento para células madre neuronales.
En promedio, la variabilidad en ritmo de crecimiento fue de menos del 15%.
Figura 1 A. Células madre aisladas del SNC del adulto proliferando como neuroesferas.
B Expresión de nestin y musahi-1 mRNA. C. Curva de crecimiento de las células madre
fetales y del adulto.
Figura 2. Marcador celular específico con Inmunohistoquímica, después de
diferenciación de una célula madre del adulto. A Neurona beta-III tubulina positiva. B.
Astrocito positivo para la proteína ácida fibrilar glial. C Oligodendrocito positivo a
Galactocerebrosido.
Para examinar el desarrollo potencial de las células madre del SNC del adulto se
analizaron las expresiones a marcadores celulares específicos beta III tubulina, la
proteína acida fibrilar glial (GFAP) y el Galactocerebrosido (GalC) durante la
diferenciación de neuroesferas fetales y del adulto. Cinco a treinta por ciento de las
células diferenciadas fueron neuronas (beta II tubulina +) (Figura 2 A), 5 a 30% fueron
astrocitos (GFAP+)(Figura 2B) y 1 a 5 % fueron Oligodendrocito (GalC+)(Figura 2 C).
No se pudieron identificar variaciones significativas en el desarrollo potencial de los
clones de las células fetales y las del adulto. Sin embargo, la relación de la
diferenciación en neuronas y células gliales varió notablemente para cada una de las
células madre aisladas.
TABLA I
Células Madres Aisladas
F1
F2
AD1
AD2
AD3
Neuronas (β. III – tubulina +)
5±2
23 ± 5
11 ± 2
30 ± 6
19 ± 5
Astrocitos (GFAP +)
50 ± 9
29 ± 5
46 ± 7
49 ± 8
20 ± 7
Oligodendrocitos (Galc C +)
5±2
1±1
1±1
3±2
1±1
Tabla I. Cuantificación de la diferenciación de las células madre aisladas del feto (F1,
F2) y del adulto (AD1, AD2, AD3) en el humano, después de su evolución espontanea
en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los números representan la media del
porciento y del error estándar.
Métodos: Aislamiento de células madre del SNC. El tejido cerebral resecado se colocó
en DMEM/F-12 (Dubelco Modified Eagle Media f 12, GIBCO) congelado, conteniendo
penicilina estreptomicina, para ser disecado mas tarde. El tejido se cortó en pequeños
fragmentos embebidos con tripsina en solución 0.02 mg/ml en VERSEEN (GIBCO) a
37°C por 5 min. Después se agregó un inhibidor de la tripsina (Clonetics) mientras se
trituraba el tejido mecánicamente. La suspensión de células se centrifugó a 400rpm por
5 minutos, la cápsula que contenía el tejido en solución se lavó con DMEM/F-12 y se
esparció en una placa que tenía una densidad celular de alrededor de 5000-10 000
células viables por ml. En un medio compuesto de DMEM/F-12, suplemento B27
(GIBCO) y factores de crecimiento bFGF (20 ng/ml, Peprotec), EGF (20 ng/ml,
Peprotec), LIF (20 ng/ml, Prepotec) y penicilina-estreptomicina (GIBCO). Las células
madre crecieron como neuroesferas, mientras el medio se cambiaba cada 3 días. Las
neuroesferas se disociaron por trituración mecánica cada 12 a 15 días. Todos los
análisis ulteriores del tejido se hicieron con células madre que habían sido fragmentadas
un número similar de veces. En los cultivos que son trasplantados a los pacientes con
EP, el antibiótico debe ser retirado de la solución 30 días antes del trasplante.
Conteo de células: cada 5 días las neuroesferas son disociadas usando tripsina y
las células separadas se cuentan a través de un hemocitómetro después de teñirlas con
azul de tripan para identificar las células vivas.
Diferenciación de las células e inmuno histoquímica: La diferenciación de las
neuroesferas se inicio esparciendo las células en laminas sobre placas colocadas en el
medio de cultivo que contiene ácido trans-retinoico (RA, 10-6 M) y AMP dibutiril
cíclico (dBcAMP, 1 mM). Las células se fijaron en formaldehído al 4% en PBS siete
días antes de laminar el tejido sobre las placas para ser inmuno-teñido. Anticuerpo
contra beta-tubulina tipo III (1:500, Sigma) se usó para detectar las neuronas, el suero
anti GFAP (1:500, DAKO) para detectar los astrocitos y anti GalC (1:25, Rosche) para
detectar los Oligodendrocitos. Los anticuerpos secundarios fueron suero de cabra antiratón FITC (1:200, Sigma) y rodamina de cabra anti-conejo (1:200, Boehringer). Las
células inmuno-teñidas fueron contadas en 5 campos escogidos al azar en cada cultivo
usando un objetivo x20. El número total de células se contó usando núcleos teñidos y
DAPI (Pipetas Moleculares). Se sumaron las cuentas y se calcularon los porcentajes de
células.
Conclusión: El SNC del adulto contiene células madre multipotenciales que
continúan proliferando in Vitro en presencia de factores de crecimiento apropiados y se
diferencian en neuronas, astrocitos y Oligodendrocitos. Los cultivos de éstas células
como se ha descrito hacen posible multiplicar las células madre del SNC del adulto in
Vitro, lo que es esencial para implementar las terapias basadas en remplazamiento
celular.
5.2 Diferenciación dopaminérgica de las células madre in Vitro.
El bajo porcentaje de células dopaminérgicas que resultan de una diferenciación
espontánea de células madre, obligaron a buscar condiciones de crecimiento que
estimularan la diferenciación dopaminérgica in Vitro. Se ha demostrado que varios
factores de crecimiento y reguladores de la transcripción celular están involucrados en
la determinación del fenotipo dopaminérgico de las neuronas mesencefálicas. Después
de numerosos ensayos con diferentes factores de crecimiento y agentes que se sabe
estimulan la diferenciación neuronal, se encontró que el tratamiento de las neuroesferas
disociadas con ácido trans-retinoico integro (RA) en concentración 10-6M + 1mM
dibutiril AMP cíclico (dBcAMP), FGF8 (20 ng/ml) y GDNF (20 ng/ml) resulta en el
desarrollo de un gran número de células TH+ y DDC+, que son células productoras de
dopamina (Figura 3 y Tabla 2). El análisis de la producción y secreción de dopamina
utilizando análisis de cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) también indica
con precisión qué cultivos contienen el grado más alto de células TH+ y DDC+ y
sintetizan y secretan dopamina.
La secreción de dopamina en estos experimentos se indujo con soluciones que
contuvieran niveles altos de KCl. El análisis HPLC en fase inversa demostró la síntesis
y secreción de dopamina. La concentración en el medio de cultivo de células
diferenciadas 10 días después de iniciada la diferenciación varió de 0 a 100% (45 pg/ml
promedio) en diferentes aislados de células madre. La estimulación de la secreción de
dopamina agregando a los cultivos dopamina positivos a una solución 50 mM de KCl
por 30 min, hace que se triplique la secreción de dopamina en el medio de cultivo (345
± 74 pg/ml, n=3) los niveles de síntesis y secreción correlaciondon con la concentración
de células TH+ y DDC+ en los cultivos de células madre (Tabla 2). Los cultivos con el
las concentraciones máximas de células TH+ y DDC+ también contenían mas
dopamina y tenían la mayor respuesta a la despolarización al KCl. Tanto las inmunotinciones como la secreción de dopamina demostraron la presencia de neuronas
dopaminérgicas funcionales en los cultivos.
Después del tratamiento de células con RA, dBcAMP, FGF8 y GDNF, 10 a 40%
de las células se diferenciaron como neuronas, como lo mostró la tinción con
neurofilamento L y beta tubulina III. Hasta un 30% de esas neuronas resultaron TH+ y
DDC+ y fueron consideradas como neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, existe una
gran variación en el porcentaje de diferenciación dopaminérgica entre los diferentes
cultivos de células madre, lo que indica claramente que la diferenciación dopaminérgica
debe de ser evaluada durante las etapas tempranas de cada cultivo celular.
Figura 3. Diferenciación de células madre humanas in Vitro. A. Neuroesferas
durante fase de expansión. B. Célula madre neural diferenciada a los 7 días de iniciada
la diferenciación. C. Neurona positiva a la beta III tubulina mostrando fluorescencia. D.
Neuronas diferenciadas TH+ a los 7 días de iniciada la diferenciación.
