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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM PvNV
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02
IQ2000 TM PvNV Sistema de Detección
y Prevención
Penaeus vannamei Nodavirus (PvNV)
Para uso exclusivo In-Vitro
Material incluido, no contagioso.
Manual Instructivo
Instituto Tecnológico de Sonora
5 de Febrero No. 818 sur
Teléfono (644) 410-09-00 Ext. 2115, Apdo. 541
C.P. 85000 Ciudad Obregón, Sonora, México
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Tabla de contenidos
I.
Introducción
II.
Componentes del sistema
1. Solución de extracción de RNA
2. Kit de amplificación de secuencia específica de PvNV
III.
Equipo y reactivos requeridos
IV.
Límite de detección y sensibilidad
V.
Preparación de la muestra y extracción de RNA
1. Procedimiento de extracción de RNA
2. Disolución de RNA
VI.
Protocolo de reacción de amplificación
1. Preparación de reactivos
2. Condiciones de reacción
3. Procedimiento de reacción
VII.
Electroforesis
1. Preparación del gel de agarosa
2. Electroforesis
3. Tinción del gel y datos de ensayo
VIII.
Diagnóstico
IX.
Problemas
X.
Referencias
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I.
Introducción
Penaeus vannamei
cultivados en Belice presentaron síntomas de lesiones
blancas y opacas en la cola muscular desde el 2004. Los signos clínicos son
similares a aquellos presentados en camarones infectados con IMNV. Después
de investigaciones de la Dra. Kathy F.J. Tang, esas causas de necrosis
muscular encontrada en Penaeus vannamei fueron confirmadas a PvNV
(Penaeus vannamei nodavirus) – un nodavirus. A pesar de la baja mortalidad
causada por PvNV, la infección con este virus resulta en una reducción del
50% en la producción de la granja afectada. Con ciertos experimentos
realizados por la Dra. Tang, se ha confirmado que ambos, P.vannamei y
P.monodon, son susceptibles a infección por PvNV. Sin embargo, la vía de
transmisión no es clara y hay investigaciones relacionadas hasta la fecha.
Se ha desarrollado un método de diagnóstico por la Dra. Tang et al. del
departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología, Universidad de
Arizona. El siguiente un proceso de transferencia de tecnología, GeneReach ha
desarrollado satisfactoriamente el IQ2000 PvNV Sistema de Detección y
Prevención de forma disponible para el público. Es útil para confirmar las
causas de síntomas similares a aquellos causados por virus o un manejo
inapropiado de forma rápida y efectiva.
Este sistema ha adoptado el diseño de PCR Anidado y también ha adquirido su
confiabilidad, sensibilidad y experiencia para el rango de diagnósticos de virus
de kits IQ2000. Esta función semicuantitativa proporciona información de
niveles de infección del virus lo cual puede ser utilizado para posteriores
investigaciones en PvNV.
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II. Componentes del sistema
1. Solución de extracción de RNA (200 reacciones/kit)
100 ml/btl
Almacenar a 4°C
DEPC ddH2O
100 ml/btl
Almacenar a -20°C
2. Kit de amplificación para secuencia específica de PvNV
(200
reacciones/kit)
Almacenar a -20°C
- PreMezcla RT-PCR
4 viales
420 ul/vial
Incluye buffer de reacción, dNTPs, y primers específicos para PvNV
- PreMezcla para PCR Anidado
4 viales
840 ul/vial
Incluye buffer de reacción, dNTPs y primers específicos para PvNV
- Estándar P(+)
1 vial
100 ul/vial
104 copias/ul de plásmidos que contienen secuencia parcial de PvNv
- Levadura de tRNA (40 ng/ul)
1 vial
500 ul/vial
- IQenzima DNA polimerasa (2 U/ul)
1 vial
360 ul/vial
- Mezcla de enzima RT
1 vial
120 ul/vial
- Cargando tinte 6X
1 vial
1500 ul/vial
- Marcador de peso molecular de DNA
1 vial
100 ul/vial
848 pb, 630 pb y 333 pb
- DEPC ddH2O
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III.
Requerimientos de equipo y reactivos
1. Termociclador con bloque para tubos de muestras de 0.2 mL
2. Centrífuga
3. Cámara de electroforesis y fuente de poder
4. Transiluminador UV
5. Vortex
6. Micropipeta
7. Cámara fotográfica
8. Horno de microondas
9. Guantes
10. Lentes o careta
11. Bata para laboratorio
12. Puntillas de distintas medidas para micropipetas
13. Cloroformo
14. Etanol al 75%
15. Colorante Gelred
16. Buffer de electroforesis TAE ó TBE
17. Agarosa
18. Balanza
19. ddH2O
20. Isopropanol (2-propanol)
21. Papel parafilm
22. Vaso de precipitado de 100 ml
23. Pistilos
24. Tubos microfugue de 1.5 y 0.2 ml
25. Refrigerador
26. Congelador
27. Campana para PCR
28. Gabinete para extracción de DNA y RNA
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IV.
