Download Gen PHEX - Hospital Italiano

Raquitismo Hipofosfatémico
Familiar y Esporádico
Clínica y Hallazgos Moleculares
Alonso G, Plantalech L, Guelman R, Gonzalez S,
Redal MA, Casinelli H, Pasqualini T
Sección de Endocrinología, Servicio de Pediatría
Sección Osteopatías Metabólicas, Servicio de Endocrinología
Unidad de Medicina Molecular y Genética
Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental
HOSPITAL ITALIANO DE BUENOS AIRES
División Endocrinología
HOSPITAL DE NIÑOS RICARDO GUTIERREZ
Introducción
El Raquitismo y Osteomalacia Hipofosfatémico (RH)
es la causa más frecuente de formas heredables.
Se describen 4 formas genéticas de RH
• RH ligado al X (XLRH) alteración PHEX
• RH autosómico dominante (ADHR) alter FGF23
• RH asociado a hipercalciuria (HCRH) alter SLC3A3
• RH autosómico recesivo (ARRH) alteración DMP1
• La forma más frecuente es el XLRH
• Incidencia : 1/20 000 RN
XLRH y gen PHEX
Localizado Xp22.1
Sintetiza proteína metaloproteasa, glicoproteína de membrana de 770 aa
Mutaciones inactivadoras, se describen >160 (www.phexdb.mcgill.ca )
Gen FGF23 (ADRH)
• 12p13.3
• Se expresa en osteoblastos y
odontoblastos
• FGF 23 prot 251 aa
• Mutación “missense”
• En uno o dos residuos de
arginina en posiciones: 176 o
179
• Sitio de clivaje
• Mutación “activante” de
función del FGF23
Objetivos
• Evaluar el genotipo de la población
• Establecer las características fenotípicas
• Relacionar genotipo con fenotipo
Población
• Se analizaron 13 familias
• Se evaluaron 29 casos (5 esporádicos) que
procedían de familias con diverso grado de
afectación :
Total
Miembros afectados
Familias
1
5
2
2
3
4
4
2
29
13
E
F
Población
• Se incluyeron pacientes con
• Raquitismo u osteomalacia
por clínica y radiología
• Calcemia Normal /calciuria
normal
• Hipofosfatemia
• Hiperfosfaturia
• Incremento de la fosfatasa
alcalina
Población
• Todos los pacientes fueron diagnosticados en la
infancia excepto 7 casos (2 con manifestaciones
clínicas y 5 con bioquímica alterada).
• Se clasificó el fenotipo en
• Leve : bioquímica y escasa manifestación
somática
• Moderado: talla normal o baja, genu varum sin
cirugía correctora, abscesos dentarios,
osteomalacia en la adultez
• Grave : talla muy baja, genu varum, osteotomía
correctora
Métodos
• Se extrajo ADN de sangre periférica
• Se analizaron las mutaciones
• Gen FGF 23 por secuenciación directa con
primers de secuencia específica para el exón 3
del gen para detectar mutación en
R176Q (527G/A) y R179W (535C/T).
• Gen PHEX ( 22 exones y regiones linderas)
mediante SSCP/HD y secuenciación directa
bidireccional de las regiones con patrón de
bandas alterado.
Metodologia Molecular
Extracción de 10ml de sangre periférica
Extracción de ADN
Amplificación de los exones e intrones adyacentes por PCR
mediante primers especificos de secuencia.
Se verificaron los productos de PCRs por medio de
electroforesis al ser corridos en geles de agarosa al 2 %.
Gen FGF23
Gen PHEX
Búsqueda de mutaciones pequeñas en los exones por
electroforesis en geles de poliacrilamida
•SSCP (polimorfismo conformacional de hebra simple)
•HD (heteroduplex)
Análisis por secuenciación
SSCP {
Análisis por secuenciación
Heteroduplex
→
Heteroduplex
→
{
{
Homoduplex salvaje
Homoduplex
mutado
Resultados
Casos familiares I
Familia
Paciente
Sexo
Edad Diag
Herencia
Fenotipo
Genotipo
I
1
F
1.7 años *
AD
M
FGF23
I
2
F
Adulto
AD
L
FGF23
I
3
M
Infancia
AD
L
FGF23
I
4
F
Adulto
AD
M
FGF23
II
1
M
2.0 años *
XL o AD?
G
-
II
2
M
1.1 años
XL o AD?
G
-
II
3
F
Infancia
XL o AD?
