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PUESTA A PUNTO DE UN MÉTODO ANALÍTICO MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA DE GASES PARA LA DETERMINACIÓN DEL PERFIL
LIPÍDICO EN CARNES
TUNING ANALYTIC METHOD FOR DETERMINATION OF LIPID PROFILE IN
MEAT BY GAS CROMATOGRAPHY
E. M. Rincón1a* Zoot, W Albarracín1b, Ph.D
RESUMEN
Hoy en día es de vital importancia conocer el valor nutricional y funcional de los alimentos
debido a una creciente preocupación por consumir alimentos saludables que tengan cabida
en una dieta equilibrada. Por esta razón, es necesario determinar el perfil lipídico en los
alimentos, especialmente en aquellos que son fuente significativa de este tipo de
compuestos. En la determinación de perfiles lipídicos existen varias condiciones que
afectan su cuantificación, por lo cual el objetivo de este trabajo fue evaluar las mejores
condiciones en la etapa de derivatización dentro de la metodología establecida en la
determinación del perfil lipídico en carnes bovinas. Las condiciones evaluadas fueron: el
tipo y cantidad de solvente orgánico (metóxido de sodio 250 µL y 500 µL; trifluoruro de
boro 700 µL), cantidad inicial de muestras cárnica (3,0 y 6,0 g). Se encontró que no
1
Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Grupo de investigación
Aseguramiento de la calidad y desarrollo de nuevos productos Bogotá Colombia
a
Estudiante Maestría en Ciencia y Tecnología de alimentos. b Docente Maestría en Ciencia y Tecnología de
alimentos.
*Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: Edicson Rincón, emrincons@unal.edu.co
existen diferencias estadísticamente
significativas (p>0,05), entre las cantidades de
muestras, tipo y cantidad de solvente.
PALABRAS CLAVES: Ácidos grasos, Carne, Derivatización, Cromatografía de Gases.
ABSTRACT
Nowadays, food nutritional and functional values are important due to the increasing
interest in health food and a balanced diet. So, the lipidic profile determination in food is
important, when food have these compounds, specially. There are food conditions that
affect the lipidic profile determination. The aim this research was evaluates the best
conditions of derivatization stage methodology in lipidic profile determination for beef. The
evaluated conditions were: the quantity and type of organic solvents (sodium metoxid 250
µL and 500 µL; boron triflouride 700 µL); quantity of sample (3.0 g and 6.0 g). The results
demonstrated there are not significant differences (p≥0.05) among quantity of sample and
quantity and type solvents
KEYWORDS: Fatty acids, Meat, Derivatization, Chromatography Gas.
INTRODUCCIÓN
El estudio de la concentración de grasa y su composición en las carnes por medio de
perfiles lipídicos cobra cada día mayor importancia porque permite identificar y cuantificar
puntualmente ácidos grasos, últimamente se ha prestado mucha atención en el análisis de
los ácidos grasos (AG) debido a su relación con las enfermedades coronarias (1). Sin
embargo, el contenido de grasa intramuscular y su composición en los rumiantes dependen
de muchos factores (2)(3) tales como el origen genético (4), la dieta (5) y la edad o el peso
vivo (6), y esta influye en la calidad final del producto. Esto explica el creciente interés en
la definición del perfil de AG de la carne de los diferentes sistemas de producción.
La característica distintiva de los lípidos en los alimentos es la presencia universal de los
AG de cadena mediana y larga (C14-C22). La mayoría de los nutricionistas distinguen los
ácidos C8, C10, C12 como de cadena corta y ácidos grasos de la C16 y C18 común de los
ácidos grasos llamados de cadena larga. Los primeros se digieren fácilmente, y en la
absorción pasan directamente al hígado a través de la vena porta, mientras que los segundos
tienden a transferir a la linfa en los quilomicrones (7)(8).