TABLA II
Células
% neuronas
% TH+
% DDC +
Dopamina
0.5 ± 0.01
Secreción de DOPA
pg/m
100 ± 40
0
H1
35 ± 6
13 ± 3
12 ± 4
H2
11 ± 3
0.5 ± 0.02
H3
25 ± 4
27 ± 3
22 ± 6
120 ± 39
370 ± 75
H4
14 ± 3
20 ± 4
18 ± 5
H5
25 ± 7
1 ± 0.1
1 ± 0.1
75 ± 31
0
210 ± 65
0
C1
39 ± 7
29 ± 7
32 ± 9
110 ± 26
340 ± 62
350 ± 82
0
Tabla 2. Diferenciación dopaminérgica de células madre del SNC de adulto
después de ser tratadas con 10-6M ácido trans-retinoico total(RA), dibutiril AMP
cíclico al 1mM (dBcAMP), FGF8 (20 ng/ml), y GDNF ( 20 ng/ml) en condiciones
basales y después de la respuesta funcional a la solución de KCl
Además de neuronas dopaminérgicas, los cultivos diferenciados contienen
astrocitos, Oligodendrocitos y otros tipos de neuronas. También, en muchos casos se
identificaron poblaciones celulares que no expresaron ningún tipo de diferenciación con
los marcadores celulares, indicando que no eran neuronas, astrocitos u Oligodendrocitos
y más bien permanecieron como células madre indiferenciadas. En diferentes cultivos
se encontraron neuronas Gabaérgicas, colinérgicas, Glicinergicas y Glutamatérgicas. La
tabla 3 resume nuestros estudios de diferenciación de las células madre.
TABLA III
Clon
H1
% neuronas
35 ± 6
% GFAP +
60 ± 3
% GalC+
2±1
% GABA+
60 ± 8
% Glicina+
0
90 ± 6
% CHAT+
1±1
0
0
% Glutamato+
10 ± 3
0
H2
11 ± 3
55 ± 6
1±1
H3
25 ± 4
70 ± 7
5±3
56 ± 8
2±1
7±3
2±1
H4
14 ± 3
75 ± 5
1±1
80 ± 7
25 ± 7
55 ± 5
5±2
95 ± 7
1±1
0
1±1
0
1±1
0
H5
C1
39 ± 7
60 ± 5
1±1
50 ± 7
3±3
5±3
5±2
Tabla 3. Desarrollo de astrocitos, Oligodendrocitos, neuronas Gabaérgicas,
Colinérgicas, Glicinergicas y Glutamatérgicas que resultan de las células madre del
SNC del adulto, después de tratamiento con la misma solución que la descrita en la
tabla 2.
Métodos:
Las células del SNC del humano se incubaron para su crecimiento en un medio
de suero F12/DMEM (GIBCO), al que se agregaron suplemento de crecimiento B27
(GIBCO), bFGF, EGF y LIF humano recombinado (todos de Pepro Tech, Inc.). Las
células madre del SNC crecieron como neuroesferas en 25 cm2 o en matraces con
cultivos Falcón de 75 cm2. El medio de cultivo se cambió cada segundo día y las
neuroesferas se disociaron por trituración mecánica cada 12 – 15 días. Las células se
esparcieron en placas cubiertas de tejido en medio libre de suero F12/DMEM (GIBCO),
10-6 M ácido trans retinoico, 1mM dibutiril AMP cíclico, FGF8 (20 ng/ml) y GDNF
(20 ng/ml) incubados por 10 días. Antes de esparcir las células en las placas, fueron
disociadas en pequeños cúmulos (50-200 células) por trituración mecánica en el medio
de cultivo. La diferenciación celular fue evaluada por inmuno histoquímica usando
anticuerpos contra tirosina hidroxilasa (TH) y DOPA decarboxilasa (DDC). Los
cultivos de células se fijaron por 20 min. a temperatura ambiente con para formaldehído
en solución salina buffer de fosfato (PBS) al 4%, lavado 3 veces en PBS, pH 7.4,
permeabilizado usando una incubación de 10 min con TritonX-100 y lavado de nueva
cuenta con PBS. Los cultivos fueron después incubados en suero de cabra en PBS al
3%, con Tween 20 al 0.1% por lo menos 1 hora a temperatura ambiente. El bloqueo fue
seguido por incubación con anticuerpos primarios en suero de cabra al 1%+ Tween 20
por lo menos 3 horas a temperatura ambiente. Anticuerpo contra la beta-tubulina tipo III
(1:100, Chemicon) se uso para detectar neuronas y anticuerpos contra tirosina
hidroxilasa (1:100, Sigma) y DOPA decarboxilasa (1:200, Chemicol) que correspondían
a neuronas dopaminérgicas. El anticuerpo contra la decarboxilasa del ácido amino gama
butírico (GAD) fue utilizado para detectar las neuronas Gabaérgicas (1:1000,
Chemicon), en tanto que anticuerpo anti glutamato para las neuronas Glutamatérgicas
(1:100, Signature Inmunológicas) y anti glicina para las neuronas Glicinergicas(1:50,
Signature Inmunológicos).Finalmente suero anti acetil colina transferasa (CHAT) para
detectar las neuronas colinérgicas (1:100, Chemicon). Los cultivos fueron enjuagados
en PBS por lo menos 3 veces e incubados con anticuerpos secundarios diluidos al 1%
en suero de cabra y al 2% en Tween 20 por 1 hora a temperatura ambiente en
penumbra. Los anticuerpos secundarios fueron suero de cabra anti ratón FITC (1:200,
Sigma) y suero de cabra rodamina (1:200, Boehringer).
El análisis se hizo por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC).
Se separó 1 ml. de medio de cultivo para los cultivos estimulados para producir
secreción de dopamina, agregando solución 55mM de KCl-elusión con estándares de
dopamina.
Conclusión:
Las células madre del SNC cultivadas en presencia de factores neurotrópicos y
soluciones concentradas de KCl resultan en diferenciación de neuronas que sintetizan y
secretan dopamina. El ritmo de diferenciación de las neuronas dopaminérgicas varia en
diferentes cultivos de células madre entre el 0 al 30% del número de neuronas. Además
otros tipos de neuronas que secretan glutamato, acetilcolina, GABA y glicina crecen en
el mismo medio, así como astrocitos y Oligodendrocitos.
5.3 Trasplante de neuronas dopaminérgicas derivadas de células madre al estriado de
ratas.
El mayor problema de los trasplantes de células dopaminérgicas provenientes de
tejido fetal o de cualquier otro tipo de trasplante., es la sobrevida corta de las células
transplantadas. Con las técnicas de trasplante actual solo sobreviven entre el 5 al 20%
de las células transplantadas. En consecuencia, se necesitan 3 a 5 fetos para reunir entre
100 000 a 150 000 neuronas dopaminérgicas (Lindvall, 1997) para proporcionar solo
5 000 a 30 000 neuronas que sobrevivan. Usando neuronas dopaminérgicas derivadas
de células madre es posible aumentar significativamente el número de neuronas
transplantadas y optimizar el tiempo para el trasplante. El trasplante de células madre
del SNC del adulto al estriado de la rata da como consecuencia el crecimiento y
sobrevida de astrocitos solamente, mientras que el mismo trasplante en regiones
neurogénicas como el hipocampo y la zona sub ventricular resulta en el desarrollo de
neuronas de diferentes características de secreción (Fricker y cols 1999, Vescovi y cols
1999).
Hemos corroborado que células madre del SNC de humanos adultos en el
estriado de las ratas sin un tratamiento químico para inducir diferenciación, dan como
resultado el crecimiento solo de astrocitos y no de neuronas. En cambio, hemos
transplantado células madre del SNC del hombre, después de que se ha establecido la
diferenciación a neuronas dopaminérgicas al estriado de la rata encontrando
sobrevivencia de neuronas tiroxina hidroxilasa positivas. La Tabla 4 resume nuestros
resultados de sobrevivencia de neuronas TH+ en el estriado de las ratas 3 semanas y 2
meses después de transplantadas. Hemos determinado que el momento óptimo para el
trasplante de neuronas dopaminérgicas es entre 2 y 4 días después de iniciada la
diferenciación. Basados en esta observación hemos optado por trasplantar las células a
los 3 días de diferenciación
TABLA IV
Clon
3 semanas
2 meses
% de neuronas
% TH +
H3
Número total de
células
3000 ± 50
28 ± 8
8±4
H4
3000 ± 50
20 ± 5
3±1
C1
3000 ± 100
50 ± 10
15 ± 6
H3
3000 ± 50
30 ± 7
15 ± 6
H4
3000 ± 50
15 ± 3
1±1
C1
3000 ± 50
50 ± 9
25 ± 7
Tabla 4. Sobrevida de células madre del SNC del adulto, diferenciadas como
neuronas células TH+ positivas 3 semanas y 2 meses después de transplantadas al
estriado de las ratas. Las neuronas provienen de células madre que han sido tratadas
para acelerar su diferenciación en neuronas dopaminérgicas de acuerdo a la técnica
descrita en el texto. Las células madre provinieron de 3 muestras diferentes de tejido
cerebral del adulto.
