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Filogenia del virus Dengue tipo 2 aislados en Colombia
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Iván Sebastián Quintero –Rangel
1. Escuela de Biología, Universidad Industrial de Santander, Colombia
Introducción
El virus del dengue (DENV) es un virus encapsulado de ARN de una sola cadena de
sentido positivo, es aproximadamente 10700 bases de longitud y contiene un solo marco
de lectura abierto, dentro de la familia Flaviviridae, género Flavivirus.
Los virus del Dengue existen como cuatro serotipos antigénicamente diferentes: DENV-1,
DENV-2, DENV-3 y DEN-4 [5]. El genoma codifica tres proteínas estructurales y varias no
estructurales en el siguiente orden: 5'-C-prM-E-Ns1-Ns2a-Ns2b-Ns3-Ns4a-Ns4b-Ns5-3'.
Estudios filogenéticos de cepas de DENV en humanos han demostrado que cada serotipo
se organiza como grupos discretos de virus [13], se han confirmado cinco genotipos
principales del serotipo DENV-2 basado en la secuencia total del gen E: (i) genotipo de
Asia [9], lo que representa cepas procedentes de Malasia, Tailandia y cepas procedentes
de Vietnam, China, Taiwán, Sri Lanka y Filipinas; (ii) el genotipo cosmopolita [9], cepas
representativas de amplia distribución geográfica, incluyendo Australia, África Oriental y
Occidental, el Pacífico y las islas del Océano Índico, el subcontinente indio y el Medio Este,
(iii) el genotipo americano [9], en representación de las cepas de América Latina y un gran
número de cepas de la colección del caribe, el subcontinente indio y las Islas del Pacífico
entre los años 1950 y 1960, (iv) el genotipo del sureste de Asia / América [9], que
representan las cepas procedentes de Tailandia, Vietnam y las cepas de la colección en las
Américas durante los últimos 20 años, y (v) el genotipo silvestre, las cepas recogidas de los
mosquitos del bosque o monos centinela en el oeste de África y el sudeste asiático (Lewis
et al, 1993;. [9, 16, 18].
El dengue es una enfermedad humana causada por arbovirus que causa enfermedad y
muerte. Se estima que 50-100 millones de infecciones por DENV se producen cada año en
las regiones tropicales y subtropicales, donde más de 2,5 millones de personas están en
riesgo [22].
Metodología
El análisis filogenético fue realizado a partir de 31 cepas del serotipo DENV-2, y seis
outgroups DENV-1 (V1/BIDV1134 y V1/BIDV1135), DEN-3 (V3/BIDV904 y V3/BIDV906) y
DENV-4 (C4/BIDV1600 y V4/BIDV1158) genotipos descritos previamente [7]. Se utilizaron
secuencias moleculares completas de los genes prM/M, E, Ns1, Ns2a y Ns3 [1],
descargadas de GenBank (Tabla1.). Se aplicó un análisis de sensibilidad explorando
combinatorias de tres valores de costos para la proporción transición / transversión y gaps
(utilizando relaciones: igual y el doble) (Tabla 2.) y se seleccionó costo más adecuado,
utilizando como indicador el índice de incongruencia de Farris “ILD” (1985), e
implementando el Sofware POY 4.1.2 [17], utilizando un build =10. (Tabla 3.a y b). Sin
embargo, se tomaron los cinco ILD menores y con cada uno se construyó nuevamente un
alineamiento pero esta vez mejorando la búsqueda con un build=100, de esta manera,
finalmente se eligió el menor valor de ILD [20, 21].
Para evaluar los soportes de los nodos en la topologías de parsimonia, en evidencia total,
se hallaron los valores de soporte Bremer relativo [2] y Bootstraps de 500 réplicas,
mediante TNT [3, 4], En el soporte Bremer se utilizaron árboles subóptimos hasta 882
pasos más largo y un espacio de 10 000 árboles en la memoria.
Las secuencias iniciales de los genes fueron alineadas en el programa Muscle 3.6 [14],
utilizando los parámetros por defecto, se determinó el modelo evolutivo para cada uno de
los genes según el criterio Akaike [11,12] en JModeltest 0.1.1 [12], los modelos sugeridos
fueron analizados en PhyML 3.0 [6], utilizando Máxima Verosimilitud (ML), con una
estrategia de búsqueda de la topología basada en algoritmos NNI y SPR y límites de
confianza (Bootstraps), el soporte de los nodos fue evaluado con bootstraps de 100
réplicas. Finalmente, se llevó a cabo un análisis de inferencia Bayesiana MCMC para la
evidencia total, en el software MrBayes 3.1 [8] efectuando la búsqueda con 2´000.000 de
generaciones, una cadenas y una frecuencia de muestreo cada 1000 generaciones [10].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El resultado del análisis de sensibilidad de acuerdo con el índice de incongruencia de
Farris reveló que la interacción de costos óptima fue 12233 (Tabla 3a y b), donde el costo 1
fue óptimo para el gen prM/M; el costo 2 para los genes E y Ns1 y el costo 3 para los
genes Ns2a y Ns3. Para la evidencia total se obtuvo un árbol de una longitud de 9846
pasos, algunos nodos presentaron valores altos de soporte bremer (Figura 1.). Se
evidencian politomías, lo que conlleva a la no resolución de las relaciones filogenéticas de
la especie para algunos clados.
