Download genotipado del scrapie ovino

GENOTIPADO DEL SCRAPIE OVINO: ADAPTACIÓN DEL MÉTODO DE
ANÁLISIS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS VARIANTES ALÉLICAS
(SHEEP GENOTYPED FOR SCRAPIE: ADJUSTMENT OF THE ANALYSIS METHOD
FOR THE IDENTIFICATION OF NEW ALLELIC VARIANTS)
PORTELA, C.; BOUZADA, J.A.; PRADO, C.; AREÁN, H.; FERNÁNDEZ, M.; LÓPEZ,
M.; FERNÁNDEZ, A. y VIANA, J.L.
Laboratorio de Xenética Molecular. Xenética Fontao S.A., Fontao-Esperante, Apdo 128.
27080 Lugo (España). xeneticafontao.agri@xunta.es xfontao@xeneticafontao.com
RESUMEN
Numerosas investigaciones realizadas en los últimos años han permitido detectar una serie
de posiciones polimórficas dentro de la secuencia del gen PRNP ovino, que codifica para la
proteína prión (PRP). Más de una veintena de estas mutaciones dan lugar a cambios en la
secuencia aminoacídica de la PRP. De todos estos polimorfismos, se ha prestado atención
especial a los que afectan a los codones 136, 154 y 171, ya que está descrita su relación con
la distinta susceptibilidad/resistencia de los ovinos a padecer Scrapie (Encefalopatía
Espongiforme Transmisible Ovina).
Los protocolos de genotipado empleados hasta el momento en la mayoría de los
laboratorios analizaban solamente cuatro posiciones polimórficas, la segunda posición de
los codones 136 y 154, y la segunda y tercera posiciones del codon 171, lo que permitía la
identificación de 5 haplotipos denominados ARQ, VRQ, AHQ, ARR y ARH.
En el presente trabajo se describen las modificaciones realizadas en el método de análisis
para la identificación de dos nuevas variantes alélicas, resultantes del polimorfismo
detectado en las primeras posiciones de los codones 136 y 171, y que se denominan TRQ y
ARK, respectivamente. Los análisis han sido realizados en animales inscritos en el libro
genealógico de la raza ovina Assaf, que gestiona la Asociación Española de Criadores de la
Raza Ovina Assaf (ASSAF.E).
PALABRAS CLAVE: scrapie, ovino, PRNP, haplotipos.
ABSTRACT
Numerous studies developed in the last years have allowed to detect different polymorphic
positions in the PRNP gene sequence, which codifies for the prion protein (PRP). More
than twenty of these mutations provoke changes in the PRP amino acid sequence. A special
attention has been paid to polymorphisms affecting the 136, 154 and 171 codons since it is
described their relation with the different sheep susceptibility/resistance to suffer Scrapie
(Sheep Transmissible Spongiform Encephalopathies).
At present, genotyping protocols used by most labs only analyze four polymorphic
positions (second nucleotide of 136 and 154 codons, second and third positions of 171
codon) allowing the identification of five haplotypes: ARQ, VRQ, AHQ, ARR and ARH.
In the current study, we describe the adjustment in the analysis method in order to detect
two new allelic variants, resultanting from the polymorphism detected in the first positions
of 136 and 171 codons, called TRQ and ARK, respectively. These analyses have been
realized in animals inscribed in the Assaf Sheep Breed Herdbook, which manages the
Breeders Spanish Association of the Assaf Sheep Breed (ASSAF.E).
KEY WORDS: scrapie, sheep, PRNP, haplotypes
INTRODUCCIÓN
La Tembladera o Scrapie es una Encefalopatía Espongiforme Transmisible (EET) que
afecta a ovejas y cabras, que fue descrita por primera vez hace más de 250 años y a la que
sólo muy recientemente se la ha prestado atención, debido a la alarma social generada, por
la posible transmisión al hombre de este tipo de enfermedades desde la especie bovina,
mediante ingestión de material infectado. La sintomatología incluye prurito,
hiperexcitabilidad, temblores, falta de coordinación en la marcha para acabar en parálisis y
finalmente producir la muerte del individuo. El desarrollo de la enfermedad presenta largos
periodos de incubación y da lugar a la degeneración progresiva del sistema nervioso central
que, en etapas avanzadas de la enfermedad, adquiere el característico aspecto
espongiforme.
En ovinos, se ha establecido la influencia del locus PRNP en la mayor o menor resistencia
de los animales a padecer la enfermedad. Este gen se ubica en el cromosoma 13 y da lugar a
una proteína de 256 aminoácidos (Castiglioni et al., 1998). En la tabla 1 aparecen descritos
algunos de los polimorfismos aminoacídicos detectados en esta proteína que han sido
descritos en la bibliografía (Clouscard et al., 1995; Belt et al., 1995; Bossers et al., 1996;
Hunter et al., 1996; Torisson et al., 1998; Thorgeirsdottir et al., 1999; Billinis et al., 2004;
Acín et al, 2004; Zhang et al., 2004; Acutis et al., 2004; Goldmann et al, 2005).