Las principales clases de lípidos se encuentran comúnmente en los alimentos son
Fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidiletanolamina (cefalina), triglicéridos, ácidos grasos
Libres. En carne bovina los ácidos grasos reportados varían desde cadenas medias a largas
pasando tanto saturados como insaturados, siendo los mayoritarios el palmitato (C16:0),
estearato (C18:0), oleato (C18:1). La composición de ácidos grasos intramusculares en
carne se da en un grupo heterogéneo de estructuras químicas con efectos profundos sobre
la calidad de la carne. La composición de AG determina la estabilidad oxidativa de los
músculos, los cuales a su vez afectan flavour y color de la carne y este es esencial para los
valores nutricionales de la carne. (9)
Encontrar las diferentes composiciones en Ácidos grasos y poder dividir estos perfiles en
cantidad de ácidos grasos saturados e insaturados, al igual que hallar exactamente las
proporciones de AG que están contribuyendo en la disminución de los factores de riesgo de
enfermedades, por ello es muy importante su investigación y determinación. (10)(11).
Como resultado del imbalance de ácidos grasos en las dietas humanas, las estrategias
dietarías han empezado a emplear el mejoramiento en la nutrición y salud de vacunos y sus
grasas intramusculares, Así la manipulación de los ácidos grasos en la carne de rumiantes,
jugando con las relaciones entre saturados e insaturados(12).
Dentro del análisis de los lípidos es necesario un conocimiento de la estructura, la química
y la presencia de las principales clases de lípidos. La preparación de la muestra
para el
análisis de los lípidos depende del tipo de alimento, y del tipo y la naturaleza de los lípidos
contenidos en los alimentos (13). En muestras cárnicas la cantidad de grasa y de ácidos
grasos varía considerablemente no sólo en función del tipo de análisis, sino también del
solvente y el tiempo empleado (13).Debido a la existencia de varios tipos de métodos para
la determinación de los ácidos grasos, y más aún del uso de diversos solventes reportados
en la literatura, el objetivo de esta investigación fue primero revisar en la literatura las
condiciones reportadas de extracción y derivatización para la determinación de perfil lípido
por medio de cromatografía de gases, seleccionando las condiciones más adecuadas para
determinar el contenido de grasa y perfil lipídico en carne bovina.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la determinación de grasas se utilizó un método de extracción por solventes orgánicos,
las condiciones que variaron en dos niveles fueron solventes, tiempos de ebullición
y tamaños de muestra. Se deben tener en cuenta que la cantidad de solvente para el proceso
de derivatización fue de 250 y 500 µL para Metoxido de Sodio 0,5 M (Sigma Aldrich),
mientras que el método de Trifluoruro de Boro (Sigma Aldrich) siempre utilizo 700 µL,
cada uno de estas metodologías maneja un tiempo diferente de reacción 45 minutos para
metoxido de sodio y 15 minutos para Trifluoruro de Boro.
Muestras cárnicas
Se pesaron muestras cárnicas de 3 y 6 gramos, tomadas del musculo Longisimuss Dorsi, de
animales raza Cebu Brahaman, provenientes del mismo lote y con las mismas condiciones
de crianza, alimentados al pastoreo, las respectivas muestras se sometieron a un picado
fino en estado de congelación.
Extracción Grasa
Los triacilgliceroles presentes en los tejidos musculares se extrajeron por partición con
cloroformo-metanol 2:1 según el método propuesto por Folch et al. (1957), agregando 1
mL de la mezcla de solventes por cada g de carne usado, luego se centrifugó a (3500 rpm,
10min) y se adicionaron 7mL de KCl 0,88% p/v para separar el precipitado proteico
remanente. La fase orgánica se separó, se secó con Na2SO4, se concentró por
rotaevaporación y finalmente la muestra de grasa fue secada con burbujeo de nitrógeno.
La grasa extraída se almaceno en un ultracongelador para evitar cambios en las
proporciones de los acidos grasos por ranciamiento lipidico.
Derivatización de los triglicéridos y metilación de ácidos grasos
Se realizó pesando aproximadamente 20 mg de grasa en un vial (la muestra debe estar
totalmente líquida, fue necesario fusionar la muestra a temperatura <45 ºC ya que la grasa
cárnica a temperatura ambiente se encuentra en un estado semisólido), se agregó 1 ml de
hexano, se homogenizó y se adicionaron 250 μL de solución de metóxido de sodio 0,5 M,
agitando en vortex por 30 segundos. La reacción de derivatización se llevó a cabo a 45º C
por 30 minutos. Al cabo de los cuales se detiene la reacción con la adición de 4 mL de
hexano seguidos de 4 mL de solución saturada de NaCl, la mezcla se agita en vortex por 30
segundos. Se retira la fase orgánica para filtrar en sulfato de sodio anhidro. Esta fase se
recupera en un nuevo vial. A la fase acuosa se adicionaron 5 mL de hexano,
homogeneizando nuevamente en el vortex (30 segundos). Filtrando la fase orgánica en el
filtro de sulfato de sodio y recuperándola en el mismo vial que se recuperó la fase orgánica
anterior. En un vial de cromatografía con inserto se adicionaron 50 μL de la muestra
derivatizada y 150 μL de hexano grado cromatográfico.
