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Regeneración y plasticidad en el
Sistema Nervioso
Dra. Graciela Gudiño Cabrera
Laboratorio de Desarrollo y Regeneración
Neural
Funciones de nuestro Sistema Nervioso:
Coordina y controla todos los procesos que ocurren
en nuestro cuerpo
Comemos
Respiramos
Pensamos
Recordamos
Aprendemos
Imaginamos
Nos emocionamos
Gozamos
Elementos Celulares del
Sistema Nervioso
Neuronas
100 mil millones de
neuronas
Sistema Nervioso Central
(SNC)
Sistema Nervioso
Periférico (SNP)
Tipos de glía
1-5 billones de células gliales
SNC
Oligodendrocitos
Astrocitos
Protoplasmáticos
Fibrosos
Glía Radial
Glía envolvente de bulbo olfatorio
(ensheathing cells)
Tanicitos
Pituicitos
Células intersticiales de la pineal
Glía de Müller
Glía de Bergmann
Microglía
SNP
Células de Schwann
Funciones de las células
gliales
a) Suministrar factores de crecimiento.
b) Regular la concentración de iones y metabolitos.
c) Participar en el metabolismo de neurotransmisores.
d) Eliminar restos celulares.
e) Regulan y coordinan los
contactos neuronales.
Plasticidad Neural:
Se describe como la capacidad del sistema nervioso
para modificarse en respuesta a presiones ambientales,
lesiones o modificaciones en el estado interno del
organismo.
Para mediar las respuestas adaptativas, los
circuitos nerviosos (las sinapsis), permanecen modificables
durante la vida entera del organismo.
Aprendizaje y memoria
Lesiones del Sistema
Nervioso
La capacidad de regeneración de una neurona
lesionada depende de dos tipos de factores:

Factores intrínsecos a la neurona en sí, dependientes
generalmente de su estadio de desarrollo

Factores extrínsecos, dependientes fundamentalmente
de
moléculas
producidas
por
otras
células,
generalmente gliales, o de interacciones directas con otras
células.
En respuesta a una lesión :
En Reptiles:
En mamíferos:
Sistema Nervioso Periférico
(SNP)
Regeneración
Sistema Nervioso Central
(SNC)
NO HAY
Regeneración
La plasticidad del SNC está fundamentalmente dirigida a potenciar
los procesos de aprendizaje y memoria.
Regeneración: Obstáculos
y Soluciones
Muerte neuronal
secundaria
Formación de cicatriz glial:
(proteoglicanos, semaforinas,
efrinas)
Presencia de moléculas
inhibidoras: Nogo y MAG
Células inflamatorias
Factores
neurotróficos: NGF,
BDNF, GDNF, NT3,
Neuregulinas etc.
Transplante celular: Células de
Schwann, glía envolvente, tejido fetal,
células progenitoras, células
genéticamente modificadas,
células madre, etc.
Bloqueo de la
inhibición: a-Nogo
Anti-inflamatorios
Lesiones del Sistema Nervioso
Periférico
Las lesiones del SNP producen degeneración axonal, La capacidad
de regeneración de los nervios periféricos, depende del
microambiente creado por las las células de Schwann.
Proteinas neuritogénicas.
Células de Schwann producen factores de crecimineto y de
adhesión, que promueven y estimulan la regeneración de los axones
dañados.
Epidemiología de las lesiones de la Médula Espinal
 Incidencia anual de la Lesión de Médula Espinal en
México es de 18.1 por millón de habitantes.
Ocurre con más frecuencia en hombres en edad productiva (16 a 35 años de
edad) (Estrada Sandino y cols., 2007).
Lesiones de la Médula Espinal
8 Cervicales
 La lesión completa de la ME
es caracterizada por una
interrupción de las vías
nerviosas ascendentes y
descendentes medulares.
