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Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM MrNV
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Sistema de Detección y Prevención
IQ2000TM MrNV
Detección de Macrobrachium rosenbergii
nodavirus MrNV
Para uso exclusivo In-Vitro
Material incluido, no contagioso.
Instituto Tecnológico de Sonora
5 de Febrero No. 818 sur
Teléfono (644) 410-09-00 Ext. 2115, Apdo. 541
C.P. 85000 Ciudad Obregón, Sonora, México
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Contenido
I.
Introducción
II.
Componentes del sistema
III.
Equipo y reactivos requeridos
IV.
Limite de detección y sensibilidad
V.
Preparación de Muestra y extracción de ARN
1
Procedimiento para extracción de ARN
2
Dilución de ARN
VI.
Protocolo para reacción de amplificación
1
Preparación de reactivos
2
Condición de la reacción (Uni-IQ RT-PCR)
3
Procedimiento de reacción
VII.
Electroforesis
1
Preparación del gel de agarosa
2
Electroforesis
3
Colorante Gelred para tinción del gel de agarosa
VIII.
Diagnóstico
IX.
Solución de problemas
X.
Referencias
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I. Introducción
Camarón de agua dulce- Macrobrackium rosenbergii ha sido visto como una
especie importante para la industria de producción de camarón de granja
por su gran valor comercial. Aunque se ha considerado una especie
moderadamente resistente a las enfermedades cuando se compara al
camarón pendido (Nash citado. 1987), está también en grave peligro de
contraer el virus enfermedad de la cola blanca (WTD)
WTD fue observado y reportado por primera vez en las Indias Francesas
Occidentales(Arcier citado. 1999). Las señales típicas del WTD en PL
infectados es aletargamiento y músculos abdominales opacos. El índice de
mortalidad alcanzo el 100% de 2 a 3 días desde su primer aparición, en
camarones con músculos blancuzcos.
Los agentes causales de esta enfermedad son M. rosenbergii nodavirus
(MrNV) y un virus muy pequeño (XSV). Estudios de investigación
demuestran que MrNV juega un rol clave en WTD y que el XSV es un virus
satélite dependiente del del MrNV (Zhang citado. 2006). El virus puede ser
detectado casi por todos los órganos. El virus aun se ha presentado en los
ovarios que indica la posiblidad de transmisión vertical de WTD de los
criaderos de larva a PL. Siendo que M. rosenbergii tiene mucha mas baja
fecundidad de 20,000 a 30,000 (Vadher 2003), es aun mas prudente hacer
pruebas con hembras maduras para prevenir el virus WTD en etapa de
maternidad.
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Desde el primer reporte de WTD de las Indias Francesas Occidentales, se
han reportado después en Taiwan, La Republica China, en provincias como
Zhejiang,Jiangsu, Gungodong y Shangai y finalmente en la India. Una
primera investigación de Tailandia de MrNV y XSV revelo que MrNV en
Tailandia que estaba muy cercanamente relacionado pero no identico al
virus anteriormente reportado en las Indias francesas Occidentales y China
pero el virus de XSV era identico, (Yoganandhan citado. 2006)
Aunque MrNV y XSV no causaron mortalidad en camarón silvestre,
experimentos demuestran que dieron positivo en la mayoría de sus órganos
en P. Inducus, P. Japonicus y P. monodon (Sudhakaran citado. 2006). Por
lo tanto, el cultivo de P. monodon con M. rosenbergii o por rotación de
siembra con estas 2 especies no es recomendable.
Este sistema
ha sido adoptado del diseño de PCR anidado y tambien
heredo la dependencia, sensibilidad y experiencia del rango de los kits de
diagnostico de
detección de virus IQ 2000 tm para infecciones de
camarones y peces.
Su función única Semi-quantitativa provee información de los niveles de
infección que pueden ser utilizados para mayor investigación de MrNV.
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II. Componentes del Sistema
a. Solución de extracción de ARN (almacenar a 40C)
100 mL/frasco
b. Kit para amplificación especifica de secuencia MrNV (almacenar a -200C)
1.
Premezcla RT-PCR
4 viales
420 μL/vial
Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de MrNV
2. Premezcla de PCR Anidado
4 viales
840 μL/vial
Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de MrNV
3.