Límite de detección y sensibilidad
Este sistema de detección generará diferentes límites de detección y niveles de
sensibilidad de acuerdo a las diversas fuentes de la muestra. La siguiente tabla
enlista algunas muestras analizadas comúnmente. Basados en el conocimiento
de distribución viral en camarón, la muestra de agalla es altamente
recomendada para el análisis de camarones juveniles y adultos.
Espécimen
Cantidad de muestra
Límite de detección
(copias/reacción)
PvNV DNA plásmido
5 copias/ul
10
RNA transcrito in Vitro
20 copias
20
<PL12
10 PLs
20
PL12 a PL20
5 PLs
20
Todas las branquias
20
2 a 3 piezas
20
Media pieza
20
Branquias para camarón
de tamaño PL12 de 5g
Branquias para camarón
de tamaño de 5g a 20g
Branquia de cría en
existencia
Basándose en la tabla de arriba, los usuarios deben saber que un análisis con
resultado “negativo” indica que el espécimen está o no infectado o que el nivel
de infección es más bajo que el límite de detección. Todos los resultados
listados en la tabla fueron analizados de acuerdo a los procedimientos estándar
y reactivos descritos en este manual. No garantizamos que el RNA extraído por
otros fabricantes de extracción de RNA cumplirá con nuestro sistema de
detección.
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V.
1.
Preparación de la muestra y extracción de RNA
Procedimiento de extracción RNA
a. Poner la muestra en un tubo de 1.5 ml con 500 ul de Solución de
Extracción de RNA.
b. Macerar la muestra dentro del tubo con un macerador desechable,
dentro de temperatura ambiente por 5 minutos.
c. Agregar 100 ul de CHCl3 y pasar al Vortex por 20 segundos. Dejar
a temperatura ambiente por 3 minutos, luego centrifugar a 12000g
(12000 rpm, r= 6 cm) por 15 minutos.
d. Transferir 200 ul de la fase acuosa del claro superior a un tubo
nuevo de 0.5 ml con 200 ul de 2-propanol (isopropanol).
e. Pasar al Vortex brevemente, centrifugar a 12000g por 10 minutos,
luego decantar el isopropanol.
f. Lavar el pellet con 500 ul de etanol al 75%, luego centrifugar por 5
minutos a 7500g (9000 rpm, r=6 cm) para recuperar el RNA del
pellet, luego decantar el etanol y secar el pellet.
g. disolver el pellet con DEPC ddH2O.
2. Disolución de RNA
La concentración de RNA es diferente, dependiendo de las distintas fuentes
de la muestra, por lo tanto la concentración de debe ser ajustada disolviendo el
pellet con el RNA en un volumen diferente de ddH2O DEPC.
Muestra
PL´s
Branquias
Ojo del reproductor
Post larvas
Pleopodo o periopodo
Tejido de jaiba, ostión, plancton,
peces,
ó pequeños crustáceos
Branquia
Fondo de estanque
Agua de estanque
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Volumen
500 μl
200 μl
100 µl
200 µl
200 µl
200 µl
50 µl
20 µl
10 µl
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VI. Protocolo de amplificación
Las siguientes condiciones de amplificación aplican para tubos de
microcentrífuga de 0.2 mL.
1. Preparación de reactivos para la reacción de RT-PCR
a. Mezcla de reacción RT-PCR: 8 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla RT-PCR
7.0 µl
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/µL)
0.5 µl
Mezcla de Enzima RT
0.5 µl
2. Procedimiento de reacción
a. Pipetee 8 µl de mezcla de reacción RT-PCR en cada tubo de
reacción de 0.2 mL con su respectiva etiqueta.
b. Agregue 2 µl de extracción de RNA de la muestra ó estándar* en
cada mezcla de reacción.
c. Realice la reacción RT-PCR
3. Condiciones de reacción (Uni-IQ Descripción de RT-PCR):
Descripción de la reacción RT-PCR:
42ºC – 30 min.; 94 ºC – 2 min.; Enseguida
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 15 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
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4. Preparación de reactivos para la reacción de PCR anidado
Mezcla de reacción de PCR anidado : 15 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla de PCR anidado
14 µL
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/ µL)
1 µL
5. Procedimiento de reacción:
Agregue 15 µL de mezcla de reacción PCR anidado a cada tubo,
después de haber completado la reacción RT-PCR.