Cuantificación de ésteres metílicos de ácidos grasos
El análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de cada una de las muestras
derivatizadas y diluidas se realizó utilizando cromatografía en fase gaseosa (GC), para lo
cual se usó un cromatógrafo de gases Agilent 7890ª (Agilent, USA), equipado con un auto
muestreador y autoinyector Agilent 7683B, un detector FID y un software de captura de
datos
Chemstation
versión
B.04.01.
La
columna
utilizada
fue
una
BPX-70
30m*0.25m*0.25μm (SGE, Australia).
El programa de temperatura comenzó a 60°C por 1min, incrementando hasta 190°C a
20°C/min y se mantiene a 190°C durante 12.5min, para un tiempo total de análisis de 43
min. El gas de arrastre que se utilizó fue helio a un flujo de 2,0mL/min.
El volumen de inyección es de 1,0µL y se utiliza un split de 1:20. La composición
cualitativa de ácidos grasos se determinó por comparación de los tiempos de retención de
los picos obtenidos con los de patrones de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) C4-
C32 y de ALC para la cuantificación de los mismos se realizó por el método de estándar
interno con curvas de calibración construidas para cada uno de los ácidos grasos analizados.
Análisis Estadístico
La evaluación estadística se realizó a través del software statgraphic centurión,
considerando cantidad de muestra cárnica, tipo y cantidad de solvente y su interacción
como efectos principales, se realizó un diseño experimental completamente al azar con
componente factorial completo.
Se debe tener en cuenta que al emplear diferentes proporciones de solventes en los ensayos
y que ninguno de los niveles usados en cada grupo de diferentes solventes fue el mismo, se
logran diferenciar los solventes por las cantidades o concentraciones dentro de la medición
estadística, por lo tanto no se tiene como factor dentro del diseño factorial llevado a cabo en
el diseño estadístico, al igual que tampoco tiempos de reacción para cada uno de los
solventes usados.
Las observaciones fueron tomadas como mínimo por triplicado.
Los datos obtenidos se analizaron por medio del siguiente modelo:
Donde
Yij = Respuesta de la variable
µ = Media general de la variable
α = Efecto del tamaño de muestra
i=2
β = Efecto de la cantidad de solvente
j=3
εij = Error experimental
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La cantidad de grasa presente en la posta utilizada Longissimus dorsi, presento 2,25+/-0,2
% de grasa total con un n=20 animales.
Dentro del proceso de derivatización se obtuvieron los resultados indicados en la tabla 1.
TABLA 1. Comparación metodologías derivatización muestras cárnicas Longisimuss dorsi.
Letras iguales indican que no hay diferencias estadísticamente significativas con un nivel
de significancia del 5%.
Cantidad
de
Cantidad
Método
de
Diferencias
Codificación
muestra de Derivatización Solvente
(g)
6
3
(Tukey)
(µL)
CH3ONa
250
6M250
a
CH3ONa
500
6M500
a
BF3
700
6T700
ab
CH3ONa
250
3M250
ab
CH3ONa
500
3M500
a
BF3
700
3T700
ab
No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre el uso de las
interacciones de cantidad de muestra cárnica, concentración de solventes ni método de
derivatización, lo cual indica que se puede usar cualquiera de los dos tipos de solventes y
que las proporciones no afectan en forma significativa la cuantificación de los esteres
metílicos en la cromatografía de gases resultados
La experimentación se realizó por medio de un diseño multifactorial siguiendo los
procedimientos para una sola vía, las respectivas comparaciones entre medias para cada
uno de los ácidos grasos, logrando así obtener resultados por grupos ya sea ácidos grasos
Saturados e insaturados (mono y Poli-insaturados).
En general los ácidos grasos saturados no presentan diferencias significativas para la
cantidad del solvente usado como tampoco para la cantidad de muestra cárnica utilizada.
