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Sondas moleculares
Técnicas de marcado
no radioactivo
Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana
Universidad Nacional de Quilmes
Sondas moleculares

Fragmento de DNA o RNA (marcado) de tamaño variable (100 a
1000 nt) utilizados para detectar la presencia de secuencias
blanco mediante su apareamiento específico.
Sondas moleculares

Aplicaciones




Identificar clones específicos en bibliotecas genómicas y
de cDNA (Dot blot, Slot blot).
Definir la ubicación de regiones específicas de DNA
genómico (Southern blot).
Analizar la transcripción y el procesamiento de RNA
(Northern blot, mapeo de transcriptos con nucleasa S1,
RPA).
FISH (fluorescence in situ hibridization) y Microarray.
Hibridación de ácidos
nucleicos
BLANCO
SONDA
DNA o RNA
inmovilizado en
una membrana
DNA o RNA
marcado
(generalmente derivado de
una construcción genética)
Hibridación
Blanco: desconocido. Fase sólida
Sonda: conocida. Fase móvil
Marca de la sonda
Marca de la sonda
Marca de la sonda
Marca no radioactiva

Nucleótidos acoplados a moléculas (Digoxigenina, Biotina,
Fluorocromo, Cromógeno, entre otras) o enzimas
(Peroxidasa, Fosfatasa alcalina, entre otras).

Para obtener la sensibilidad equivalente a la que se
obtiene con una marca radioactiva, se utilizan enzimas que
amplifican la señal generada.
Marca no radioactiva

Digoxigenina (DIG): esteroide hallado únicamente
en flores y hojas de la planta Digitalis purpurea,
Digitalis orientalis y Digitalis ianata.

Biotina: conocida como vitamina H o B7. Es
necesaria para el crecimiento celular, la
producción de ácidos grasos y participa en la
generación de energía bioquímica durante la
respiración aeróbica, entre entras funciones.

Fluoresceína: Compuesto orgánico sintético
disponible como un polvo naranja-rojo soluble en
agua y alcohol.
Marca no radioactiva
Marca no radioactiva
Técnicas moleculares para generar
sondas
En general, las técnicas más utilizadas para el marcado de sondas no
radioactivas están basadas en metodologías que involucran síntesis de
. ácidos nucleicos.
Polimerasa
Nucleótidos
Requerimiento
DNApol-DNAdep
DNApol-RNAdep
dNTPs
Oligonucleótido
con 3´OH libre
RNApol-DNAdep
rNTPs
Secuencia
promotora
Técnicas moleculares para generar
sondas

Nick translation

Primer extension

Multipriming

Fill-in

PCR

Transcripción in vitro
Técnicas moleculares para generar
sondas
Técnica
Polimerasa
Nucleótidos
Iniciador
Sonda
Nick translation
DNApolI
dNTP´s
Molde
DNA
Multipriming
Frag. Klenow
dNTP´s
Hexámeros
DNA
Fill-in
Frag. Klenow
dNTP´s
Molde
DNA
PCR
Taq pol
dNTP´s
Primer específico
DNA
Primer extension
Frag. Klenow
dNTP´s
Primer específico
DNA
Clonado M13
DNApolI
dNTP´s
Primer del vector
DNA
Transcripción
RNApol
rNTP´s
Secuencia
promotora
RNA
.
Técnicas moleculares para generar
sondas
Utilización de kits comerciales


ARES DNA labelling kits: Método en dos pasos.

Incorporación de una amina modificada al DNA (mediante polimerización, transcripción
reversa, nick translation, y otros)

Marcado químico de la amina modificada usando un colorante comercial (Alexa Fluor
dye). Para FISH y Microarray.

Biotin DecaLabelTM DNA labelling kits

Síntesis de DNA marcado con Biotina. Utiliza random primers (10 bases) y Klenow para
incorporar nucléotidos marcados en la cadena sintetizada. La sonda puede ser detectada
utilizando cualquier sistema biotina-avidina, biotina-streptavidina.

Alkphos direct:

Utiliza la enzima fosfatasa alcalina. Une la enzima a los nucleótidos tanto de DNA como
de RNA. Mide la generación de producto mediante colorimetría o mediante
quimiofluorescencia.

ULYSIS Nucleic acid labelling kits

Utiliza un colorante de platino que forma una unión estable con la posición N7 de
guanina. La reacción lleva 15 minutos y la separación de las moléculas marcadas de las
no marcadas se realiza mediante la utilización de una columna cromatográfica.
Técnicas moleculares para generar sondas
ARES DNA labelling kits
Técnicas moleculares para generar sondas
ULYSIS Nuclei acid labelling kits
Marca no radioactiva

Fosfatasa alcalina: es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de
fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides.

Puede ligarse a nucleótidos, y luego se detecta su presencia mediante quimioluminiscencia
(5-10 ng/ml) o colorimetría (50 ng/ml).

Puede utilizarse para marcar oligonucleótidos mayores a 50 pb.

Se utiliza para marcar fragmentos de DNA y de RNA.

CDP-Star utiliza la enzima unida al nucleótido para catalizar la descomposición dioxetano,
utilizado como sustrato de dicha reacción.
ECF se utiliza junto con un instrumento para escanear fluorescencia.
NBT/BCIP se utiliza como reactivo de detector de color.


Marca no radioactiva

Marcadores de quimioluminiscencia: miden la generación de peróxido de
hidrógeno (H2O2).

Luminol y derivados, es una diacilhidracida cíclica. La reacción requiere la
presencia de un oxidante fuerte (H2O2, ClO- o MnO4) y de un catalizador (cu2+, Fe2+
o el grupo Hemo).

Ester de acridina, es mejor que el luminol, ya que la reacción se produce sólo con
la presencia de H2O2 en un medio alcalino.

Lucigenina, Emite luz cuando tiene lugar la reacción de oxidación por el peróxido
de hidrógeno en una solución básica y en presencia de iones metálicos
catalizadores como Pb2+.