12 Toráxicas
5 Lumbares
5 Sacros
 La pérdida de las vías
axonales
ascendentes y
descendentes
da
como
resultado una parálisis
y
perdida de la sensación por
debajo del nivel de la lesión
(Lannotti y cols., 2002)
1 coccigeo
Lesión Secundaria de la Médula Espinal
 Exitotoxicidad, liberación de
neurotransmisores (glutamato)
que facilita el influjo de Ca++ a
la célula
 Liberación de radicales libres,
superóxidos y oxido nítrico
Sustancia gris
Axón dañado Cicatriz glial
Zona de daño
primario
 Isquemia
 Necrosis y degeneración de la
mielina
Sustancia blancaExtensión de
Cavidad
Lesión debido a el daño
secundario
 Edema e inflamación
 Muerte neuronal secundaria
Mielinización intacta
Axones desmielinizados
Cicatriz Glial
Inflamación
Invasión de linfocitos y
macrófagos.
Activación de microglía
Constituida por
astroglía y microglía,
que es fuente de
moléculas inhibidoras.
Vaina de mielina
Axón
Macrófagos/
microglia
Daño de neuronas y
oligodendrocitos.
Pérdida de circuito
neuronal
Formación de cicatriz glial
Oligodendrocitos: la mielina que producen, contiene dos potentes
inhibidores: La proteína Nogo y la glicoproteína asociada a la
mielina MAG (Oiu y cols., 2000).
Principales investigaciones en
reparación
Cuatro caminos posibles en la reparación
de la LM
1. Proteger las células supervivientes y evitar la
extensión del daño= Neuroprotección.
2. Estimular el crecimiento axonal y su conectividad=
Neuroregeneración.
3. Reemplazar las células dañadas= Transplante.
4. Reconexión de circuitos neuronales=
Reprogramación.
Neuroprotección
 Detener excitotoxicidad
 Controlar inflamación
 Promover regeneración
 Neutralizar factores inhibitorios de la regeneración.
 Reducir la formación de la cicatriz glial.
 Proporcionar factores de crecimiento para supervivencia neural.
Metilprednisolona
Fármacos
Antagonistas de Glu
Eritropoyetina
Factores neurotróficos
Moléculas bloqueantes
BDNF
GDNF
Inhibidores de la cicatriz glial
Inhibidores de la mielina
(Kwon y cols., 2005).
Neuroregeneración
Promover el crecimiento de las fibras circundantes al área
lesionada, guiar el crecimiento hacia el área apropiada, y
formar conexiones funcionales.
 Estimulación eléctrica
 Factores tróficos
 Diversos matrices y polímeros
 Trasplantes celulares
(Bartlett y cols., 2008, Mc Kerracher y cols, 2001).
Trasplantes celulares
Se han realizado diversos experimentos para tratar las
lesiones de la médula espinal
con diferentes tipos
celulares:
• Células de Schwann.
•Tanicitos.
•Células ependimales .
•Células precursores de diversas
fuentes .
•Glía envolvente
La mayoría de estas células no se integran bien en el tejido
huésped y tienen limitada capacidad de migrar dentro del SNC,
por lo que sólo pueden ejercer su efecto reparador en el lugar del
trasplante.
(Horner y cols., 2000).
Glía envolvente de Bulbo Olfatorio
En el bulbo olfatorio, la GE guía a las neuronas olfatorios
desde el epitelio olfatorio hasta el SNC atravesando la
placa cribiforme y permitiendo que establezcan contacto
sináptico con las neuronas diana.
(Barnett, 2004).
Glía envolvente –Bulbo Olfatorio
CG
CFN
Envuelve axones amielínicos de
receptores olfatorios, estos receptores
están sujetos a un contínuo recambio.
Produce proteínas neuritogénicas y
de adhesión, que promueven y
estimulan la regeneración de los
axones dañados.
Gudiño-Cabrera, 1998
Aldainoglía(Schwann like):
Glía envolvente:
Envuelve axones amielínicos de receptores olfatorios,
estos receptores están sujetos a un contínuo recambio.
CG
CFN
p75 / GFAP
p75 / GFAP
vimentina /
p75
Tanicitos y Pituicitos:
Participan en la regulación hipofisiaria mediante la
envoltura reversible de los axones secretores.
RE / p75
Glía de la pineal:
Envuelve paquetes de fibras amielínicas. Sufre cambios
morfológicos en ciclos circadianos, estrales y anuales
(fertilidad), durante la gestación y lactancia .
