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V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
VI Jornadas Científicas de Biomedicina y
Biotecnología Molecular
Clave: 474239
PERFIL DE EXPRESIÓN DE LAS ISOFORMAS L Y S DEL GEN
MCL-1 EN MUESTRAS DE TUMORES CON CÁNCER DE MAMA
ABRAHAM PEDROZA T., EVERARDO CURIEL Q., DAVID FRAGOSO F.,
NORMAND GARCIA H., DIEGO ARENAS A.
DIRECCIÓN DE LOS AUTORES
Laboratorio de Genética Humana, UIM Genética Humana, CMN SXXI, IMSS.
CORREO ELECTRÓNICO
abraneet@hotmail.com
Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F.
Tel. y Fax: 5623 3088 email: colegioibq@hotmail.com, colegioibq@yahoo.com.mx
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INTRODUCCIÓN
EL CÁNCER
El cáncer se desarrolla cuando una célula en cualquier tejido escapa a los procesos
normales de control y se multiplica rápidamente, eventualmente superando todas las
defensas del cuerpo. Desde el punto de vista médico el cáncer es un conjunto de síntomas
de pronóstico y tratamiento diferentes, que depende principalmente de la localización
anatómica en la que se encuentre y del tipo celular o histológico del que proceda. [3].
El cáncer es una enfermedad genética en donde diversos factores ambientales favorecen su
manifestación (ver figura 1), se conocen la mayoría de los factores de riesgo, el principal
factor es la edad o envejecimiento, ya que dos terceras partes de todos los cánceres ocurren
en personas mayores de 65 años; le siguen el tabaquismo, la dieta, localización geográfica,
paridad, raza, ejercicio físico, la exposición solar, y estilos de vida poco saludables. Sólo un
pequeño porcentaje de los cánceres son una enfermedad hereditaria, debido a que el
mecanismo de producción del cáncer subyace en los genes [1,2].
El cáncer ha sido llamado “el mal de los genes”, en las pasadas dos décadas se ha
observado que es producido por errores en la programación génica normal que guía la
multiplicación, especialización y muerte celular. La teoría del “daño múltiple” sugiere que,
las células acumulan daño aleatorio en sus genes (mutaciones).
La adquisición progresiva de cambios genéticos específicos afecta rutas celulares tales
como: regulación de la transducción de señales, diferenciación celular, crecimiento,
apoptosis, sobrevivencia, reparación del DNA, progresión del ciclo celular, angiogénesis o
la pérdida de adhesión celular (invasión de tejido y metástasis) [7]
Se conocen algunos genes y sus productos involucrados en diversos procesos del desarrollo
neoplásico, por ejemplo: en proliferación (PCNA), oncogenes (Fos, Ras, Myc), supresores
(P53, Rb, BRCA1, BRCA2, WT1, WT2, FOXP3, ATM), crecimiento (EGF), degradación
de la matriz extracelular (colagenasas, MMP-12, MMP-19), angiogénesis (VEGF), daño al
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DNA (MDM2, P53), reparación (MSH2, MSH6) o apoptosis (Bax, Bad, Bid, Bcl-2,
Fas)[9].