Usando anticuerpos anti núcleo celular humano pudimos también identificar la
migración de las células humanas transplantadas al estriado de la rata. Más del 80% de
las células transplantadas migran menos de 0.5 mm del sitio del trasplante a las 3
semanas y 2 meses de estudiadas. Sin embargo, algunas células de humano se
identificaron a 5 mm del sitio del trasplante.
También se analizó la proliferación de las células humanas trasplantadas en el
cerebro de la rata, utilizando como marcador la bromodeoxiuridina (BrdU). BrdU se
inyectó intraperitoneal en las ratas transplantadas de 18 a 55 días después del trasplante
(n=3 ratas). Los animales fueron sacrificados 21 días y 2 meses después del trasplante y
3 días después de la inyección de BrdU. El análisis inmuno histoquímico de la
incorporación de BrdU en los cerebros no evidenciaron ninguna célula humana positiva
al BrdU en el cerebro trasplantado. Basados en estos datos, concluimos que 3 semanas y
2 meses después de transplantadas, las células humanas no proliferan en el cerebro de la
rata.
Métodos:
Células madre del SNC humano crecieron en un medio de suero F12/DMEM
(GIBCO), con suplemento de crecimiento B27 (GIBCO), 20ng/ml de bFGF, LIF,y EGF
humano recombinado. Las células madre del SNC crecieron como neuroesferas en 25
cm2 a 75 cm2 probetas de tejido de cultivo FALCON, cambiando el medio cada 2 días,
las esferas se disociaron mediante trituración mecánica cada 12 a 15 días.
Posteriormente las células fueron esparcidas sobre platillas cubiertas de poli-omithina
para su cultivo en el mismo medio descrito y agregando ácido trans-retinoico en
concentración 10-6, dibutiril AMP cíclico 1 mM, FGF8 (20ng/ml) y GDNF (20 ng/ml)
incubados por 3 días. Antes de esparcir las células en el cultivo, son disociadas en
pequeños conglomerados de 50 a 200 células, mediante trituración mecánica. Antes del
transplante, las células fueron diferenciadas por 3 días y después se colectaron mediante
una tripsinización leve (0.01 % de tripsina en Verseen, durante 5 minutos a temperatura
ambiente, lavado en 2 ocasiones con F12/DMEM, colocadas nuevamente en suspensión
en solución salina Dulbeco modificada y balanceada en fosfato (DPSB), lavado en 2
ocasiones con DPBS y re suspendidas en DPBS.
La cirugía estereotáxica se realizó en las ratas bajo anestesia con ketaminaxilasina. El sistema inmunológico de las ratas fue suprimido por inyección
intramuscular de ciclosporina cada 3er día. Las ratas recibieron 3 micro litros de
suspensión de células en el estriado de cada lado usando las siguientes coordenadas en
relación al bregma: Anterior = + 0.6, Lateral = 2.8 y Ventral -4.8 a 4.2. La barra dental
del estereotáxico se colocó a -2.3 y las coordenadas ventrales fueron consideradas a
partir de la superficie de la dura madre. Alrededor de 100 000 células fueron
introducidas a través de jeringas Hamilton. Los cerebros fueron extraídos y el estriado
disecado y colocado en 4% para formaldehído durante toda la noche. Se tomaron
secciones coronales y sagitales con un micrótomo con espesor de los cortes de 15
micras
Inmunohistoquímica:
Los cortes del encéfalo se trataron con BSA al 3% y Tween 20 al 0.02% durante
16 horas a 4 grados centígrados. Todos los anticuerpos primarios se diluyeron en PBS
que contenía albúmina se suero bovino (BSA) al 3% y Tween 20 al 0.02%. Los
anticuerpos utilizados en este estudio fueron anti núcleo humano, anticuerpo anti betatubulina tipo 2 y anticuerpo anti tirosina hidroxilasa. Para una doble tinción las
secciones se incubaron simultáneamente con dos anticuerpos primarios y secundarios.
Conclusión: Nuestros datos demuestran que un gran porcentaje de neuronas TH+
sobreviven 3 semanas y 2 meses después del transplante de células a los 3 días de
iniciada su diferenciación en Vitro. Se observaron variaciones entre diferentes cultivos
de células madre, en la sobrevida de las células después de transplantadas, semejante a
las variaciones observadas in Vitro en los experimentos de diferenciación celular. Los
mecanismos moleculares y celulares que subyacen estas variaciones son desconocidos a
la fecha.
5.4 Tumorogénesis de las Células Madre.
Las células madre del SNC proliferan activamente y sería concebible que
formaran tumores después de transplantadas. Los datos provenientes de otros
laboratorios indican sin embargo que las células madre del SNC no desarrollan tumores
después de ser transplantadas (Vescovi et al, 1999). Hemos hecho pruebas para
determinar la formación de tumores después de trasplantar células madre en la corteza y
el estriado en dos modelos diferentes: ratas inmuno suprimidas y ratones sin pelo
después de 5 meses de transplantados.
Métodos: Las células crecieron en medio libre de suero F12/DMEM, con
suplemento de crecimiento B27y recombinante humano bFGF y EGF 20 ng/ml (Pepro
Tech, Inc). Las células madre crecieron como neuroesferas, cambiándose el medio de
incubación cada 3er día, disociando las esferas por trituración mecánica.
Cada 12 a 15 días. Doscientas mil células del medio de cultivo fueron extraídas e
inyectadas estereotáxicamente en ratas anestesiadas y ratones si pelo, tanto en el
hipocampo como en el estriado. Los animales se sacrificaron a los 5 meses y sus
cerebros fueron estudiados para la formación de tumores en el sitio de inyección de las
células diferenciadas. Ni el examen macroscópico de los sitios de inyección, ni el
análisis histológico de secciones de 15 micras en el sitio del implante mostraron la
formación de tumores.
Conclusión: Las células madre del adulto y las neuronas diferenciadas no son
tumorogénicas.
6. Conclusión de los estudios preclínicos.
a. El SNC del humano adulto contiene células madre multipotenciales, que
continúan su proliferación in Vitro en presencia de factores de crecimiento apropiados
(bFGF, LIF y EGF) y se diferencian en neuronas, astrocitos y Oligodendrocitos.
b. El tratamiento de las células madre del SNC del humano adulto continua su
proliferación y diferenciación en neuronas secretoras de dopamina en presencia de
factores de crecimiento y soluciones trans RA integro, dibutiril AMP cíclico, FGF8 and
GDNF.
c. Un alto porcentaje de neuronas diferenciadas dopaminérgicas sobrevive
después de ser transplantadas al estriado de la rata.
d. Las células madre neuronales del humano adulto no son tumorogénicas.
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IV OBJETIVOS DEL ESTUDIO
A. Objetivo
El objetivo de este protocolo es demostrar la seguridad, efecto biológico y
eficacia terapéutica del transplante autólogo de neuronas derivadas de células madre de
la corteza cerebral en el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson (EP). La hipótesis
es que las neuronas derivadas de células madre neurales al ser adecuadamente
diferenciadas y transplantadas producen mejoría clínica significativa y duradera.
B. Propósito del estudio
El estudio incluirá 48 pacientes diagnosticados con EP incapacitante. La duración
del estudio se estima en 24 meses después del transplante. El estudio continuará si el
objetivo primario se alcanza.
c. Nombre y tipo de células que se utilizarán.
Las células que se utilizarán en el protocolo “INVESTIGACIÓN CLÍNICA DEL
TRANSPLANTE DE NEURONAS DOPAMINERGICAS DERIVADAS DE
CÉLULAS MADRE NEURALES EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
NEURODEGENERATIVAS I. ENFERMEDAD DE PARKINSON” tienen las
siguientes características:
Neuronas Dopaminérgicas y Gabaérgicas diferenciadas
Estas células se utilizaran en el tratamiento de la EP. No tienen nombre comercial
o patentado para estas categorías de células.
V. PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN.
A. Criterios de inclusión
Los pacientes serán seleccionados de acuerdo a los criterios del PROGRAMA DE
ASESORIA PARA TRANSPLANTES INTRACEREBRALES (Core Assessment
Program for Intracerebral Transplantation o CAPIT por sus siglas).
1. Criterio de diagnóstico clínico
El diagnóstico de EP se establecerá con al menos 2 de los siguientes síntomas
-temblor de reposo o postural
-rigidez muscular con signo de la rueda dentada
-bradicinecia
-alteración de los reflejos posturales
(Por lo menos un síntoma debe ser temblor o bradicinecia)
2. Respuesta al tratamiento con L-DOPA.
- La administración de L-DOPA debe mejorar por lo menos un 33% los síntomas
de la enfermedad en alguna de las evaluaciones con escalas clínicas para EP (véase más
adelante)
3. Escalas de evaluación clínica
-Estadio de Hoehn y Yahr II a IV bajo el efecto del medicamento (ON)
-Estadio III a V sin efecto del medicamento (OFF)
4. Historia de EP por lo menos de 5 años.
5. Una respuesta inicial satisfactoria a la L-DOPA, que se pierde progresivamente
(fenómeno ON/OFF)
6.- Sin otras enfermedades neurológicas o enfermedades sistémicas graves.
7. La medicación antiparkinsónica debe mantenerse sin cambios por lo menos 3
meses antes de la inclusión del paciente en el protocolo.
8. Edad de 35 a 85 años
9. Aún los pacientes portadores de neuroestimuladores pueden ser candidatos.
10. El paciente y/o su representante legal deben de entender el procedimiento
propuesto y firmar el consentimiento informado.
11. El paciente debe estar dispuesto y disponible para las consultas necesarias para
su seguimiento de por lo menos 24 meses.
1 b. Criterios de exclusión
Parkinsonismo debido a trauma, tumores cerebrales, infección, enfermedad
cerebro vascular, uso de fármacos, drogas, substancias químicas o tóxicas.
La presencia de parálisis oculomotora, signos cerebelosos, parálisis de cuerdas
vocales, hipotensión ortostática (caída de más de 20 mmHg al ponerse de pie).
Signos piramidales, Amiotrofia.
Demencia severa.
Degeneración olivo-poto-cerebelosa.
Parálisis supra nuclear progresiva.
2b. Pacientes con hipertensión arterial severa, insuficiencia renal, hepática, cardiaca,
cáncer u otra enfermedad grave.
3b. Pacientes que no estén disponibles para el seguimiento del estudio
4b Pacientes con estadios Hoehn y Yard < II o >de IV cuando estén bajo efecto de la
medicación
5b Pacientes con fluctuaciones motoras por L-DOPA impredecibles.
6b Pacientes con cambios en medicación en los tres meses previos a la inclusión en
el protocolo.
7b pacientes mayores de 85 años o menores de 35 años.
8b Pacientes con otras enfermedades del SNC.
9b. Pacientes que no firmen el consentimiento informado.
10b Pacientes con demencia significativa que les impida cooperar o llevar a cabo los
requerimientos del estudio o comprender el contenido del consentimiento informado.
11 b. Pacientes con historia de alcoholismo o drogadicción.
3b. Criterios de Exclusión.
El estudio será suspendido en caso de que alguno de los siguientes eventos
adversos se presenten y será reportado a la oficina de la COFEPRIS, FDA y al Comité
de Ética del Hospital Ángeles del Pedregal:
Fiebre Post-operatoria inexplicable, Convulsiones, Hemorragia intracerebral,
accidente vascular cerebral, infarto del miocardio, tromboembolia pulmonar, trombosis
venosa profunda.
B. Procedimientos del Estudio
1. Inclusión del paciente
El (los) paciente (s) serán incluidos en el estudio sí las condiciones siguientes se
cumplen:
El neurólogo obtiene una historia clínica completa del paciente y realiza un
examen neurológico completo para excluir otros padecimientos neurológicos aparte de
la EP.
El paciente satisface los criterios de inclusión y firma el consentimiento
informado.
El paciente y el neurólogo completan la evaluación pre trasplante.
2. La evaluación pre trasplante (véase diagrama de flujo clínico)
El neurólogo llevará a cabo la evaluación pre-trasplante al 6º, 3er mes y 2
semanas antes de la fecha anticipada del trasplante. La medicación para la EP, a la cual
el paciente es parcialmente refractario se mantendrá constante los tres meses previos al
trasplante. La medicación no debe ser suspendida. Las siguientes pruebas recomendadas
por el CAPIT (Lagaston JW y cols, Mov Disorders. 7:1-12,1992) se llevarán a cabo
para la evaluación basal (pre tratamiento) y serán aplicadas por el neurólogo;
Escala Unificada de Evaluación de la Enfermedad de Parkinson (Unified
Parkinson’s Disease Rating Scale o UPDRS)
Escala de Hoehn y Yahr
Escala de Evaluación de Disquinesia
Evaluación en tiempos programados (Timed testing) (la mejor condición ON y la
condición OFF efecto de la medicación).
Prueba de respuesta a la Levodopa.
Videograbación del paciente siguiendo el protocolo para video.
Prueba para la evaluación mental (“Mini-mental Status Test).
Actividades de la vida diaria.
Autoevaluación.
Las pruebas clinimétricas deben realizarse a la misma hora del día en todas las
evaluaciones del estudio. Los pacientes serán instruidos en la medicación de la mañana
de la evaluación.
La medicación y dosis, los datos demográficos y la información de condiciones
pre-existentes también serán evaluadas en los exámenes pre trasplante.
C. Estudios de imagen.
Resonancia magnética (RM) de cráneo será utilizada para establecer la condición
basal del paciente y descartar otras causas de Parkinsonismo.
Un estudio con fluoro-DOPA en Tomografía por Emisión de Positrones (Positrón
Emission Tomography o PET), con obtención de imágenes después de la ingestión de
200 mg de Carbidopa, 12 horas después de suspender la L-DOPA que toma el paciente.
Se obtendrán imágenes paramétricas para el análisis regional del Putamen y Núcleo
Caudado, usando el cerebelo como un sitio libre de captación de la fluoro dopa en el
plasma. Este estudio es opcional.
3. Obtención de células madre para transplante autólogo.
Los pacientes serán sometidos a una biopsia de su encéfalo para obtener células
madre. Una biopsia estereotáxica del epéndima para ventricular del lóbulo temporal
previa obtención de RM de cráneo se llevará a cabo bajo anestesia local. El lóbulo
temporal seleccionado para tomar la biopsia será del hemisferio no dominante, para
evitar riesgos de disfasia, disnomia y aún afasia. El epéndima peri ventricular puede ser
abordado fácilmente a través de un abordaje ortogonal, a través de la región temporal
anterior, que tiene poca vascularización cortical, evitando así riesgo de sangrado. El
epéndima peri ventricular se encuentra en posición lateral y relativamente lejos del
hipocampo, minimizando el riesgo de alteración de la memoria no verbal o eventos
convulsivos.
Los pacientes esperarán de 3 a 4 meses después de la biopsia para recibir el
trasplante de sus células después de la fase de proliferación y diferenciación para
alcanzar un número aproximado de 20 millones de células para el transplante. La
ventaja principal del transplante autólogo es la gran probabilidad de sobrevivencia de
las células trasplantadas y su integración al tejido cerebral.
4. Procedimiento de Micro trasplantes.
Para el trasplante los pacientes serán operados en condiciones estereotáxicas bajo
anestesia local. Las células serán implantadas en forma bilateral en el Putamen
utilizando técnica estereotáxica guiada por imagen de RM y CT y correlacionándolas
con la imagen de los estudios metabólicos de la PET.
El marco estereotáxico se fijará al cráneo bajo anestesia local y el Putamen y
Núcleo Caudado serán visualizados por RM-CT. Posteriormente el paciente será
colocado en la sala de operaciones y bajo anestesia local se realizarán trepanaciones
bilaterales y a través de ellas se pasaran cánulas muy finas de jeringas de Hamilton
dirigidas estereotáxicamente a los blancos pre determinados. Un total de 10 inyecciones
(5 de cada lado) a 4 mm de distancia en el Putamen servirán para colocar la totalidad de
las células a trasplantar. La razón de colocar los injertos a 4 mm de distancia entre sí,
deriva del hecho de que las arborizaciones dendríticas de las neuronas dopaminérgicas
fetales crecen varios milímetros, re inervando el estriado del huésped. Los puntos de
entrada de las trayectorias de las agujas serán en sitios diferentes de la convexidad
cortical. Los tractos al Putamen serán verticales con referencia al plano coronal. En
cada blanco (target) estereotáxico se inyectará una suspensión de 50 micro litros, con un
promedio de 2 millones de neuronas cada una (40 000 células por micro
litro).inyectadas lentamente en un periodo de 10 min por inyección.