Gudiño-Cabrera G. and Nieto-Sampedro M. (2000)
GFAP
p75
GFAP
O4
Factores neurotróficos secretados por la glía
envolvente
 Moléculas de adhesión L1 y E-NCAM
 Factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF)
 Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)
 Factor de crecimiento hepático (HGF)
 Factor de crecimiento nervioso (NGF)
 IGF-1
 Factor neurotrófico ciliar (CNTF)
 Factor de crecimiento epidérmico (EGF)
 Neurotrofina 3, 4 y 5 (NT3,NT4,NT5,..)
 S100β
También secreta moléculas de matriz extracelular, tales como la laminina y
fibronectina, metaloproteasas, así como la producción de diversas citocinas
como: CXCL1, CCL2, CX3CL1, CXCL12 .
(Inn Chuah cols., 2011 y Wewetzer K y col. 2002).
Glía envolvente
La GE al ser trasplantada :
Reduce las cavidades formadas tras una
lesión.
Reduce la cicatriz glial.
Protege a las neuronas.
Promueve el brote de axones intactos
cerca del transplante.
Remieliniza axones.
(Andrew y cols. 2007 ).
Cultivo celular
HBSS con Ca++ y Mg++
HBSS sin Ca++ y Mg++
37 ºC
20min
Tripsina
Digestión enzimática
Disociación
mecánica
Malla 40m
Glía envolvente del bulbo olfatorio
p75
p75
Trasplante de glía envolvente
La GE se integra dentro del parénquima del huésped (Gudiño y cols.,
1996) y se infiltra enel sitio de lesión interactuando favorablemente
con los astrocitos .
Secciones inmunomarcadas con anti GFAP de ratas no trasplantadas
(a,c) y trasplantadas (b,d) en segmentos de T12-L1 (a,b) y segmentos
rostrales T9-T10 (c,d).
(Verdú y cols., 2001)
Los transplantes de glía envolvente promueven la regeneración
en la médula espinal
Rizotomía unilateral L3-L6
Transplantado
contralateral
ipsilateral
Control
Transplantado
Control
Marcaje con CGRP
Navarro, X., Valero, A., Gudiño-Cabrera G
Los transplantes de glía envolvente
promueven la regeneración en la médula
espinal
Pre-operatorio
Pre-operatorio
60 días
después de la
rizotomía
2 semanas
después
2 semanas
después
60 días
después
60 días
después
Fibras
sensoriales Glía
Envolvente
Músculo Plantar
Músculo
Gastronemio
Navarro, X., Valero, A., Gudiño-Cabrera G 1999
Precursores Neurales Multipotenciales
( Álvarez-Buylla. 1998)
EMBRIONARIOS
(Cuerpo Estriado)
ADULTO ( ZSV)
Proliferar y renuevan
Neuronas y células
gliales
Las precursores neurales se han encontrado en regiones
neurogénicas como lo son: el hipocampo y la zona
subventricular y en algunas otras incluyendo la médula espinal.
Obtención de Células Madre
Sustancias que produce la
glia envolvente
Neurona
Célula sanguinea
Célula glial
Diferenciación Celular

Factores intrínsecos a la célula en sí, dependientes generalmente
de su estadio de desarrollo

Factores extrínsecos, dependientes fundamentalmente de
moléculas producidas por otras células, generalmente gliales, o
de interacciones directas con otras células.
Diferenciación celular
Contacto directo célula – célula
Moléculas de adhesión
Cadherinas
Selectinas
Integrinas
Superfamilia de las Igs
Factores Troficos:
FGF1, FGF2, PDGF-B, NGF, BDNF, NT4/5, GDNF, CNTF,GGF, IGF1
Moleculas de Matriz Extracelualr:
Laminina, Fibronectina, Colageno IV
Precursores Multipotenciales
CD133
CD44
CD81
CD184
CD90
CD29
SOX2
musashi-1
Bmi-1
Célula
precursora
Neuroblasto
Glioblasto
Schwartz , et al
2003
*
Neurona
Aldainoglía
*Medio condicionado
con Glía envolvente:
Astrocito
Oligodendrocito
Marcadores
de glia
*
envolvente
p75
O4
GFAP
Vimentina
Nestina
S-100
PSA-Ncam
L1
Laminina
Nieto-Sampedro M,
et al 2002
Lesión de Médula Espinal por sección
completa
Quince ratas hembras adultas Long–evans (250-300 g) anestesiadas
con ketamina(95mg/kg) y xilacina (10mg/kg).