Plásmido Control P(+)
1 vial
100 μL/vial
Incluye: 104 copias/μL de plásmidos con una secuencia parcial de
MrNV
1 vial
500 μL/vial
5. IQ enzima ADN polimerasa (2U/μL) 1 vial
360 μL/vial
6.
1 vial
120 μL/vial
7. Tinte de carga 6X
1 vial
1500 μL/vial
8. Marcador de peso molecular
1 vial
100 μL/vial
4.
tRNA de levadura (40 ng/μL)
Mezcla de enzima RT
848 pb, 630 pb y 333 pb
9. DEPC ddH2O
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III. Equipo y reactivos requeridos
1. Termociclador con bloque para tubos de muestras de 0.2 mL
2. Centrífuga
3. Cámara de electroforesis y fuente de poder
4. Transiluminador UV
5. Vortex
6. Micropipeta
7. Cámara fotográfica
8. Horno de microondas
9. Guantes
10. Lentes o careta
11. Bata para laboratorio
12. Puntillas de distintas medidas para micropipetas
13. Cloroformo
14. Etanol al 75%
15. Colorante Gelred
16. Buffer de electroforesis TAE ó TBE
17. Agarosa
18. Balanza
19. ddH2O
20. Isopropanol (2-propanol)
21. Papel parafilm
22. Vaso de precipitado de 100 ml
23. Pistilos
24. Tubos para microcentrífuga de 1.5 y 0.2 ml
25. Refrigerador
26. Congelador
27. Campana para PCR
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28. Gabinete para extracción de DNA y RNA
IV. Limite de detección y sensibilidad
Este sistema de detección genera diferentes límites de detección y
niveles de sensibilidad de acuerdo a las diferentes fuentes de la muestra
sometida a prueba. La siguiente tabla lista algunas muestras comunes. Basado
en el conocimiento de la distribución viral en el camarón, se recomiendan
muestras de branquias y músculo para analizar camarones juveniles y adultos.
ESPECIMEN
CANTIDAD
DE LA
PRUEBA
Plásmido de
ADN MrNV
2 copias
RNA
transcrito in
vitro
20 copias
<PL 12
10 PL´s
20
500 copias/ PL
PL 12 a PL
20
Branquias
>PL 20 a 5
gr. de
camarón
Branquias
de camarón
de 5 gr. a
crías
Branquias
de crías
5 PL´s
20
1000 copias/PL
10 a 20
piezas
20
2000
copias/muestra
2 a 3 piezas
20
2000
copias/muestra
Media pieza
20
2000
copias/muestra
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LIMITE DE
EQUIVALENTE
DETECCIÓN
DE
(COPIAS/REACCION) SENSIBILIDAD
2 copias/ ul de
2
muestra de
plásmido
20 copias/µL
20
RNA transcrito
in vitro
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En base a la tabla anterior, los usuarios deben saber que una prueba “negativa”
indica que el espécimen no está infectado ó que el nivel de infección es mas
bajo que el límite de detección. Todos los resultados de prueba enlistados en la
tabla fueron probados de acuerdo a procedimientos estándar y reactivos
descritos en éste manual. No se garantizan resultados de detección con
extracciones de RNA mediante otros productos manufacturados.
V. Preparación de muestra y extracción de ARN
1. Procedimiento de extracción de RNA
a. Coloque la muestra en un tubo de 1.5 mL con 500 μl de solución de
extracción de RNA.
b. Macere
la muestra en el tubo con un pistilo desechable, deje a
temperatura ambiente por 5 min.
c. Agregue 100 μl de cloroformo y aplique vortex por 20 seg. Déjelo a
temperatura ambiente por 3 minutos, luego centrifugue a 12000 rpm
por 15 min.
d. Transfiera 200 μl del sobrenadante a un tubo nuevo conteniendo
200 μl de 2-propanol (Isopropanol).
e. Aplique un vortex breve, centrifugue a 12000 rpm por 10 minutos,
luego decante el isopropanol.
f. Lave el pellet con 500 μl de etanol al 75%, luego centrifugue por 5
minutos a 9000 rpm para recobrar el pellet de RNA, luego decante el
etanol y seque el pellet.
g. Disuelva el pellet con ddH2O DEPC.
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2. Disolución de RNA
La concentración de RNA es diferente, dependiendo de las distintas fuentes
de la muestra, por lo tanto la concentración de debe ser ajustada disolviendo el
pellet con el RNA en un volumen diferente de ddH2O DEPC.