EL CÁNCER DE MAMA EN MÉXICO
El cáncer mamario representa un desafío en materia de salud pública en nuestro país,
porque constituye la segunda causa de defunción por enfermedad neoplásica en la
población femenina mayor de 25 años, después del cáncer de cérvix. Según datos
proporcionados por INEGI, la mortalidad por cáncer mamario en México, mantiene una
tendencia ascendente con algunas variaciones en los últimos registros. En 2002 se
notificaron 3,822 muertes por esta causa, lo que corresponde a una tasa de mortalidad de
15.18 defunciones por 100 mil mujeres de 25 años y más. Esta tasa representa la cifra más
alta jamás alcanzada por el país y significa que diariamente mueren un poco más de 10
mexicanas por cáncer mamario. La tasa de mortalidad apenas se elevó en estos últimos 10
años, de 14.35 en 1993 a 15.18 en 2002. Esta pequeña variación sin embargo representa
1,139 muertes más en el año 2002, comparado con el número de fallecimientos que se
registraron en 1993 (INEGI 2005). Según datos preliminares del registro histopatológico, el
número de nuevos casos de cáncer de mama que se presentaron en el año 2002 fue de
11,242, una cantidad excepcional si se compara con años anteriores en los que la cifra de 10
mil nuevos casos anuales, no se sobrepasaba; ello significó que en las instituciones del
Sistema Nacional de Salud, del país, en ese año 2002, se hayan diagnosticado más de 50
casos de cáncer mamario, en cada día laborable y, lo más dramático fue el que la gran
mayoría de estos casos se diagnosticaron en etapas avanzadas de la enfermedad. El estudio
de esta neoplasia se ha dificultado debido a la gran heterogeneidad histológica, molecular,
fenotípica y clínica que presenta. La incapacidad de clasificar los tumores en grupos
clínicos y biológicos relativamente homogéneos, obstaculiza el diagnóstico y la búsqueda
de terapias efectivas. La amplia diversidad de tumores, aún los que derivan del mismo
tejido, presentan un reto para un diagnóstico temprano y acertado. La identificación y el
entendimiento de los genes involucrados en esta patología, sus interacciones génicas, las
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alteraciones bioquímicas y genéticas resultan de trascendental importancia para el
tratamiento posterior de los pacientes en México y en mundo. El cáncer intraductal es el
tipo de cáncer mamario más frecuente asociado al desarrollo de esta neoplasia en forma
esporádica. Se han descrito otros factores asociados al desarrollo de esta neoplasia en forma
esporádica, que es la forma más común de este cáncer. Un factor digno de consideración
son los anticonceptivos hormonales; algunas investigaciones sugieren que hay una
conexión entre el uso de los anticonceptivos y un ligero aumento en el riesgo de desarrollar
cáncer de mama. Otras causas asociadas al cáncer mamario esporádico descritas son:
nuliparidad, menarca prematura, edad avanzada, antecedentes familiares de cáncer de
mama y mutaciones en los genes P53, ATM (ataxia-telangiectasia), Myc, Her2/neu,
progesterona, ER alpha y ER [16-18]. Dos genes principales han sido identificados para
susceptibilidad de cáncer de mama BRCA1 y BRCA2 [11-13]
Figura 1. Desarrollo del proceso neoplásico. Una vez que la célula a perdido el control sobre los distintos
procesos de control y proliferación, hallan sido causados por factores heredados o ambientales, se
desencadenan una serie de eventos que conducen a la formación de células neoplásicas.
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APOPTOSIS
La apoptosis es un fenómeno biológico fundamental, permanente, dinámico e interactivo.
Existen mecanismos pro o anti apoptoticos, regulados genéticamente, que actúan en forma
activa (pues consumen energía) y equilibrada. Como función necesaria para evitar la
sobreproducción celular era sospechada por los biólogos; pero es un proceso ordenado y
"silencioso" que no produce reacción tisular y por ello difícil de captar. En 1972, Kerr y
col., estudiando organelos en células neoplásicas, detectaron que muchas células
desaparecían en los cultivos. La apoptosis puede estar frenada, en equilibrio o estimulada.
Por ejemplo, está frenada durante el desarrollo de espermatogonias, en las criptas de las
glándulas intestinales (que es un epitelio de crecimiento rápido) y durante la lactancia en su
período preparatorio, en que el tejido mamario aumenta su masa celular. Está en equilibrio
respecto de la mitosis en los tejidos adultos sanos. Se ha observado en epitelios adultos
normales del hígado, mama, corteza suprarrenal y tubo digestivo. Es muy significativo su
rol homeostático en la médula ósea, donde debe destruir en forma permanente, la mitad de
una inmensa cantidad de células que solo en leucocitos significa 5 x 10 elevado a 11, cada
24 Hrs. Dos formas de muerte celular son habituales en el organismo: necrosis y apoptosis
(ver figura 2). Las características morfológicas de ambas, permiten, en la mayoría de los
tejidos establecer claras diferencias. En la necrosis se observan numerosas células vecinas
sometidas a este proceso, cubriendo una extensión variable con desintegración. La
destrucción de la membrana celular permite el escape al exterior de elementos tóxicos que
provocan un proceso inflamatorio que tendrá efecto nocivo en el organismo, según la
extensión del proceso. El material cromatínico sufre una dispersión irregular. Las causas
son agentes tóxicos, traumáticos e hipóxicos; siempre patológicos.
En la apoptosis el proceso afecta a determinadas células, no necesariamente contiguas y no
a todas en un área tisular. La membrana celular no se destruye, lo que impide el escape al
espacio extracelular de su contenido, resultando un proceso "silencioso", sin inflamación.