Al hacer las comparaciones de nuestros perfiles con respecto a otros perfiles también en
carne bovina (14)(15)(12)(16) ver tabla 2, se denota que los datos obtenidos son coherentes,
se debe tener en cuenta que las comparaciones con respecto a esta literatura nunca llego a
presentar diferencias estadísticamente significativas, lo que demuestra que los datos
obtenidos son fiables y soportados en un hecho real. Además sobre esto se pueden hacer las
respectivas comparaciones en las que se indica si el valor obtenido en los perfiles hallados
presentan mayor o menor similitud con respecto a literatura, es un error pensar que a mayor
presencia del dicho Ácido graso se presentan mejores resultados, ya que el comportamiento
de cada ácido graso se vuelve independiente del resto, ya que la actividad que presenta cada
uno de ellos con respecto a los reactivos es diferente. Una gran ventaja del uso de la
cromatografía de Gases es que esta es capaz de separar e individualizar cada uno de los
componentes y así mismo tratarlos como entes independientes el uno del otro.
Al final observando la tabla 2 al lado derecho en la que se comparan los resultados
obtenidos puntualmente con respecto a otros experimentos hechos anteriormente se puede
observar que los valores obtenidos para la mayoría de los ácidos grasos por parte de las
técnicas usadas no presentan grandes diferencias comparados a los resultados reportados
para Longissimus dorsi aunque no se puede enfatizar completamente ya que no siempre
tienen el mismo tipo de dieta, además que no se está reportando en la misma raza, los
únicos experimentos completamente homogéneos son los correspondientes a las 6 primeras
columnas de la tabla 2. A continuación se ve la tabla comparativa de los perfiles lipídicos
en % p/p
CHCl3: CH3OH
CHCl3: CH3OH
CHCl3: CH3OH
CHCl3: CH3OH
CHCl3: CH3OH
Met Extracción
2:1
2:1
2:1
2:1
2:1
CHCl3:
CHCl3:
CHCl3:
CH3OH
CH3OH
CH3OH
CHCl3: CH3OH
Betancourt
2:1
Alfaia 2007
Rule 2002
2009
2:1
2:1
2:1
CH3OH CH3OH CH3OH
# Solvente
6M250
6M500
6T700
3M250
3M500
3T700
–BF3
–BF3
–BF3
(a*)
(a*)
(a*)
(C12:0)
0,223±0,122
0,154±0,072
0,986±0,487
0,315±0,131
0,385±0,075
0,688±0,208
(C14:0)
3,827±1,294
3,042±0,305
3,731±0,477
3,942±0,438
3,520±0,204
3,813±0,583
1,61
1,69
1,51
(C14:1)
0,406±0,048
0,429±0,097
0,472±0,106
0,569±0,054
0,558±0,034
0,466±0,105
0,15
0,2
(C15:0)
0,978±0,160
0,883±0,038
0,937±0,466
1,074±0,178
0,910±0,061
1,008±0,109
0,41
(C15:1) cis-10
0,449±0,019
0,442±0,036
0,496±0,028
0,516±0,057
0,449±0,023
0,454±0,025
28,775±1,441 27,464±0,953 29,432±2,316
30,917±7,037
28,013±0,777
(C16:1)
2,423±0,157
2,459±0,044
2,448±0,042
3,078±0,253
(C17:0)
1,327±0,163
1,352±0,044
1,454±0,131
(C17:1) cis-10
0,595±0,065
0,694±0,073
(C16:0)
(C18:0)
(C18:1)
(C18:1) o
0,22
0,2
4,59
4,42
2,03
2,66
0,21
0,68
0,63
0,6
0,39
0,41
0,44
0,63
0,67
1,54
0,42
0,22
0,24
0,21
29,478±1,343
21,72
21,85
22,32
23,3
23,6
22,2
25,8
2,932±0,093
2,668±0,230
2,29
2,25
2,26
3,11
3,71
2,67
3,75
1,529±0,311
1,342±0,026
1,349±0,151
1,05
1,05
1,07
1,03
1,1
1,32
1,2
0,711±0,090
0,729±0,012
0,694±0,048
0,620±0,102
0,38
0,46
0,37
21,984±0,779 21,198±1,028 21,628±1,813
18,584±0,604
19,491±0,627