5. Evaluaciones durante el seguimiento.
El Paciente será hospitalizado en la unidad neuroquirúrgicos por un periodo
anticipado de 24 horas. No se anticipan efectos adversos. Todos los pacientes recibirán
antibióticos profilácticos el día de la cirugía.
Los seguimientos incluyen la aplicación de la escala UPDRS, un una bitácora de
la medicación, ADL que serán repetidos en los meses 1, 3, 6, 9, 12 por el mismo
neurólogo especialista en movimientos anormales (véase diagrama de flujo clínico). La
medicación será temporalmente suspendida para evaluación basal pre quirúrgica.
Una RM de cráneo será realizada al día siguiente de la intervención y a los 6 meses. Los
estudios de FDOPA-PET se repetirán a los 6 y 12 meses postoperatorios.
C. Mediciones de condición clínica.
Los métodos que serán usados para evaluar a los pacientes incluyen UPDRS,
Mini mental Status Examination (Mini-Mental) por neurólogos especializados en
movimientos anormales que tengan experiencia en la aplicación e interpretación de
estas pruebas.
Las video grabaciones serán repetidas en cada visita de seguimiento para
documentar el procedimiento. El propósito fundamental del video filmación es servir
como documento permanente que evalúa la forma de recolección de los datos.
Herramientas para la Clinimetría
UPDRS (véase anexo) es una escala de evaluación clínica completa, internacional
y validada para la mayor parte de los países (Estados Unidos Y México inclusive). La
escala comprende 42 reactivos con un puntaje de 0 a 4 y evalúa el estado mental, las
actividades de la vida diaria, la función motora, las complicaciones de la terapia médica
(disquinesias, fluctuaciones ON-OFF y otras).
La escala de Hoehn y Yahr evalúa el estadio de avance de la enfermedad.
La escala de Schwab- England mide la condición funcional del paciente. Esta
escala en particular evalúa el progreso de la enfermedad y la eficacia de cualquier
tratamiento.
Escala de evaluación de las disquinesias (Dyskinesia rating scale).
La prueba de respuesta a la Levodopa.
Mini-Mental. Evalúa la condición neuropsicológica del paciente (MMSE,
Folstein y cols, 1975). Es de uso común para determinar la condición cognitiva del
paciente que incluye lenguaje, memoria, atención y praxias (véase anexos).
Evaluación por video filmación. Se hará de acuerdo al protocolo diseñado en
Grenoble por Pollak y cols (véase anexo de video protocolo)
DATA FORM DESCRIPTION
Los investigadores deben documentar los resultados clínicos utilizando los
formatos correspondientes contenidos en la carpeta de Forma para Reporte del Caso
(CASE REPORT FORMAT O CRF) tanto en el periodo pre-trasplante, post-operatorio
inmediato y el seguimiento Los formatos utilizados y la información recolectada es la
siguiente:
a) Información confidencial del paciente.
b) Criterios de inclusión.
c) Evaluación pre-trasplante.
d) Medicación
e) Historia clínica ´pre-trasplante.
f) UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale)
g) Valoración neuropsicológica mediante Mini-Mental Status Examination
h) Valoraciones clínicas programadas a diferentes horas (Timed Testing)
i) Valoraciones clínicas durante el seguimiento
j) Examen motor para EP
k) Eventos adversos
l) Complicaciones
m) Terminación del estudio
Estos formatos están contenidos de el Anexo A
El seguimiento de los pacientes se hará a los 3, 6, 9 y 12 meses después de la
operación. El seguimiento consistirá en repetir la aplicación de las escalas antes
mencionadas y la recolección de eventos adversos y complicaciones. Se completará la
recolección de datos con autoevaluación del paciente sobre sus actividades de la vida
diaria y estado funcional. Las partes correspondientes a la calidad de vida y actividades
de la vida diaria servirán como evidencia de los efectos benéficos de la terapia y de la
mejoría funcional en la vida del paciente.
Las valoraciones se harán en tres ocasiones durante el periodo basal pre trasplante
y a los 3, 6, 9 y 12 meses de seguimiento. Cada evaluación incluirá la UPDRS y Escalas
motoras y serán llenadas por el neurólogo y el paciente.
Se determinará el perfil de seguridad y complicaciones de la terapia. Se
documentarán las complicaciones y efectos colaterales tales como disfasia, trastornos de
equilibrio, apraxias y otros listados en la sección se Análisis de Riesgos del protocolo.
Los eventos adversos anticipados y no anticipados serán documentados, tanto los
transoperatorios como los que ocurran en cualquier momento durante el seguimiento.
Las condiciones pre-existentes que pudieran complicar el tratamiento también serán
documentadas para integrar correctamente el perfil de riesgos de la terapia.
D. Métodos de Análisis Estadístico.
El estudio incluirá a 48 pacientes con EP o parkinsonismo y será realizado en un
periodo de 2 años. Los pacientes serán voluntarios y admitidos hasta completar los 48
pacientes. Se estima que una muestra de 48 pacientes tendrá un 90% de poder para
detectar diferencias usando una prueba t de “student” con un nivel de significancía de
0.05 en ambos sentidos. El análisis estadístico del nivel de discapacidad, UPDRS y
actividades de la vida diaria (ADL) se hará para cada periodo de seguimiento en
relación con la condición basal.
MANUAL DEL INVESTIGADOR
A. Resumen.
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa
caracterizada por una pérdida importante de neuronas en la substancia negra del tallo
cerebral. La pérdida de neuronas dopaminérgicas en la substancia negra da como
consecuencia una degeneración del sistema dopaminérgico nigro estriatal que regula la
función motora. A su vez, esto trae como consecuencia una disfunción motora que
consiste en pobreza y lentitud de los movimientos voluntarios, temblor, congelamiento
de la marcha, rigidez y postura en flexión. No hay cura para la EP. Numerosos intentos
para remplazar las neuronas dopaminérgicas se han llevado a cabo colocando
trasplantes en el cerebro con diferentes tipos de neuronas secretoras de dopamina, tales
como tejido fetal humano rico en neuronas dopaminérgicas, trasplantes autólogos de
médula suprarrenal, neuronas dopaminérgicas de otras especies, etc. Los resultados de
estas terapias de remplazo celular, aunque prometedores, han mostrado una gran
heterogeneidad de las células trasplantadas, riesgos de rechazo inmunológico y otros
problemas relacionados al tejido trasplantado, además de crear preocupación social
sobre las terapias de trasplante celular.
Recientemente, células madre del sistema nervioso central (SNC) se aislaron en
mamíferos y se ha demostrado que pueden diferenciarse como neuronas
dopaminérgicas o al menos como células secretoras de dopamina. Esto abre una
perspectiva importante de poder utilizar células madre del SNC humano, diferenciadas
in vitro como células dopaminérgicas, en una terapia de remplazo celular en la EP. Las
células madre del SNC se pueden obtener tanto de fetos como de humanos adultos. La
obtención de células madre del humano adulto hace posible diseñar trasplantes
autólogos, que eliminan los riesgos de rechazo inmunológico y enfermedades
trasmitidas por el material trasplantado.
Se propone el uso de células madre neurales obtenidas del mismo paciente,
diferenciadas in vitro como células neuronales dopaminérgicas, para remplazar las
células dopaminérgicas perdidas en el cerebro de pacientes con EP. Las células
obtenidas del mismo paciente constituyen un trasplante autólogo y serán incubadas para
su multiplicación in vitro en presencia de 3 factores de crecimiento: factor de
crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y
factor inhibidor de leucemia (LIF).Antes de ser trasplantadas las células serán tratadas
con el factor de crecimiento fibroblástico 8 (FGF8), factor neurotrópico derivado de la
glía (GDNF), ácido trans-retinoico (RA) y dibutiril adenosin mono fosfato básico
(dBcAMP). Este tratamiento resulta en iniciación de una diferenciación dopaminérgica
de un número importante de células madre.
Tres días después de iniciada la diferenciación celular, las células serán micro
trasplantadas al estriado del mismo paciente de donde fueron obtenidas. El tratamiento
de las células resulta en una diferenciación de entre el 0-30% de las células hacia
neuronas dopaminérgicas. Las células serán trasplantadas usando micro jeringas en 5
posiciones del Putamen, conteniendo 700 000 a 1000 000 de neuronas dopaminérgicas
por paciente.