G
-
III
1
M
2.O años*
XL
G
PHEX
III
2
F
Infancia
XL
G
PHEX
IV
1
M
O.8 años*
XL
G
PHEX
IV
2
F
Infancia
XL
G
PHEX
IV
3
F
Infancia
XL
G
PHEX
Casos familiares II
Familia
Paciente
Sexo
Edad diag
Herencia
Fenotipo
V
1
F
3.3 años*
XL
M
V
2
F
48 años
XL
L
V
3
F
19 años
XL
L
V
4
M
22 años
XL
L
VI
1
F
2 años*
XL
G
VI
2
F
1 año*
XL
M
VI
3
F
Infancia
XL
G
VII
1
F
1,4 años*
XL
G
VII
2
F
50 años
XL
L
VIII
1
F
5 años*
XL
G
VIII
2
F
1 año
XL
G
VIII
3
F
Infancia
XL
G
Casos esporádicos
Familia
Paciente
Sexo
Edad diag
Herencia
Fenotipo
Genotipo
IX
1
F
1,5 años
?
G
-
X
1
M
1.0 años
?
G
-
XI
1
F
2.0 años
?
M
PHEX
XII
1
F
1,7 años
?
M
-
XIII
1
F
28 años#
?
G
PHEX
Presentación clínica (casos)
PHEX G: 63% / M: 21% / L: 16%
FGF 23 G: 0% / M: 50% / L : 50%
# presentación post parto
Ca Normal baja/ cau normal
Hipofosfatemia
Hiperfosfaturia
Hiperparatirodismo
1,25(OH)2D3 indosable
F alc incrementada
Tipo de presentación y sexo
% casos
% casos
Relación
♀/♂ : 3,4 /1
DIAGNOSTICO EN LA INFANCIA EN EL 75.8%
Distribución del genotipo
según caso Familiar o Esporádico
Esporádico
Familiar
Resultados: análisis de FGF23
Familia I
• FGF23: mutación
• sin sentido en 4
miembros
• Exon 3: c.536 G >A,
R179Q
4
2
1
3
Alteraciones del PHEX biología molecular
Familia
Exón
cADN
Mutación
Herencia
III (Ortiz)
I 3-4
c. 552. +1insG
Splicing alterado
F
IV (Coronel)
E3
c. 401 C >A
Mut. Silenciosa
F
V (pellegrini)
E2
p 180 T>C
c.378 T>C
Cis. >Arg.
F
VI (fernandez V)
E 21
c. 2341delC
Frame shift
F
VII Arduengo
E9
p 105 C>G
c.1241 C>G
Codon stop
F
VIII (escortTub)
E8
E8 + E13
p 41 -1 G>A
c.1053 - 1G>A
Del T
c.1136 +41 A>G
Splicing alterado
F
XI (Blanco)
E 20
p 53 T>G
c.2260 T>G
Mut. Silenciosa
E
XIII (Candia)
E8
c. 1136.
+41A>G
Splicing alterado
E
Mutaciones halladas
E9
p 105 C>G
E2
p 180 T>C
Inser+1G
I 3-4
E3
p 11 C>A
E8
p 41 -1 G>A
E8
p 41 A>G
E13
Del T
E 21
p 89 Del C
E 20
p 53 T>G
Posición de las mutaciones
según frecuencias
PHEXdb@mcgill.ca +Gaucher et al Human Gent 2009
Familia III
ins G p +1 en intrón 3-4 sitio de splicing
Familia IV
E 3 p 11 G>T Mut silenciosa
Familia VII
Familiar
exón 9 p 105 C>G codon stop
Familia XI
Esporádico
mutacion silenciosa T > G en posic93 exón 20.
Conclusiones
• Se detectaron mutaciones del PHEX en la
mayoría de los casos especialmente en los
familiares.
• Describimos 4 nuevas mutaciones del gen
PHEX (PHEX db.mcgill.ca).
• Los fenotipos de mayor gravedad se asociaron
con mutaciones en PHEX.
Conclusiones
• El ADRH presentó una forma menos grave y
de variable manifestación entre los miembros
de la familia.
• La evaluación genética en las formas clínicas
esporádicas y tardías puede detectar
mutaciones del PHEX.
• Su detección descarta otras enfermedades
como tumores inductores de osteomalacia
que son de lenta expresión clínica.
Conclusión final
• El estudio molecular del PHEX y FGF 23 es una
herramienta útil para establecer diagnóstico,
pronóstico y consejo genético para los
pacientes y su descendencia.