101
112
116
127
136
137
Salvaje
Q
M
A
G
A
R
T
P
A
V
V
T
Variantes
alélicas
Codón
S
138
141
143
M
S
L
H
T
N
F
R
R
151
154
167
168
171
R
R
G
H
172
174
175
R
P
S
L
Q
Y
Q
R
D
E
H
H
C
K
176
180
189
195
196
211
241
Q
N
H
G
T
E
K
T
L
S
T
R
P
S
Q
S
Y
R
De todos estos polimorfismos, los que afectan a los codones 136, 154 y 171 son los que se
han descrito como más relacionadas con el grado de padecimiento de la enfermedad. En los
últimos años, la gran mayoría de los laboratorios han estado realizando un sistema de
análisis que permitía genotipar, únicamente, la segunda posición nucleotídica de los
codones 136 y 154, y la segunda y tercera posiciones del codón 171, mediante una técnica
denominada “primer extension analysis" (Syvanen, 1999; Sauer et al., 2000), lo que daba
lugar a la identificación de 5 haplotipos denominados, respectivamente, ARQ, VRQ, AHQ,
ARR y ARH. Con esos datos, se ha establecido que, en general, los animales ARR/ARR
son los más resistentes y los VRQ/VRQ son los más sensibles a padecer la enfermedad
(Dawson et al., 1998).
Utilizando este mismo protocolo, en el laboratorio de Xenética Molecular de Xenética
Fontao, S.A., se han detectado animales, en los cuales la señal de lectura correspondiente al
alelo salvaje, de la segunda posición del codón 171, aparecía con un tamaño
considerablemente menor en homocigosis y apenas perceptible cuando aparecía en
heterocigosis. El fragmento del gen, donde están incluidas las posiciones polimórficas
motivo de análisis, fue secuenciado, detectando con ello la existencia de un polimorfismo
en la primera posición del codón 171. Este polimorfismo ya aparecía citado en la
bibliografía pero no había sido incluido, hasta el momento, en los análisis más
habitualmente llevados a cabo. El alelo al que da lugar se denomina ARK (aparece el
aminoácido Lisina en lugar del Glutamina). A consecuencia de ello, surge por un lado la
necesidad de modificar el protocolo de análisis para poder genotipar este tipo de animales
de manera inequívoca y, posteriormente, incluir todas las posibles combinaciones de este
alelo en las tablas de los grupos de riesgo de padecer la enfermedad que actualmente se
usan y que condicionan los esquemas de selección de los animales.
En el presente trabajo se describen las modificaciones realizadas en el método de análisis
para la identificación de dos nuevas variantes alélicas, resultantes del polimorfismo descrito
en las primeras posiciones de los codones 136 y 171, denominadas TRQ y ARK,
respectivamente. Los análisis han sido realizados en animales inscritos en el libro
genealógico de la raza ovina Assaf, que gestiona la Asociación Española de Criadores de la
Raza Ovina Assaf (ASSAF.E).
MATERIAL Y MÉTODOS
Material Biológico: Se han analizado un total de 1391 animales machos pertenecientes a 55
ganaderías de la Asociación de Ganaderos de la raza Assaf (ASSAF.E). Las muestras
utilizadas consistieron exclusivamente en sangre entera usando EDTA K3 como
anticoagulante, extraídas y remitidas al laboratorio por técnicos de la Asociación.
Extracción de ADN: Se llevó a cabo utilizando la 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied
Biosystems), siguiendo el protocolo de extracción BloodPrepTM Chemistry y usando los
reactivos recomendados por el fabricante. Previo a la extracción, las muestras de sangre se
congelan a -80oC durante un mínimo de 10 minutos, para provocar la lisis celular y facilitar
la liberación del ADN. Posteriormente, se incuban en estufa a 58oC durante 30min, 50µl de
la muestra añadiendo 15µl de Proteinasa K y 85µl de Buffer de Digestión. Tras la
incubación se añaden 600µl de Solución de Purificación, y se procede con el protocolo de
extracción, en el que se realizan pasos consecutivos de purificación y lavado para eliminar
los restos celulares, para acabar recogiendo el ADN mediante dos soluciones de Elución.
Genotipado: Se llevó a cabo mediante la técnica denominada “primer extension analysis”
(Syvanen, 1999 y Sauer et al., 2000) usando el ABI PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit de
Applied Biosystems, lo que permitió analizar, de forma simultánea, las 4 posiciones
polimórficas que condicionan los 3 codones citados. La PCR inicial se ha llevado a cabo
usando los siguientes cebadores: 5’-TCAAGGTGGTAGCCACAGTCAGT-3’ y 5’CCACTCGCTCCATTATCTTGATGT-3’ lo que da lugar a la amplificación de un
fragmento de 356bp del exón III (entre las bases 353 y 708 del ORF) y que incluye las 4
posiciones nucleotídicas cuyo polimorfismo se desea estudiar. Las defosforilaciones y las
reacciones de “primer extensión" se realizaron según los protocolos que acompañan al ABI
PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit de Applied Biosystems. La modificación del protocolo
de análisis desarrollada en este laboratorio consiste en la inclusión, en la reacción de
“primer extensión”, de dos nuevos cebadores que permiten analizar, adicionalmente a las 4
posiciones anteriores, la primera posición de los codones 136 y 171 y que, por lo tanto,
permiten poner de manifiesto los alelos TRQ y ARK. Los resultados obtenidos fueron
visualizados mediante una electroforesis capilar en un 3130xl Genetic Analyzer de Applied
Biosystems y la posterior lectura se llevó a cabo usando el software Genemapper® .