En el citoplasma se produce granulación fina, con conservación de algunos organelos, en
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especial las mitocondrias que tienen un rol interactivo importante. A nivel nuclear la
cromatina se condensa agrupada en varios sectores formando cuerpos apoptoticos. La
membrana celular se recoge sobre las eminencias globuliformes que forman los elementos
deteriorados del citoplasma y núcleo. Finalmente, fagocitos captan la célula en su totalidad
impidiendo en una acción impecable, que se produzca alarma en el resto del tejido. Se ha
demostrado, al menos en tejidos epiteliales, que si algo de material escapa a la acción de los
fagocitos, es captado por células vecinas. La participación de células vecinas en este
proceso se manifiesta además por la capacidad de éstas de enviar señales moleculares a la
célula que debe morir, como mecanismo complementario al que desarrolla la célula misma
cuando se determina molecularmente su autodestrucción. El proceso de apoptosis demora
entre 30 y 60 minutos en células en cultivo. Uno de los más lentos se produce en células
hepáticas empleando como promedio 3 horas.
Figura 2. Apoptosis contra necrosis. Las características morfológicas de cada proceso permite establecer
marcadas entre estos dos tipos de muerte celular.
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El GEN MCL-1
El gen Mcl-1 es un gen que regula la muerte celular programada o apoptosis. El gen Mcl-1
es miembro de la familia Bcl-2. Bcl-2 es una familia de proteínas formada por alrededor de
25 miembros que regulan procesos de permeabilización mitocondrial y constituyen un
punto clave en la vía intrínseca de apoptosis celular. Su nombre deriva de la proteína
fundadora, el proto-oncogén Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), segundo miembro de un grupo de
proteínas inicialmente descrito en estudios de la translocación recíproca entre los
cromosomas 14 y 18 observada en linfomas foliculares. A diferencia de otros oncogenes
estudiados hasta la fecha, Bcl-2 no estaba implicado en el control de la proliferación celular
sino en el bloqueo de la muerte celular, más específicamente de los procesos de contracción
citoplasmática, condensación nuclear, desorganización de la membrana plasmática y
ruptura endonucleolítica del ADN. A su vez, por su localización mitocondrial, fue un
primer indicador de la importancia de este orgánulo en los procesos de apoptosis.
Siguientes investigaciones demostraron la existencia de dos subfamilias homólogas proapoptóticas, Bax y BH3. Bax fue el primer homólogo identificado por su interacción con
Bcl-2: ratones deficientes en Bax presentaban una expansión selectiva de poblaciones
celulares y la relación Bcl-2/Bax se descubrió clave en la susceptibilidad a apoptosis por la
vía intrínseca.
Subfamilia Bcl-2 (anti-apoptótica): Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, MCL-1
Subfamilia Bax (pro-apoptótica): Bax, Bak, Bok
Subfamilia BH3 (pro-apoptótica): Bad, Bid, Bik, Blk, BimL
Estas subfamilias vienen definidas en parte por la homología con cuatro regiones
denominadas dominios de homología Bcl-2 BH. La subfamilia anti-apoptótica presenta una
conservación de los 4 dominios y estudios con Bcl-W permitieron determinar que los
dominios BH1, BH2 y BH3 eran los responsables de formar una región hidrofóbica de
interacción con los dominios BH3 de las pro-apoptóticas, produciendo su inhibición. Los
miembros de la subfamilia Bax presentan dominios BH1-3 por lo que también se les conoce
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como subfamilia “multidominio”, en contraposición con la subfamilia BH3 que sólo
presenta homología en el mínimo dominio de muerte celular, la hélice anfipática BH3.
El gen Mcl-1 se encuentra localizado en el cromosoma 21.1q y esta codificado por 3
exones. Mediante un empalme alternativo se presentan dos mRNAs distintos que codifican
para MCL-1L y MCL-1S (ver figura 4).
Figura 3. Mapa estructural del gen Mcl-1. La isoforma L del gen contiene a los exones del 1 - 3 y la
isoforma S no contiene al exon numero 2. Se conoce que la isoforma L que contiene al exon
numero 2 puede ser hidrolizada por las caspasas dando como resultado una proteína antiapoptotica
capaz de antagonizar la accion de MCL-1 S que no contiene al exon numero 2 y que promueve la
muerte celular programada.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Origen de las muestras: Las muestras tumorales fueron obtenidas del Hospital de Oncología
del Centro Medico Nacional SXXI, diagnosticados como cáncer de mama, vírgenes a
tratamiento. Los tejidos se almacenaron a -70 ºC hasta el momento de ser extraídos los
ácidos nucleídos.