1. Antes de ser trasplantadas las neuronas se harán pruebas al cultivo para determinar:
-Una diferenciación apropiada (caracterización de las células, identidad y esterilidad del
cultivo)
B. Procedimientos básicos de aislamiento de células madre, propagación (crecimiento y
diferenciación.
Pequeños fragmentos de tejido cerebral se obtendrán a través de biopsias. La
biopsia será estereotáxica del epéndima peri ventricular confirmada por RM del cráneo,
ambas realizadas con anestesia local.
1. Aislamiento de células madre autólogas en el adulto.
El tejido cerebral que se obtiene en la biopsia será colocado en solución helada de
DMEM/F-12 conteniendo penicilina y estreptomicina, para ser posteriormente
disecado. El tejido será fragmentado en pequeños fragmentos de 0.5 a 1.0 mm³ y
transferido a solución que contenga tripsina (0.02 mg/ml³ en Verseen, GIBCO)
incubados a 37°C durante 5 min. Después de la incubación, una mescla inhibidora de la
tripsina (Clonetics) se agregará y el tejido será triturado mecánicamente con una pipeta
de Pasteur. La suspensión celular se centrifugara a 400 rpm por 5 min y la cápsula que
la contiene se lavará con DMEM/F-12 y esparcido en áreas que contengan de 5000 a 10
000 células viables/ml en 6 cajas de cultivo y en un medio que contenga además de
DMEM/F-12 (1:1), buffer Herpes, glucosa, bicarbonato de sodio, glutamina,
suplemento B27(GIBCO), factores de crecimiento bFGF (20 ng/ml, Peprotec),EGF (20
ng/ml, Peprotec), LIF (20 ng/ml, Peprotec) y penicilina estreptomicina (GIBCO).
2. Multiplicación de células madre autólogas. Un medio libre de F12/DMEM(GIBCO)
con suplemento de crecimiento B27, bFGF, (20 ng/ml, Peprotec), EGF (20 ng/ml,
Peprotec), LIF (20 ng/ml, Peprotec) y penicilina/estreptomicina (GIBCO).
Las células madre crecen como neuroesferas en medios de cultivo Falcón de 25 a
75 cm³ y se cambia el medio de cultivo cada 3er día, disociando las esferas por
trituración mecánica cada 12-15 días.
Cuenta de células: Cada 5 días las neuroesferas se disocian utilizando tripsina y
las células se cuentan con un hemocitómetro después de teñirse con azul de Trypan,
para identificar las células vivas.
3. Inducción de la diferenciación de las células madre a neuronas dopaminérgicas.
Las células madre del SNC se colocan en placas cubiertas con poly-omithine de
100 mm de diámetro, Falcón o Nunc) en suero libre de F12/DMEM, con suplemento
B27, ácido trans retinoico integro a la 10-₆ M, dibutiril AMP cíclico 1 mM, FGF8 (20
ng/ml)y GDNF (20 ng/ml) e incubadas por 3 días. Antes de esparcir las células estas
serán disociadas en pequeños agregados de 50 a 200 células mediante trituración
mecánica en el medio de cultivo. Aproximadamente se esparcirán un número de células
de 2 x 106 en 100 mm³ del contenedor del medio de cultivo y un total de 10
contenedores o placas. Después de 3 días se extraerán del cultivo las células
diferenciadas mediante solución de tripsina (0.01% tripsina en Verseen por 5 minutos a
temperatura ambiente). Los extractos serán lavados 2 veces en solución con
F12/DMEM, re suspendidas en solución salina fosfato balanceada (D-PBS, GIBCO),
lavado de nuevo con D-PBS y re suspendida en un volumen menor de D-PBS. Este
tratamiento colectará entre 0.7 a 2 millones de células dopaminérgicas por cada
contenedor y se enviarán 20 millones de células para ser trasplantadas en el quirófano.
C. Manejo del tejido cerebral obtenido durante la biopsia y las células para trasplante.
El tejido nervioso y las biopsias serán manejados de acuerdo a los siguientes
procedimientos.
a) Obtención estéril.
Obtener el tejido directamente del cirujano anotando el nombre, fecha y hora de
la biopsia, así como el sitio de donde fue obtenida la muestra. Se coloca el tejido
biopsiado en un tubo con medio estéril que se etiqueta y se le asigna un número o
código para su identificación ulterior. Se coloca el tubo en un contenedor con cierre y se
llena la forma de la toma de biopsia.
b) Transportación de la muestra.
Se sumerge el espécimen en un contenedor con hielo seco que se lleva al
laboratorio.
c) Manejo de las células.
El tejido de la biopsia será disociado y se iniciará el cultivo.
Cada uno de los especímenes se manejara por un solo individuo.
Los cultivos serán aislados en contenedores de Plexiglás con incubadoras que
mantienen estable la concentración de CO2. Bajo la tapa del cultivo de tejido se
manejarán las células de un solo paciente a la vez, esterilizando el contenedor antes de
utilizarlo en el cultivo de células de otro paciente.
Se utilizan alícuotas de medio de cultivo agregando factores de crecimiento para
las células de cada paciente.
Un tubo de ensaye conteniendo 20 millones de células se transportará a la sala de
operaciones para ser implantadas dentro de las siguientes 24 horas, en un contenedor
térmico a 37°C
D. Caracterización del producto.
El proceso de manufactura de las neuronas dopaminérgicas derivadas de las
células madre autólogas y de éstas neuronas (producto final) antes de ser trasplantadas
van a ser evaluadas para determinar su pureza, seguridad (no contaminación), identidad,
potencia y estabilidad (véase diagrama de flujo).
1. Seguridad. El análisis de seguridad incluye esterilidad, contaminación con
mico plasma, presencia de endotoxinas, ausencia de otros agentes contaminantes
químicos o biológicos.
a) Esterilidad. Las pruebas de esterilidad se llevarán a cabo al 4° mes del cultivo, 20
días antes del trasplante y en el producto final (alícuota de células a trasplantar). Estas
muestras serán enviadas al Laboratorio Charles River para ser analizadas según el
procedimiento de “Pruebas de Esterilidad de Productos Biológicos” (Anexo E).
Además pruebas rápidas como tinción de Gram se llevarán a cabo inmediatamente
antes de implantar las células en el quirófano.
b) Contaminación por mico plasma.
Pruebas específicas para determinar contaminación por mico plasma (tinciones de
PCR y DAPI)serán utilizadas para analizar los cultivos cada mes por los 4 meses in
vitro, 20 días antes de ser trasplantados y en el producto final que se envía al quirófano.
Pruebas para detectar la presencia de mico plasmas que se desarrollan en medios con
agar y de aquellos que se no desarrollan en agar se llevarán a cabo en los cultivos a los
4 meses de incubación de las células madre. Estas pruebas también se realizarán en los
Laboratorios de Charles River de acuerdo con su protocolo (Anexo F).
c) Endotoxinas
La presencia y la cantidad de endotoxinas en las muestras serán analizadas
usando el ensayo Limulus Amoebocyte Lysate del laboratorio Charles River de
acuerdo a su protocolo (Apéndice G)
La presencia de endotoxinas se llevará a cabo en las células para trasplante20 días
antes del trasplante.
d) Ausencia de otros agentes contaminantes.
Los estudios de laboratorio de los pacientes incluyen pruebas virales para VIH,
Hepatitis A, B, C y citomegalovirus (CMV), utilizando el laboratorio clínico del Centro
Médico “Cedars-Sinai” (ELISA ).
La contaminación potencial de células madre autólogas por HIV, Hepatitis, CMV,
HTLV1 y virus Epstein Barr se analizará a los 4 meses del cultivo, 20 días antes del
trasplante y en el momento del trasplante usando tinciones PCR.
2. Identidad y Pureza
El único tipo celular que ha demostrado efectividad en la enfermedad de
Parkinson es el trasplante de células dopaminérgicas. La diferenciación dopaminérgica
y la identificación de la presencia de otros tipos de células en los cultivos se llevarán a
cabo durante el proceso de diferenciación y antes del trasplante, para garantizar el
efecto terapéutico de las células trasplantadas.. Solo cultivos que tengan un mínimo de
15% de células dopaminérgicas serán utilizados para trasplantarlos. Antes de
trasplantarlas, las células serán lavadas por lo menos 3 veces con PBS para reducir el
nivel de factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo a niveles muy por
abajo del útil. El triple lavado usando PBS (100x excess PBS) reduce la concentración
de factores de crecimiento 104 veces, lo que muy inferior al valor kd de los receptores
de factores de crecimiento.
a) Análisis de la diferenciación de las células madre.