Muestra
PL´s
Branquias
Ojo del reproductor
Post larvas
Pleopodo o periopodo
Tejido de jaiba, ostión, plancton,
peces,
ó pequeños crustáceos
Branquia
Fondo de estanque
Agua de estanque
Volumen
500 μl
200 μl
100 µl
200 µl
200 µl
200 µl
50 µl
20 µl
10 µl
VI. Protocolo de amplificación
Las siguientes condiciones de amplificación aplican para tubos de
microcentrífuga de 0.2 mL.
1. Preparación de reactivos para la reacción de RT-PCR
a. Mezcla de reacción RT-PCR: 8 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla RT-PCR
7.0 µl
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/µL)
0.5 µl
Mezcla de Enzima RT
0.5 µl
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2. Procedimiento de reacción
a. Pipetee 8 µl de mezcla de reacción RT-PCR en cada tubo de
reacción de 0.2 mL con su respectiva etiqueta.
b. Agregue 2 µl de extracción de RNA de la muestra ó estándar* en
cada mezcla de reacción.
c. Realice la reacción RT-PCR
3. Condiciones de reacción (Uni-IQ Descripción de RT-PCR):
Descripción de la reacción RT-PCR:
42ºC – 30 min.; 94 ºC – 2 min.; Enseguida
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 15 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
4. Preparación de reactivos para la reacción de PCR anidado
Mezcla de reacción de PCR anidado : 15 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla de PCR anidado
14 µL
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/ µL)
1 µL
5. Procedimiento de reacción:
Agregue 15 µL de mezcla de reacción PCR anidado a cada tubo,
después de haber completado la reacción RT-PCR.
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6. Condiciones de Reacción de PCR anidado.
a. Descripción de reacción de PCR anidado:
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 30 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
b. Realice la reacción de PCR anidado.
c.
Después de haber terminado la reacción anidada, la muestra está lista
para la electroforesis.

Por cada experimento, un estándar de 10 copias/µL es muy
recomendable para monitorear la sensibilidad de las reacciones.
También recomendamos tRNA de levadura para ser usado como
diluyente para estándares positivos. Bajo ésta condición, el estándar
puede ser mantenido a -20ºC por una semana.
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VII.
Electroforesis
1. Preparación del gel de agarosa
Se utiliza el
buffer de electroforesis TAE. Luego, diluya el buffer a una
concentración 0.5 X para procesar la electroforesis y producir el gel de
agarosa. Note que el buffer para procesar la electroforesis y producir el gel
debe ser del mismo.
Se recomienda un gel de agarosa al 2% para la electroforesis. Para preparar el
gel al 2%, agregue 2 gr. de agarosa a una botella o frasco de boca ancha con
100 mL de buffer TAE 0.5 X.
Caliente la mezcla hasta volverse hialina sin ninguna partícula de gel. El
calentamiento se puede hacer usando un mechero de gas ó placa de
calentamiento, incluso puede usarse un horno de microondas. Para evitar el
derramamiento, se recomienda un contenedor más grande (el doble del
volumen de la solución).
Dejar enfriar un poco el gel y lentamente vacíe 40 ml del gel en un vaso de
precipitado y agregue 1 µl de GELRED, después vaciar en el molde de la
cámara de electrofóresis y dejar solidificar. El volumen del gel varía
dependiendo del tamaño de la caja. La altura del gel de agarosa solamente
tiene que estar por encima del fondo del peine del gel de 0.3 a 0.5 cm., y se
sugiere que el ancho sea menor de 0.8 cm.
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Cuidadosamente remueva el peine plástico y sujetadores de ambos lados de la
caja, cuando el gel esté completamente coagulado. El gel está ya listo para
electroforesis. El gel terminado no debe ser expuesto a temperatura ambiente
por más de 4 horas.
2. Electroforesis
Coloque el gel de agarosa coagulado dentro de la caja. Durante la
electroforesis, el ADN molecular migrará hacia el polo (+), ya que el ADN está
cargado negativamente.
Agregue buffer de electroforesis a 0.5X dentro de la caja, hasta que cubra
ligeramente el gel.