En todos los sistemas de costos utilizados en las optimizaciones de parsimonia en
evidencia total, se recuperaron en general los mismos cladogramas con diferentes niveles
de resolución. La alineación, para cada esquema de costos proporcionó un número
diferente de gap. La alineación obtenidos con Muscle v3.7 para el gen prM/M fue de 487 nt,
en relación a 463 nt, de la longitud del gen, del gen E la relación fue de 1496/1485 nt, del
gen Ns1 de 1056/1056 nt, gen Ns2a de 726/652 nt, y del gen Ns3 de 1858/1854 nt.
Basados en genética, sugiere que el gen Ns1 no presenta gaps en los bloques alineados,
mientras que los demás genes presentan número diferente de gaps.
Los modelo evolutivos que obtuvieron el mejor ajuste a los datos, fueron: gen prM/M
distribución GTR +G [15]. Con un parámetro de forma de valor G= 0.2680. Para el gen E
distribución GTR +G+I con valores G=0.7680 y un parámetro de Invariantes con valor pInv. =0.2980. El gen Ns1 distribución GTR + G +I con valores de G= 1.6120 y p-Inv.
=0.4560, el gen Ns2a distribución GTR +G con valor G =0.7530 y el gen Ns3 con
distribución GTR +G +I con valores de G =1.5460 y p-Inv.= 0.4560. Los valores indicados
muestran que en los genes prM/M y Ns2a, los sitios fueron invariables, pero tenían altas
tasas de sustitución. Y los genes E, Ns1 y Ns3 muestra que los sitios fueron variables, y
tenían altas tasas de sustitución.
Las estimaciones de las relaciones filogenéticas bajo el criterio de Máxima Verosimilitud
señalaron topologías más resueltas en comparación con los análisis de máxima
parsimonia; bajo esta aproximación el nodo que separa los serotipos DENV-1, 3 y 4 del
serotipo DEN-2 está fuertemente soportado (valores de bootstraps =100 pata todas las
secuencias moleculares) (Figuras 2-6), lo cual sugiere que las topologías generadas a
partir de los modelos seleccionados, explican un evento evolutivo de monofilia para el
grupo.
Las relaciones filogenéticas bajo el criterio de ML señalaron que las cepas aisladas en
Colombia se muestran agrupadas con DENV-2 de América Latina (Nicaragua, y
Venezuela) previamente clasificadas en el genotipo (iv) [9], y Asia (Viet Nam, Tailandia y
Nueva Guinea) previamente clasificados en el genotipo (i) [9]. (Figuras 2-6).
Las cepas del serotipo DEN-2 se subdividieron en cinco clados de la siguiente manera: (i)
Genotipo Asiático [9], cepas de Viet Nam, Tailandia, Nueva Guinea y Colombia
(C/BIDV1598, C/BIDV1599); (ii) Genotipo Cosmopolitan [9]. Taiwán, Australia, Indo y
Singapur; (iii) Genotipo Americano [9]. Puerto Rico, Tonga, Venezuela, Perú y México; (iv)
Genotipo del sureste de Asia / América [9]. China, Jamaica, Cuba, Martinica, Nicaragua,
Venezuela y Colombia (C/BIDV1595, C/BIDV1601, C/BIDV1594, C/BIDV1596 y
C/BIDV1603); (v) Genotipo Selvático [9, 16, 18]. Malacia, Cote dIvoire y Senegal (Figuras
2 y 6).
El análisis de inferencia bayesiana obtenido para Evidencia Total, representó topologías
similares al análisis de Máxima Verosimilitud, asignando valores altos de probabilidad
posteriori en la mayoría de los clados. No obstante se evidencia la separación de la cepa
AF119661/C de China, del clado iv, (Genotipo del sureste de Asia / América), formando un
clado independiente. Figura 7.
CONCLUSIÓN
Las relaciones filogenias estimadas para el serotipo DENV-2 bajo los criterios de Máxima
Parsimonia, Máximo Likelihood y Análisis Bayesiano reflejan que el DENV-2 representa un
grupo monofilético dados los altos valores de Bootstraps y soporte Bremer para el nodo
que separa los serotipos DENV-1, 3 y 4 del serotipo DENV-2 .
Los serotipos de DENV-2 estudiados en este estudio se agruparon en cinco genotipos,
que corresponden con los reportados [9, 16, 18]. Grupos monofiléticos en términos de país
no se identificaron, como se observa en estudios previos [19]. Las cepas aisladas en
Colombia incluidas en este estudio no se agrupan en un clado distinguible.
Futuras recomendaciones podrían ser aumentar el valor de bootstraps, con el fin de
disminuir el límite de confianza con respecto a relaciones filogenéticas del serotipo DENV2.
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