Se comprueba la diferenciación de las células madre de la siguiente manera:
Cuatro meses después de iniciado el cultivo de las células, cuando el número de
células es entre 50 000 a 100 000.
Veinte días antes del trasplante.
Una alícuota de las células que se van a trasplantar se prueba para determinar su
diferenciación dopaminérgica y la diferenciación y presencia de otros tipos de células.
Todas las pruebas evaluarán las siguientes características:
- Análisis inmunohistoquímico de células TH positivas (células dopaminérgicas)
- Análisis inmunohistoquímico de células DDC positivas (neuronas dopaminérgicas).
- Análisis inmunohistoquímico de células tubulina β III positiva (neuronas).
- Análisis Inmunohistoquímico de células positivas al GFAP (astrocitos).
- Análisis inmunohistoquímico de células GalC positivas (0ligodendrocitos).
- Análisis inmunohistoquímico de células GAD positivas (neuronas Gabaérgicas).
- Análisis inmunohistoquímico de células CHAT positivas (neuronas colinérgicas).
- Análisis inmunohistoquímico de células positivas a la glicina (neuronas Glicinergicas).
- Análisis inmunohistoquímico de células positivas al glutamato (neuronas
Glutamatérgicas).
Cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC) para la presencia de
estimulación de la secreción de dopamina.
Métodos de Inmunohistoquímica:
Las células del SNC humano crecerán en un medio F12/DMEM, implementadas
con suplemento para el crecimiento B27, recombinantes humanos de bFGF, EGF y LIF
en concentración de 20 ng/ml. El medio de cultivo será cambiado cada 3er día, las
neuroesferas de células serán disociadas por trituración mecánica cada 12 a 15 días. Las
células serán extendidas sobre platos de cultivo cubiertos de poli-omithina en un medio
F12/DMEM con suplemento para crecimiento B27, ácido, trans-retinoico, dibutiril
AMP cíclico 1 mM, FGF8 y GDNF en concentraciones de 20 ng/ml en cultivo durante
10 días. Las células serán separadas por trituración mecánica en congregados de 50 a
200 células estando inmersas en el medio de cultivo. Las alícuotas de los cultivos de
células se fijarán en para formaldehido en PBS, durante 20 min a temperatura ambiente,
después lavadas 3 veces en PBS con pH de 7.4, permeabilizadas incubándolas en Tritox
X-100 al 0.1% durante 10 minutos y lavadas nuevamente con PBS. Los cultivos serán
incubados en suero de cabra al 3% en PBS agregado de Tween 20 a temperatura
ambiente durante una hora El bloqueo será seguido de incubación con anticuerpos
primarios en suero de cabra al 1%, agregando Tween 20 a temperatura ambiente por
más de 3 horas. La diferenciación será evaluada por tinciones de Inmunohistoquímica
usando anticuerpos anti:
DOPA decarboxilasa.
β tubulina Tipo III.
GFAP
GalC
Gama aminoácido decarboxilasa
L-glutamato.
Glicina
Acetil colina transferasa.
Después de la Incubación con los primeros anticuerpos los cultivos se lavarán con
PBS en 3 ocasiones y se incubarán con anticuerpos secundarios diluidos en suero de
cabra al 1.0% con 0.2% de Tween 20 durante una hora a temperatura ambiente y en
penumbra. Los anticuerpos secundarios serán suero de cabra anti-ratón FITC (1:200) y
suero de cabra anti ratón rodamina.
3. Potencia.
La presencia de marcadores dopaminérgicos en las células diferenciadas no
garantiza la función de las células como productoras de dopamina, la función
dopaminérgica será comprobada mediante el análisis con cromatografía de líquidos de
alta presión (HPLC) sobre las células diferenciadas y sobre el medio de cultivo después
de inducir la secreción de dopamina mediante una despolarización de la membrana.
Solamente las células que muestren ser secretoras de dopamina por estas técnicas serán
utilizadas para trasplantarlas.
HPLC para comprobar la producción y secreción de dopamina por las células:
Se tomará 1ml de medio de cultivo de las células cultivadas al que se agregará
KCl en solución 55 mM por 30 minutos para estimular la secreción de dopamina. La
dopamina será estabilizada inmediatamente agregando al medio de cultivo 88μl de
ácido orto fosfórico i 4.4 mg de meta bisulfito. Las muestras serán enviadas para HPLC
al laboratorio especializado para su análisis. La dopamina será extraída de las muestras
utilizando el método de extracción de aluminio y con un análisis de fase reversa de una
columna de C18 y MD-TD móvil. Los resultados serán validados por coelusión con
estándares de dopamina.
4. Estabilidad.
El crecimiento in vitro de las células madre podría cambiar el potencial de las
mismas para formar tumores (transformación celular) y conducir a cambios en el
material genético. Además, existe el riesgo potencial de que en el mismo medio de
tejido crezcan por contaminación células tumor génicas que podrían tomarse para el
trasplante. Para descartar estas posibilidades se harán pruebas de tumorogenicidad y
cambios cromosómicos de las células madre. Las células madre que serán utilizadas
para diferenciarlas y trasplantarlas, serán analizadas para tumorogenicidad a través de
crio preservadas.
a) Tumorogenicidad.
Cada célula madre aislada será analizada para tumorogenicidad potencial.
Después de 2 meses de incubación en los cultivos una muestra de células madre será
trasplantada al cerebro de ratones, que se sacrificarán 90 días más tarde para ser
analizados.
Métodos:
Las células crecerán en un medio de cultivo F12/DMEM con suplemento de
crecimiento B27 y factores de crecimiento recombinantes bFGF, EGF y LIF en
concentración de 20 ng/ml. Las células madre formarán neuroesferas y serán disociadas
por trituración mecánica cada 12 a 15 días, cambiando el medio de cultivo cada 3er día.
Cien mil células aproximadamente tomadas del medio de cultivo, serán inyectadas por
métodos estereotáxicos en el hipocampo y estriado de ratones. Los animales serán
sacrificados a los 90 días post inyección, en una cámara de CO2 y sus cerebros
analizados para la formación de tumores. Los cerebros se extraerán y se colocarán en
una solución al 4% de para formaldehído. Cortes sagitales de 15μ de espesor, hechos
con un microtomo, se teñirán con hematoxilina eosina para su examen histológico.
b) Análisis cromosómico.
Anomalías en el número de cromosomas de las células madre en cultivo se
determinará a través de estudios estándar de cariotipo.
c) Antibióticos.
Se agregará al medio de cultivo una solución de penicilina/estreptomicina
(GIBCO) en las fases iníciales de aislamiento y crecimiento. Entre 30 a 45 días antes de
trasplantarse, los antibióticos se retiraran del medio de cultivo y a partir de ese
momento las células crecerán en un medio sin antibióticos.
E. Pruebas finales del tejido para trasplante. Especificación y certificación del producto.
Pruebas finales 20 días antes del trasplante. (Véase apéndices A de formatos del
laboratorio y E, F, G), que contienen la siguiente información.
1. Células
a) Viabilidad (número de células vivas trasplantadas).
b) Número de células dopaminérgicas trasplantadas.
c) Producción de dopamina.
d) Porcentaje de otros tipos de células. Astrocitos GFAP positivos por ejemplo.
2. Esterilidad.
a) Contaminación microbiológica.
b) Contaminación viral.
c) Contaminación por agentes micóticos.
3. Endotoxicidad.
CONSENTIMIENTO INFORMADO
Este consentimiento de “Tratamiento” (el “Tratamiento”) se establece entre
____________________________ (el “paciente”) y los Drs. Michel Levesque y
Francisco Velasco (los” doctores”), a los que se refiere como “la (s) Parte (s)” o en
forma colectiva “las Partes”.
ANTECEDENTES
A: El Dr. Levesque ha desarrollado un tratamiento en 3 etapas (el “Tratamiento”), que
se denomina como “Tratamiento” de trastornos neurológicos por transplante en el
Sistema Nerviosos Central de progenitores y neuronas provenientes de células madre
diferenciadas” encaminados a reducir los síntomas de los trastornos neurológicos. El
“Tratamiento” consiste en (I) recolectar células madre del cerebro del “paciente” (II)
reproducir estas células en el laboratorio y promover su determinación en la secreción
del neurotransmisor que se desee (III) reimplantación en una parte estratégica del
cerebro del mismo “paciente” de esas células madre diferenciadas.