21,607±2,286
18,39
18,28
18,75
22,7
16,7
16,3
13,4
23,5
0,729±0,068
0,656±0,033
0,739±0,244
0,613±0,079
0,707±0,096
1,28
1,4
1,74
35,2
37,5
40,4
29,325±0,938 28,960±1,369 26,991±1,755
32,446±6,095
30,398±1,029
30,370±0,348
29,87
29,61
31,07
36,2
34 c9
c9
c9
c9
4,1
3,11
1,48
0,22
0,689±0,153
(C18:2t)
0,811±0,042
0,776±0,088
0,798±0,047
0,900±0,212
0,733±0,018
0,792±0,074
(C18:2c)
2,152±0,723
3,182±0,452
2,373±0,890
1,336±0,349
1,633±0,124
1,181±0,216
(C18:3)
0,858±0,229
1,261±0,212
0,994±0,284
0,764±0,092
0,744±0,080
0,567±0,157
2,41
2,49
2,21
3,2
30,9
3
0,9
0,33
0,37
3,89
3,27
(C20:0)
0,417±0,070
0,498±0,069
0,541±0,127
0,506±0,088
0,404±0,045
0,406±0,054
0,23
0,18
0,21
(C18:2) 9c-11
1,405±0,470
1,929±0,514
1,900±0,667
2,055±0,684
1,719±0,333
1,299±0,411
0,34
0,31
0,33
(C20:1) cis-11
0,209±0,092
0,235±0,050
0,457±0,341
0,322± 0,011
0,230±0,059
0,178±0,049
0,438±0,293
0,453±0,065
0,364±0,083
1,181±1,207
0,327±0,182
0,206±0,082
(C20:3 ) cis8,11,14
(C22:1) cis-13
0,178±0,054
0,228±0,044
0,221±0,082
0,000±0,000
0,000±0,000
0,000±0,000
(C20:5)
0,324±0,161
0,567±0,106
0,489±0,128
0,000±0,000
0,211±0,026
0,154±0,044
1,95
2,04
2
(C22:6)
0,553±0,125
1,085±0,163
0,840±0,345
0,977±0,826
0,424±0,048
0,274±0,091
0,16
0,06
0,08
TOTAL
102,536
122,283
103,082
104,454
101,446
101,301
35,35
35,13
36,34
Saturados
59,108±2,184
56,708±0,27
59,9±3,748
57,825±0,694
58,453±0,644
60,173±1,509
33,78±0,326
33,101±1,22
31,607±1,861
34,967±2,654
35,408±1,091
35,134±0,828
7,112±1,905
10,19±1,495
8,491±2,196
7,206±3,001
6,137±0,666
4,691±0,887
MonoInsaturados
Poliinsaturados
TABLA 2. Perfiles lípidicos obtenidos con cada tratamiento de derivatización Vs Perfiles reportados en literatura en %w/w.
0,4
97,3
0,4
0,29
n-6
n-6
0,48
0,28
0,38
0,12
0,41
0,26
0,14
0
0,09
0,02
0,39
0,24
0,62
0,13
55,43 54,74 51,38 61,85
CONCLUSIONES

La cantidad de grasa presente en Longissimus dorsi, presento un porcentaje de grasa
total de 2,25+/-0,2 % n=20 animales

El método de cuantificación de los esteres metílicos por cromatografía de gases
demostró ser muy eficiente y no se encontraron diferencias en los tiempos de retención
al utilizar las diferentes metodologías de derivatización.

Con una confianza del 95% podríamos decir que no se encontraron diferencias
estadísticamente significativas para los dos tipos de reactivos utilizados ni para las
diferentes concentraciones de solventes usados, de esta manera se determinó que
utilizando el reactivo más económico y de menor concentración sería más rentable, pero
debido a que la cantidad de muestra cárnica utilizada no garantizaba una extracción
suficiente en cuanto a cantidad, se determinó que se debería utilizar más cantidad de
muestra cárnica por lo tanto se terminó definiendo una cantidad de 4,5 gramos de
muestra cárnica como porción suficiente para lograr una extracción grasa adecuada para
el posterior muestreo por triplicado.

En general al comparar los datos obtenidos por ácidos grasos individuales podemos
decir que la gran mayoría de los ácidos grasos tuvo comportamientos y valores
similares a los reportados para ese mismo tipo de posta cárnica.
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