Cargue 8 µL de la mezcla de producto de PCR y 2 µl de colorante de carga a
cada pozo la mezcla la puede hacer en papel parafilm. La mezcla se irá al
fondo del pozo, por que su densidad es más alta que el buffer. Este paso debe
manejarse cuidadosamente para evitar contaminación.
Se requiere un marcador de ADN para cada electroforesis. Se recomienda
alrededor de 5 µL de marcador de ADN. El marcador de peso molecular sirve
como referencia para saber el tamaño del producto de PCR.
Cuando todas las muestras sean cargadas, conecte la corriente de la caja del
gel antes de encenderla. Se recomienda un voltaje constante entre 100V- 150V
en la electroforesis (NO CORRA LA MUESTRA A MAS DE 150 VOLTS).
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El tinte de carga del kit contiene 2 colorantes: EL azul de bromo fenol da un
color azul subido; el cyanol de xileno da un color azul suave. Cuando el azul
oscuro se aproxima de ½ a 2/3 del gel, detenga la electroforesis. Luego
remueva el gel de la caja, coloque el gel en un transiluminador UV para la
lectura del resultado final.
Para evitar contaminación, no use de nuevo el buffer de electroforesis, a menos
que se usen varios geles ese mismo día. Cuando termine la electroforesis, lave
la caja del gel con bastante agua.
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3. Preparación de GELRED para mezclarse con la agarosa para
electroforesis.
GelRed es una tinción fluorescente de ácidos nucleicos diseñada para
reemplazar al Bromuro de Etidio (BE) en la tinción de dsDNA, ssDNA o RNA en
geles de agarosa, poliacrilamida y geles prefabricados. Extremadamente
estable en el tiempo, no mutagénico ni citotóxico y seguro para el medio
ambiente, sin requerir modificaciones en los sistemas de foto documentación
tanto para la excitación como emisión.
Gel Red puede ser desechado directamente por el drenaje de agua o
reutilizado para posteriores tinciones. Compatible con todas las aplicaciones de
rutina post electroforesis, como digestión con enzimas de restricción, Southern
blot y clonamientos.
VENTAJAS
Mucho más seguro que el Bromuro de Etidio
El Test de Ames demuestra que el producto es no mutagénico y no
citotóxico.
Fácil eliminación
Este producto se puede eliminar a través del desagüe ya que ha pasado
todos los tests de seguridad ambiental.
Ultra sensible
Mucho más sensible que el Bromuro de Etidio y SYBR Safe.
Extremadamente estable
Disponible en agua, es estable a temperatura ambiente para largos
tiempos de almacenamiento, pudiéndose utilizar también en microondas.
Flexible para diferentes procedimientos.
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Se puede utilizar tanto para premarcado y post marcado de geles.
Simple de usar
Simple procedimiento de utilización.
Compatible con transiluminador ultravioleta estándar o con un lector de
geles con excitación con luz visible
Geles de comparación de GELRED vs EtBr
GELRED
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EtBr
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VIII. Diagnóstico
1.
Los estándares y muestras positivas mostrarán los siguientes patrones en
el gel:
1
2
3
4
5
6
7
8
848 PB
630 PB
333 PB
2000COPIAS
200COPIAS
20COPIAS
ddH2O
M +1
M+2
M-
MPB
Carril 1: Plásmido de ADN estándar MrNV, 2000 copias/reacción
Carril 2: Plásmido de ADN estándar MrNV, 200 copias/reacción
Carril 3: Plásmido de ADN estándar MrNV, 20 copias/reacción
Carril 4: Control Negativo (tARN de Levadura ó ddH2O)
Carril 5: Muestra con infección severa por MrNV
Carril 6: Muestra con infección ligera por MrNV
Carril 7: Muestra negativa de MrNV
Carril 8: Marcador de peso molecular, 848 pb, 630 pb, 333 pb
2. Las muestras negativas mostrarán solamente una banda a las 680 pb, el
cual es un producto de un control interno, mARN para ß-actina de
camarón peneido.
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3. Procedimiento de diagnóstico:
a. Banda formada a las 221 pb, 400 pb y arriba de los 848 pb: Infección
Severa MrNV P (+)
b. Banda formada solo a las 221 y 636 pb: Infección Ligera MrNV P (+)
c. Banda formada solamente a 636 pb: N(-)
4. Cada experimento requiere controles positivos y negativos. Si el control
de ADN de plásmido de 102 no produjo una banda a 221 pb, significa
que la reacción de PCR ha fallado ó la sensibilidad del sistema no está
por arriba del estándar. Por otro lado, si el resultado del control negativo
muestra una banda a 221 pb, significa que se ha producido una
contaminación de la muestra. Para obtener más información, consulte
Solución de problemas en las siguientes páginas o contacto GeneReach
biotecnología Corp.