6. Condiciones de Reacción de PCR anidado.
a. Descripción de reacción de PCR anidado:
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 30 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
b. Realice la reacción de PCR anidado.
c.
Después de haber terminado la reacción anidada, la muestra está lista
para la electroforesis.

Por cada experimento, un estándar de 10 copias/µL es muy
recomendable para monitorear la sensibilidad de las reacciones.
También recomendamos tRNA de levadura para ser usado como
diluyente para estándares positivos. Bajo ésta condición, el estándar
puede ser mantenido a -20ºC por una semana.
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VII.
Electroforesis
Coloque el gel de agarosa coagulado dentro de la caja. Durante la
electroforesis, el ADN molecular migrará hacia el polo (+), ya que el ADN está
cargado negativamente.
Agregue buffer de electroforesis a 0.5X dentro de la caja, hasta que cubra
ligeramente el gel.
Cargue 8 µL de la mezcla de producto de PCR y 2 µl de colorante de carga a
cada pozo la mezcla la puede hacer en papel parafilm. La mezcla se irá al
fondo del pozo, por que su densidad es más alta que el buffer. Este paso debe
manejarse cuidadosamente para evitar contaminación.
Se requiere un marcador de ADN para cada electroforesis. Se recomienda
alrededor de 5 µL de marcador de ADN. El marcador de peso molecular sirve
como referencia para saber el tamaño del producto de PCR.
Cuando todas las muestras sean cargadas, conecte la corriente de la caja del
gel antes de encenderla. Se recomienda un voltaje constante entre 100V- 150V
en la electroforesis (NO CORRA LA MUESTRA A MAS DE 150 VOLTS).
El tinte de carga del kit contiene 2 colorantes: EL azul de bromo fenol da un
color azul subido; el cyanol de xileno da un color azul suave. Cuando el azul
oscuro se aproxima de ½ a 2/3 del gel, detenga la electroforesis. Luego
remueva el gel de la caja, coloque el gel en un transiluminador UV para la
lectura del resultado final.
Para evitar contaminación, no use de nuevo el buffer de electroforesis, a menos
que se usen varios geles ese mismo día. Cuando termine la electroforesis, lave
la caja del gel con bastante agua.
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3. Preparación de GELRED para mezclarse con la agarosa para
electroforesis.
GelRed es una tinción fluorescente de ácidos nucleicos diseñada para
reemplazar al Bromuro de Etidio (BE) en la tinción de dsDNA, ssDNA o RNA en
geles de agarosa, poliacrilamida y geles prefabricados. Extremadamente
estable en el tiempo, no mutagénico ni citotóxico y seguro para el medio
ambiente, sin requerir modificaciones en los sistemas de foto documentación
tanto para la excitación como emisión.
Gel Red puede ser desechado directamente por el drenaje de agua o
reutilizado para posteriores tinciones. Compatible con todas las aplicaciones de
rutina post electroforesis, como digestión con enzimas de restricción, Southern
blot y clonamientos.
VENTAJAS
Mucho más seguro que el Bromuro de Etidio
El Test de Ames demuestra que el producto es no mutagénico y no
citotóxico.
Fácil eliminación
Este producto se puede eliminar a través del desagüe ya que ha pasado
todos los tests de seguridad ambiental.
Ultra sensible
Mucho más sensible que el Bromuro de Etidio y SYBR Safe.
Extremadamente estable
Disponible en agua, es estable a temperatura ambiente para largos
tiempos de almacenamiento, pudiéndose utilizar también en microondas.
Flexible para diferentes procedimientos
Se puede utilizar tanto para premarcado y post marcado de geles.
Simple de usar
Simple procedimiento de utilización.
Compatible con transiluminador ultravioleta estándar o con un lector de
geles con excitación con luz visible
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Geles de comparación de GELRED vs EtBr
GELRED
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EtBr
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VIII.