B. Las partes han llegado a un acuerdo mutuo satisfactorio para permitir a los
“doctores” tratar el “paciente” usando el “Tratamiento”.
CONVENIO
Considerando una conveniencia mutua y para establecer las bases del “Tratamiento”
del “paciente” por los “doctores”, las partes establecen este convenio en el tenor de los
siguientes términos y providencias.
A: Los “doctores” aceptan llevar a cabo el “Tratamiento” en el “paciente” y el
“paciente” acepta ser tratado por los “doctores”.
B: Fase I. La primera fase (“Fase I”) del “Tratamiento” se hará en el Hospital “Centro
Médico Cedar-Sinai” de Los Ángeles California, EE.UU. Los “doctores” extraerán por
un procedimiento quirúrgico células madre del encéfalo del “paciente” en esta Fase I.
C: Fase II. La segunda fase (“Fase II”) será realizada por el Dr. Levesque y
colaboradores en un laboratorio que ellos designen para la regeneración,
almacenamiento y diferenciación de las células madre serán cubiertos por el “paciente”.
D: Fase III. La tercera etapa (“Fase III”) será realizada por los “doctores” quienes
harán los arreglos en el Hospital Ángeles del Pedregal, México D. F. para contar con la
tecnología de re-implantar las células madre desarrolladas en la Fase II en el encéfalo
del “paciente”.
E: Seguimiento del “paciente”. Los “doctores” harán un seguimiento del “paciente”
en visitas a la Consulta Externa o consultorio médico en los meses uno, tres, seis, nueve
y doce post operatorios. El “paciente” acepta ser video grabado a discreción por los
“doctores” las veces que sea necesario, para evaluar los resultados de la cirugía.
F: Beneficios del “Tratamiento”. No se garantiza que el “paciente” se beneficiará del
“Tratamiento”
G: Posibles riesgos y molestias del “Tratamiento”.
Los riesgos y molestias potenciales del “Tratamiento” incluyen, pero no están
limitados a:
1.- Sangrado (hemorragia) en el cerebro, que podrían llegar a causar daño
neurológico severo, debilidad o parálisis de un parte del cuerpo, trastornos de lenguaje o
aún la muerte. El riesgo de esta complicación aumenta con la edad del paciente y en los
pacientes con presión arterial alta (hipertensión arteria). Para pacientes con hipertensión
arterial y mayores de 60 años, el riesgo de hemorragia es de alrededor del 5%.
2.- Debilidad o parálisis, visión doble, disminución de sensibilidad en alguna parte
del cuerpo o trastornos mentales.
3.- Infecciones del o los sitios operados, en cuyo caso pudiera necesitar tratamiento
con antibióticos. Algunas formas de infección como la meningitis ó absceso cerebral
pudieran llegar a causar la muerte.
4.- Convulsiones, confusión mental, estupor y dolores de cabeza intensos.
5.- Salida (fístula) de líquido cefalorraquídeo que rodea el cerebro y puede
predisponer a infecciones graves.
6.- Reacción alérgica o rechazo del tejido implantado en el cerebro.
7.- Adormecimiento persistente u hormigueo en las extremidades de la cara
(parestesias y disestesias) e incluso dolor periférico.
8.- Problemas del lenguaje en forma de disfasia (dificultad para decir o entender el
lenguaje), disartria (dificultad para pronunciar las palabras).
9.- Incoordinación, distonía (contracturas musculares no dolorosas, pero que en
ocasiones causan discapacidad), debilidad de los músculos de la cara o parálisis parcial
de extremidades o cara y en ocasiones movimientos involuntarios.
10.- Deficiencias para aprender en forma de baja capacidad de atender o de
reconocer lo que se lee y escucha.
11.- El procedimiento para extraer las “células” madre en la Fase I también puede
complicarse con hemorragia, infección, epilepsia y dolor de cabeza.
12.- Otras posibles complicaciones podrían presentarse pero no pueden predecirse
hasta el momento.
H: El “Tratamiento” esta siendo evaluado en relación al riesgo y eficacia.
I: Gastos del “Tratamiento” para el “paciente”.
El “paciente” es informado que seguros de gastos médicos a instituciones podrían no
pagar por procedimientos en fase de evaluación.
J: Terminación de la Participación:
Las “partes” acuerdan que el “Tratamiento” podría terminarse en cualquier
momento, sí los doctores determinan que:
1.- Una droga en particular o cualquier otro tratamiento es superior al “Tratamiento”
propuesto en éste convenio.
2.- Si el “Tratamiento” se considera inefectivo, peligroso o con efectos colaterales y
riesgos médicamente inaceptables, en base a tratamiento del “paciente” o “pacientes”
previos.
3.- Si el paciente no coopera para llevar a cabo el “Tratamiento”.
K: Consecuencias de terminar con el “Tratamiento”
El paciente puede cambiar de opinión y retirarse del “Tratamiento” en cualquier
momento, antes o después que el “Tratamiento” inicie, sin consecuencia para continuar
siendo tratado por otros médicos existentes. El “paciente” debe retirarse del
“Tratamiento” avisando a los “doctores” de su decisión.
L: Alcances del “Consentimiento”:
El “paciente” firma este “Consentimiento” en el entendido que:
1.- Tuvo la oportunidad de obtener respuesta a todas sus preguntas relacionadas con
la naturaleza del “Tratamiento”, de que existen tratamientos alternos y de los riesgos
potenciales, efectos colaterales y molestias relacionadas con el “Tratamiento”. El
paciente entiende que podrían existir otras complicaciones que las descritas en este
“Consentimiento” y que a pesar de las precauciones y esfuerzo de los “doctores” de
mantener al mínimo la posibilidad de efectos indeseables, estos pueden ocurrir y son de
naturaleza y gravedad impredecible.
2.- El “paciente” entiende que la información obtenida en este “Tratamiento” es
importante para los “doctores” y que debe mantenerse como confidencial en los
términos de ley. El “paciente” autoriza que los resultados del “tratamiento” sean
utilizados para publicaciones científicas, siempre y cuando su identidad no sea revelada
en esas publicaciones de literatura medica. El paciente también autoriza, en caso de
muerte, donar su cerebro al Dr. Levesque o a un instituto de investigación, para
incrementar el conocimiento sobre su enfermedad neurológica y el tratamiento con
células madre.
M: Otros alcances del “Consentimiento”:
1. Sí alguno del los alcances o restricciones de este “Consentimiento” son
invalidadas, no se cumplen o no pueden llevarse a cabo, el resto de los alcances
contenidos en le Acuerdo de Tratamiento permanecerán sin cambio y no pueden ser
modificados.
2. Asignación.- No habrá terceros beneficiados. Este “acuerdo” no puede ser
transferido, voluntaria o involuntariamente a ningún tercero sin el consentimiento
expreso y por escrito firmado por las “partes”. Este Consentimiento no confiere a
ninguna otra persona o entidad derecho alguno ó enmiendas a su contenido.
3. Seguro Adicional. Las “partes” llevaran a cabo cualquier otro documento que
fuese necesario y deseable para implementar el llevar a cabo el “Tratamiento”.
4. Leyes que lo Rigen (Acuerdo de Jurisdicción). ESTE CONSENTIMIENTO SE
LLEVARA A CABO Y SERÁ VIGILADO DE ACUERDO A LAS LEYES
VIGENTES EN EL ESTADO DE CALIFORNIA E.E.U.U. PARA LAS FASES I Y II
Y A LAS LEYES VIGENTES EN EL DISTRITO FEDERAL EN MÉXICO PARA
LA FASE III.
acuerdoConvenio” original.
6. Encabezados. Los encabezados intentan facilitar el referirse a un aspecto
particular, pero no deben controlar o cambiar el sentido o redacción de todos los
alcances del “Consentimiento”.
7. Integridad del “Consentimiento”. Este sirve para llegar a un acuerdo entre las
“partes” sobre el sujeto particular del “Tratamiento”. Concreta e incorpora todas y cada
una de las comunicaciones entre las “partes”, sean orales o escritas y no puede ser
cambiado o modificado excepto por un escrito firmado por ambas “partes”.
Dr. Michel F. Levesque.
Dr. Francisco Velasco
Investigador
Investigador
El Paciente
Testigo
Testigo
Para reportar eventos indeseables o solicitar información favor de comunicarse con:
Dr. Francisco Velasco Campos Tel: (5255) 56528661 Celular: (011 521) 55 16350104
e-mail slanfe@prodigy.net.mx fax (5255) 51353630