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IX. Solución de problemas
Problema o síntoma
Posibles causas
1. GELRED Degradado
Banda tenue o ninguna
banda después de la
tinción
2. No prende la luz UV
3. Fondo demasiado
fuerte
4. El gel de agarosa es
demasiado grueso
El estándar positivo
muestra bandas
normales, pero no se
muestran las del
marcador molecular
El marcador fue
degradado o tiene baja
carga.
1. RT y/o PCR fallido
El marcador muestra
bandas normales, pero
P (+) no tiene banda.
Alta P (+) (103) muestra
banda, pero la baja
positiva no tiene banda.
2. La enzima no fue
agregada.
3. P(+) fue degradado.
1. P (+) fue degradado.
2. El estándar 104 fue
degradado.
3. Baja actividad de la
enzima.
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Recomendaciones
1. Preparar nuevo
gelred o extender el
tiempo de coloración
2. Checar el
transiluminador de
UV
3. Remojar el gel en
agua limpia a 4°C
por otros 30 minutos
4. Checar si el espesor
del gel es más de
0,8cm. Preparar un
gel más delgado y
ejecutar la
electroforesis.
Cambiar el marcador, o
incrementar el volumen
de carga.
1. Comprobar el registro
de preparación de la
mezcla de reactivos y el
perfil del ciclo de PCR.
2. Realizar una nueva
reacción.
3. Preparar nuevo P(+).
1. Preparar nuevos P (+)
2. Sustituir 104 estándar
3. Compruebe la fecha
de caducidad y
condiciones de
almacenamiento
de la enzima, o sustituir
enzima.
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El Control negativo (-)
muestra banda positiva
Control P (+) y N (-)
muestran banda normal,
pero la muestra
conocida infectada no
muestra banda.
1. Contaminación micro
pipeta.
2. Contaminación del
reactivo.
3. Contaminación en
Laboratorio.
1. Extracción de ARN
fallida.
2. Mala calidad de ARN
o concentración muy
alta de ADN.
3. Inhibidor de PCR.
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Alta Dirección
1. Desmontar la pipeta y
hacerle limpieza, se
recomienda el uso de
aerosoles libres de
punta. Se recomienda
utilizar una pipeta
diferente para el
procedimiento de PCR.
2. Realizar reacciones
con reactivos nuevos
una vez mas.
3. Consulte con Farming
Intelligene para la
limpieza del equipo.
1.Checar el
procedimiento de
extracción de ARN.
2.Checar el rango de
OD 260/280,
normalmente esta ración
debe ser de 1.6 a 1.8.
3.El pico estándar de la
reacción de PCR 10³
P(+) para un paralelo.
Si la primera es con10³
mostrando una banda
normal, entonces la
inhibición esta fuera de
lugar. Si es con 10³ y
no tiene banda,
entonces hay inhibición.
Se necesita preparar
otra extracción de ARN.
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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM MrNV
LASA-POP-PD-09-0
00
X. Referencias:
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hatchery-reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium
rosenbergii. Dis. Aquat. Org. 38:177-181.
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Macrobrachium rosenbergii de Man, Cultured in Thailand. J. of Fish. Dis.
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3. Sudhakaran R. et al. (2006) Experimental transmission of Macrobrachium
rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) in three species of
marine shrimp (Penaeus indicus, Penaeus japonicus and Penaeus monodon)
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4. Vadher K.H. (2003) Effect of eyestalk ablation on the rematuration of female
Macrobrachium rosenbergii (De Man) in captivity. Master of Fisheries Science
(MFSc) thesis, Faculty of Fisheries, Kerala Agricultural University, Kerala, India,
124 pp.
5. Yoganandhan K. et al. (2006) White tail disease of the giant freshwater
prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand. Dis. Aquat. Org. 69:255-258.
6. Zhang et al. (2006) Quantitative relationship of two viruses (MrNV and XSV)
in white-tail disease of Macrobrachium rosenbergii. Dis. Aquat. Org. 71:11-17.
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