Diagnóstico
1. Los estándares y muestras positivas mostrarán los siguientes
patrones en el gel:
1
2
3
4
5
6
7
8
848 PB
630 PB
333 PB
2000COPIAS
200COPIAS
20COPIAS
C+1
C+2
C-
ddH2O
MPB
Carril 1: Plásmido de ADN estándar PvNV, 2000 copias/reacción
Carril 2: Plásmido de ADN estándar PvNV, 200 copias/reacción
Carril 3: Plásmido de ADN estándar PvNV, 20 copias/reacción
Carril 4: Muestra con infección severa por PvNV
Carril 5: Muestra con infección ligera por PvNV
Carril 6: Muestra negativa de PvNV
Carril 7: Control Negativo (tARN de Levadura ó ddH2O)
Carril 8: Marcador de peso molecular, 848 pb, 630 pb, 333 pb
2. Las muestras negativas se mostrarán solamente en una banda a
las 680 pb, lo cual es un producto de PCR utilizado como control
interno.
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3. Procedimiento de diagnóstico:
i. Bandas formadas a los 268 pb, 537 pb y arriba de los
848 pb: P(+) infección Severa PvNV, Carril 4.
ii. Bandas formadas a los 268 pb y 537 pb: P(+) Infección
ligera de PvNV, Carril 5.
iii. Banda formada solamente a las 680 pb: N(-)
4. Cada experimento requiere controles positivos y negativos. Si el
102 P(+) estándar no dio como resultado una banda a las 268 pb.
Puede deberse a una reacción errónea de PCR o a otras
posibilidades. Por otra parte, si el resultado del control negativo
muestra una banda a las 268 pb, significa que ha ocurrido
contaminación. Para más información, por favor diríjase a
solución de problemas en las siguientes páginas o contacte a
GeneReach.
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IX. Solución de problemas
Problema o síntoma
Posibles causas
1. GELRED Degradado
Banda tenue o ninguna
banda después de la
tinción
2. No prende la luz UV
3. Fondo demasiado
fuerte
4. El gel de agarosa es
demasiado grueso
El estándar positivo
muestra bandas
normales, pero no se
muestran las del
marcador molecular
El marcador fue
degradado o tiene baja
carga.
1. RT y/o PCR fallido
El marcador muestra
bandas normales, pero
P (+) no tiene banda.
Alta P (+) (103) muestra
banda, pero la baja
positiva no tiene banda.
2. La enzima no fue
agregada.
3. P(+) fue degradado.
1. P (+) fue degradado.
2. El estándar 104 fue
degradado.
3. Baja actividad de la
enzima.
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Recomendaciones
1. Preparar nuevo
gelred o extender el
tiempo de coloración
2. Checar el
transiluminador de
UV
3. Remojar el gel en
agua limpia a 4°C
por otros 30 minutos
4. Checar si el espesor
del gel es más de
0,8cm. Preparar un
gel más delgado y
ejecutar la
electroforesis.
Cambiar el marcador, o
incrementar el volumen
de carga.
1. Comprobar el registro
de preparación de la
mezcla de reactivos y el
perfil del ciclo de PCR.
2. Realizar una nueva
reacción.
3. Preparar nuevo P(+).
1. Preparar nuevos P (+)
2. Sustituir 104 estándar
3. Compruebe la fecha
de caducidad y
condiciones de
almacenamiento
de la enzima, o sustituir
enzima.
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El Control negativo (-)
muestra banda positiva
Control P (+) y N (-)
muestran banda normal,
pero la muestra
conocida infectada no
muestra banda.
1. Contaminación micro
pipeta.
2. Contaminación del
reactivo.
3. Contaminación en
Laboratorio.
1. Extracción de ARN
fallida.
2. Mala calidad de ARN
o concentración muy
alta de ADN.
3. Inhibidor de PCR.
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1. Desmontar la pipeta y
hacerle limpieza, se
recomienda el uso de
aerosoles libres de
punta. Se recomienda
utilizar una pipeta
diferente para el
procedimiento de PCR.
2. Realizar reacciones
con reactivos nuevos
una vez mas.
3. Consulte con Farming
Intelligene para la
limpieza del equipo.
1. Checar el
procedimiento de
extracción de
ARN.
2. Checar el rango
de OD 260/280,
normalmente esta
ración debe ser
de 1.6 a 1.8.
3. El pico estándar
de la reacción de
PCR 10³ P(+).
para un paralelo.
Si la primera es
con10³
mostrando una
banda normal,
entonces la
inhibición esta
fuera de lugar.
Si es con 10³ y
no tiene banda,
entonces hay
inhibición. Se
necesita preparar
otra extracción de
ARN.
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IX. Referencias
1. Tang Kathy F.J. et.al. (2007) Desarrollo de hibridación in situ y ensayo de
RT-PCR para la detección de un nodavirus (PvNV) que causa necrosis
muscular en Penaeus vannamei. Dis. Aquat. Org. 75:183-190.
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