Secuenciación de ADN: Fue llevada a cabo por el Servicio de Secuenciación de ADN de la
empresa Sistemas Genómicos, S.L. de Paterna (Valencia).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos para los 7 haplotipos analizados en el
gen PRNP en los animales de la raza ovina Assaf. Se han analizado un total de 1391
animales y se han encontrado 16 genotipos diferentes de los 28 posibles para los haplotipos
analizados. Se han encontrado 6 alelos diferentes ya que no ha aparecido ningún animal con
el alelo TRQ. El Alelo ARK ha sido encontrado tanto en homocigosis como en
heterocigosis con los demás alelos existentes en los animales analizados hasta el momento.
Tabla 2. Frecuencias genotípicas y alélicas en el gen PRNP en los animales de la raza
ovina Assaf analizados.
Frecuencias Genotípicas
Genotipos
Total
Frecuencias Alélicas
Frecuencia
Alelo
Frecuencia
AHQ/AHQ
5
0,00359
ARQ
0,45327
AHQ/ARH
6
0,00431
ARR
0,37383
AHQ/ARK
7
0,00503
ARH
0,07441
ARH/ARH
9
0,00647
AHQ
0,05715
ARH/ARK
19
0,01366
ARK
0,04098
ARK/ARK
7
0,00503
VRQ
0,00036
ARQ/AHQ
82
0,05895
TRQ
0,00000
ARQ/ARH
97
0,06973
ARQ/ARK
39
0,02804
ARQ/ARQ
267
0,19195
ARR/AHQ
54
0,03882
ARR/ARH
67
0,04817
ARR/ARK
35
0,02516
ARR/ARQ
509
0,36592
ARR/ARR
187
0,13444
ARR/VRQ
1
0,00072
Total
1391
Los resultados obtenidos señalan a los alelos ARQ y ARR como los más frecuentes en los
animales analizados, siendo el primero alrededor de un 8% más frecuente que el segundo.
Esta sería una situación intermedia entre lo que ocurre en las razas autóctonas españolas, en
las que el alelo ARQ es claramente el más frecuente (sobre un 70%) y las razas ovinas
explotadas en nuestro país pero no originarias de España (53,05% para ARR y 39,55% para
el ARQ). La frecuencia encontrada para los alelos ARH y AHQ es algo más elevada que las
observadas en otras razas explotadas en España, y la frecuencia del alelo VRQ resultó ser
considerablemente más baja en los animales analizados en este trabajo (Villalobos y Barba,
2003; Bouzada et al., 2004; Viana et al., 2004; Viana et al., 2005).
El alelo ARK ha sido encontrado en estudios llevados a cabo con ovinos de distintas zonas
del mundo, en Oklahoma (Desilva et al., 2003), en España (Acín et al., 2004), en Italia
(Acutis et al., 2004) o en Grecia, aunque la frecuencia del alelo ARK en estos estudios es
considerablemente menor al 4,1% encontrado en los animales de raza Assaf analizados.
Hasta el momento no se dispone de datos concluyentes en cuanto al grado de
susceptibilidad/resistencia de los animales portadores del alelo ARK frente a la
enfermedad. Por lo tanto, en el grupo de animales analizados en el presente trabajo se han
encontrado 107 animales (7,69% de los analizados), de los que no se dispone de
información real sobre el riesgo a padecer Scrapie.
Tabla 3. Frecuencia de los distintos grupos de riesgo en la raza ovina Assaf.
Grupos
R1
R2
R3
R4
R5
Sin Clasificar
Genotipos
ARR/ARR
ARR/AHQ y AHQ/AHQ
ARR/ARH, ARR/ARQ y ARQ/AHQ
AHQ/ARH, ARH/ARH, ARQ/ARH,
ARQ/ARQ AHQ/VRQ y ARR/VRQ
ARQ/VRQ, ARH/VRQ y VRQ/VRQ
ARK/ARK, ARR/ARK, ARQ/ARK,
AHQ/ARK, ARH/ARK
Nº animales
187
59
658
Proporción (%)
13,44
4,24
47,30
Susceptibilidad
Muy bajo riesgo
Bajo riesgo
Bajo riesgo
380
27,32
Riesgo ocasional
0
0,00
Alto riesgo
107
7,69
Desconocida
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