Cervical
Torácica
Sección
Completa
nivel T9
Lumbar
Sacra
Coccígea
Evaluación funcional, escala BBB evalúa las articulaciones funcionales de la cadera, rodilla
y tobillo, en la marcha.
Evaluación morfologica: histolológica e inmunohistoquímica (vimentina, P75,GFAP, CGRP y
Neun)
Obtención de cultivos celulares
Bulbos olfatorios
Cuerpo estriado
Rata macho long
evans
Embrión de 13 días de
gestación de rata long evans.
Cultivo de Glía
envolvente (GE)
Cultivo de Glía envolvente
purificado
Precursores neurales (PN)
Transplante de células en la ME
lesionada por sección completa a nivel
de T9
PND
PN
Cultivos de glía envolvente del bulbo olfatorio
A
A
B
B
(A) Cultivo de glía envolvente sin purificar. (B) Cultivo de glía envolvente purificado con perlas
magnéticas anti p75 (B). Barra indica 50µm.
Cultivos de Precursores Neurales
A
B
C
Cultivo de Precursores neurales de embriones de 14 días de gestación. (A) Cultivo después del
primer pase celular. (B) Cultivo después del tercer pase. (C) Cultivo después del cuarto pase celular.
Barra 70 µm.
Diferenciación de Precursores
Neurales
A
B
Precursores neurales diferenciadas a fenotipo de glía envolvente después de 72
horas en medio condicionado de glía envolvente (A y B). Barra 50μm.
Precursores Neurales diferenciados hacia el
fenotipo Glía Envolvente
A
p75
B
C
GFAP
p75/GFAP
p75
Fotomicrografías de precursores neurales diferenciados hacia el fenotipo de glía envolvente.
(A) Inmunocitoquímica con marcaje para P75. (B) GFAP. (C) Co- marcaje de p75/GFAP.
Amplificación 10x. La Barra 50µm.
Diferenciación de PNM con Medio
condicionado por GE
VIM
GFAP
Tesis doctpral
Yara Mejia Alcantar
VIM/GFAP
Lesión traumática de médula espinal
B
A
C
D
Lesión por sección completa de la médula espinal a nivel torácico 9.
(A) Exposición de la médula espinal. (B) Sección de la médula espinal.
(C) Corroboración de la lesión. (D) Imagen amplificada del sitio de lesión.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Trasplantes celulares
A
B
Trasplantes celulares. Se trasplantaron 100 000 células en 6 µl de medio
DMEM/F12 (A) Trasplante en la región cefálica al epicentro de la lesión. (B)
Trasplante en la región caudal al epicentro de la lesión.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Trasplantes celulares
Posterior a la lesión 10 ratas seccionadas recibieron una inyección con 100,000
células vivas, suspendidas en 6µl de medio DMEM/F12.
Se realizaron 3 inyecciones en sentido craneal al epicentro de la lesión y 3
inyecciones en sentido caudal.
En cada inyección se aplico 1µl de medio de los 6 µl totales.
Ratas con LTME
recibieron una
inyección de una
suspensión de PN
diferenciados hacia
el fenotipo de GE.
Ratas lesionadas
recibieron una
inyección de PN no
diferenciados.
Ratas lesionadas sin
trasplante de ningún
tipo celular.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Prueba Funcional BBB
*
Análisis funcional, de las extremidades posteriores de las ratas, con o sin
transplante, Prueba estadística de Kruskal-Wallis, con una p significativa de p<
0.03. La prueba Tukey nos indicó que había diferencia significativa entre el grupo
de precursores neurales y lo otros dos grupos de estudio.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Análisis Morfométrico
Sitio de lesión de la médula espinal
A
B
Fotomicrografías del sitio de
lesión de la médula espinal
(ME) en cortes longitudinales.