Se aisló el RNA total de cada tumor. La extracción del RNA se realizó mediante el kit de
aislamiento mirVana kit isolation. Se verificó la integridad de los RNA en geles de agarosa
al 1.5 %. Se cuantificó el RNA obtenido con la ayuda de un Nanodrop para una posterior
RT-PCR.
La obtención de cDNA se realizó con Oligo dT y transcriptasa reversa M-MLV.
Para el PCR se diseñaron oligonucleótidos específicos para cada isoforma con la ayuda del
programa Oligo V.4.1, utilizando las secuencias reportadas en el “GeneBank” cuyos
números de acceso son: NM 021960 y NM 182763. Los productos amplificados se
analizaron en geles de agarosa al 1%. Se verificó el tamaño de los productos con un
marcador de peso molecular de 50 pb.
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RESULTADOS
Se han procesado hasta el momento 10 muestras de adenocarcinomas mamarios. Se
corroboraron los valores de cuantificación de los RNA´s por duplicado. Se obtuvieron las
siguientes secuencias de oligonucleótidos para cada isoforma:
5´ TGGAGTTGGTCGGGGAATCT 3´ y 5´ AGCCAGTCCCGTTTTGTCCT 3´ para la
isoforma L;
5´ TGGAGTTGGTCGGGGAATCT 3´ y 5´GCAAAAGCCAGCAGCACATT 3´ para la
isoforma S. Se utilizó el gen HPRT como control de los ensayos de PCR. En 8 de las
muestras procesadas se ha podido identificar al menos una de las dos isoformas del gen
Mcl-1 o ambas. En 2 de las muestras procesadas no se encontró presente ninguna de las
isoformas del gen. El nivel de expresión de las isoformas aun no sea corroborado por
qPCR.
Figura 4. Gel de agarosa al 1.8 %. Carril 1 marcador de peso molecular de 100 pb, carril 2 isoforma S del
gen Mcl-1 271 pb, carril 3 isoforma L del gen Mcl-1 350 pb., carril 4 gen HPRT 450pb.
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DISCUSIÓN
Se sabe que el gen Mcl-1 participa ampliamente en el proceso de apoptosis, regulando la
cascada de señalización que culmina en la expulsión del citocromo C de la mitocondria
desencadenando la muerte de la célula en cuestión. El gen mediante un empalme alternativo
es capaz de producir dos isoformas con funcionamiento opuesto, una de ellas tiene una
función pro-apoptotica (isoforma S) mientras que la otra se comporta de manera opuesta
impidiendo que se lleve acabo la muerte celular (isoforma L). Este comportamiento en
particular es decisivo en la vida de las células que pudieran tener daño en su DNA o
mutaciones en los genes que participan conjuntamente con Mcl-1 en el control de la
apoptosis, permitiendo la muerte o supervivencia de la célula. Si una célula con daño en su
DNA o con mutaciones en los genes de control de proliferación celular evita por cualquier
vía intrínseca o extrínseca la apoptosis, se empezara a desarrollar una extirpe celular con
malignidad y en las subsecuentes divisiones celulares se heredaran las mutaciones y el daño
al DNA empezándose a desarrollar la tumorigénesis (inicio de la neoplasia). Esencialmente
un perfil de expresión de las isoformas pro-apoptotica (S) y anti-apoptotica (L) del gen
Mcl-1 nos permitiría sospechar del inicio de una tumorigénesis en pacientes
comprometidos a una neoplasia hereditaria. Los datos encontrados en las muestras
procesadas hasta el momento no nos permiten correlacionar el avance de la neoplasia con el
grado de expresión de cada una de las isoformas, mas sin embargo nos permiten relacionar
la presencia de la isoforma anti-apoptotica con el cáncer diagnosticado en las muestras.
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CONCLUSIONES
Las isoformas del gen Mcl-1 participan extensamente en el inicio del proceso apoptotico de
las células.
El avance de la mayoría de las neoplasias esta mediado por un conjunto de genes
involucrados en el control de la proliferación celular y la evasión o no de la apoptosis.
El gen Mcl-1 mediante un empalme alternativo es capaz de producir dos RNA’s de distinta
longitud que codifican para dos proteínas con actividad antagónica; una que promueve la
apoptosis y una que la reprime.
El producto más pequeño del empalme diferencial del gen Mcl-1 (la isoforma S) se conoce
que tiene un carácter pro-apoptotico en distintas líneas celulares humanas.
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