(A) Grupo control.
(B) Rata con transplante de
precursores
neurales
sin
diferenciar.
(C) Rata con transplante de
precursores
neurales
diferenciados. La barra indica
500µm.
C
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Medición de la extensión de la cicatriz
B
Fotomicrografias del sitio de
lesión en cortes longitudinales
de médula espinal (ME). (A)
Control.
(B)
Rata
con
transplante de precursores
neurales sin diferenciar. (C)
Rata con transplante de
precursores
neurales
diferenciados. La barra indica
500µm.
Control 21 923 μm2.
PN
8 244 μm2
PND
11 575 μm2.
A
C
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Análisis Inmunohistológicos
Expresión de CGRP
A
B
CGRP
C
D
Expresión de CGRP en cortes
longitudinales de médula espinal
(ME) de rata con sección
completa.
(A y B) ME de rata con trasplante
de
precursores
neurales
diferenciados.
(C y D) ME de rata con trasplante
de precursores neurales.
E
F
(E y F) ME de rata control.
La barra 100 μm.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Expresión de NeuN
A
A
B
Expresion de NeuN en cortes
longitudinales de médula espinal
(ME) con sección completa.
NeuN
( A y B) ME de rata con
trasplante de precursores
neurales diferenciados.
C
D
D
E
( C y D) ME de rata con
trasplante de precursores
neurales
(D y E) ME sin trasplante.
La barra indica 100 μm.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
Expresión de CGRP y NeuN
A
B
C
NeuN
CGRP
NeuN/CGRP
D
E
F
G
H
I
Expresión de NeuN y CGRP en cortes coronales de Médula espinal (ME) seccionada nivel torácico
9. ( A-C) ME de Rata trasplantada con precursores neurales diferenciados. (D-F) ME de Rata
trasplantada con precursores neurales sin diferenciar . (G-I) ME de Rata sin trasplante. La barra
indica 100μm.
Tesis doctoral Rodriguez-Baeza,2013
En resumen:
*
Presencia en el SNC de células con un fenotipo que promueve la regeneración del
Sistema Nervioso, produce factores de crecimiento y disminuye la formación de la
cicatriz glial.
Tanto las neuronas como las células gliales se pueden obtener a partir de
precursores neurales multipotenciales
*
Los PN se diferencian in vitro al fenotipo de GE, mostrando la co-expresión de p75
y GFAP.
El transplante de PN favorece más que el transplante de PND la recuperación
funcional en las extremidades posteriores de ratas con lesión por sección completa
de la médula espinal de acuerdo a la escala BBB.
Sustancias que
produce la glia
envolvente
*
*
Tanto los trasplantes de PN como de PND, ejercen un efecto neuroprotector
sobre el tejido lesionado ya que las ratas trasplantadas con los dos tipos
celulares presentaron mayor expresión de NeuN y CGRP en la ME, así como
una menor extensión del sitio de lesión en comparación con las ratas del grupo
control.
El abordaje del daño medular es multidisciplinario, se tiene que: Detener la
excitotoxicidad, Controlar la inflamación y Promover la regeneración
Ayudate!
*Oxigenacion- Respiración Profunda
*Hidratación
*Alimentación sana; dieta equilibrada, evita
alimento con alto índice glicémico, condimentados,
bebidas alcohólicas
*Ejercicio Físico, mental (cognitivo, sensorial, motor)
*Se consciente de tus cambios hormonales
*bioritmo
*Dedicate tiempo a ti mismo, recreación
*Buen ánimo-pensamientos
54
Colaboraciones
Lab. de Desarrollo y Regeneración
Neural
Responsable
Dra. Graciela Gudiño Cabrera
Participantes:
Dra. Nidia Jannette Carrillo González
Dra. Marcela Rodriguez Baeza
Biol. Gabriela Escobar Camberos (tecnico
docente)
P. de Biol. Maria Elena Zuñiga Anguiano
Dr. Carlos Beas Zarate
Dra. Mónica E. Ureña Guerrero
Dra. Hermelinda Salgado
Ceballos
Muchas Gracias !